茍曉紅 袁 晶

癌癥是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致死亡的主要原因之一，其中，卵巢癌是女性生殖細(xì)胞腫瘤中病死率最高的腫瘤。2019年的癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，卵巢癌新病例數(shù)約22240例，死亡人數(shù)約14170例。超過70%的卵巢癌直到疾病進(jìn)展到Ⅲ或Ⅳ期才被診斷出來，近年來研究提示，卵巢癌5年生存率僅為47.4%[1～3]。卡鉑和紫杉烷類藥物的聯(lián)合應(yīng)用一直是卵巢癌術(shù)后主要的化療方案[4]。然而，腫瘤藥物的耐藥性及毒性作用一直是腫瘤治療領(lǐng)域的難點問題，天然藥用植物因其安全性、有效性及即時獲取性受到大眾關(guān)注。大蒜素是植物大蒜的有機(jī)硫化物，主要從新鮮壓碎的大蒜中提取，為大蒜主要抗腫瘤活性成分[5]。有證據(jù)顯示，大蒜及其硫化物可以抑制腫瘤生長，包括肺癌、結(jié)腸癌、胃癌、宮頸癌、膽管癌、食管癌等[6～11]。但是目前關(guān)于大蒜素對不同類型卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及潛在的機(jī)制尚不清楚。本研究以人卵巢癌普通型HO-8910細(xì)胞和高侵襲型HO-8910PM細(xì)胞株為材料，探討大蒜素對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡機(jī)制，以及不同類型卵巢癌細(xì)胞效果差異。

材料與方法

1.細(xì)胞與藥物：人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910和人高侵襲卵巢癌細(xì)胞系HO-8910PM購自中科院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞庫。大蒜素注射液：加入10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，制成工作液，-20℃保存。細(xì)胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液;5%CO2、37℃、飽和濕度。

2. 主要試劑：RPMI-1640(美國Thermo公司)；胰蛋白酶(上海生物工程股份有限公司)；小牛血清(耐肯博國際生物有限公司)；PI/Hochest33342熒光染色劑(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；caspase-3活性檢測試劑盒(上海貝博生物試劑有限公司)；細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；磷酸鹽緩沖液(PBS緩沖液)；0.25%胰蛋白酶；100×青霉素/鏈霉素儲存液(雙抗)；細(xì)胞凍存液[含20%FBS、10%二甲基亞砜(DMSO)和70% RPMI-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)液，保存于4℃]；SDS-PAGE電泳所用溶液(美國Sigma公司)。

3.主要儀器和設(shè)備：細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25cm2)、細(xì)胞培養(yǎng)皿及12孔、24孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)；生物安全柜(蘇州凈化儀器廠)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱 (上海Heal Force 力康公司)；臺式高速離心機(jī)(德國 Hermle公司)；液氮容器(成都金鳳液氮容器有限公司)；熒光顯微鏡 (日本Olympus公司)；超凈工作臺(蘇州凈化儀器廠)。

4.細(xì)胞培養(yǎng)：人卵巢癌HO-8910和高侵襲型HO-8910PM細(xì)胞在含有10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中37℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時用0.25%胰酶消化進(jìn)行傳代，傳代比例為1∶3；加入新鮮培養(yǎng)基4ml制成細(xì)胞懸液，取10μl懸液加入90μl臺盼藍(lán)進(jìn)行活細(xì)胞計數(shù)，反復(fù)計數(shù)3次，按下列公式計算：活細(xì)胞數(shù)=4個象限活細(xì)胞總數(shù)/4×104稀釋倍數(shù)(10倍)。并用臺盼藍(lán)染色法檢測復(fù)蘇細(xì)胞活性，用細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞，根據(jù)下列公式得出細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率(%)=未著色細(xì)胞/總計細(xì)胞數(shù)×100%。

5.MTT法檢測細(xì)胞活性：取對數(shù)生長期的HO-8910、HO-8910PM單層細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中備用。將細(xì)胞懸液接種于96孔板內(nèi)，每孔加入密度為5×103個/孔的細(xì)胞懸液200μl，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以不同濃度的大蒜素干預(yù)細(xì)胞24h后，每孔加入20μl的MTT(5mg/ml)，培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4h后終止培養(yǎng)。棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200μl二甲基亞砜，振蕩10min。用酶標(biāo)儀在570nm處測定吸光度(A)值，計算細(xì)胞增殖率(%)=A處理組/A對照組×100%。

6.集落形成實驗：將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每皿400個細(xì)胞的梯度密度分別接種含5ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中；加入大蒜素，置37℃、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)8天，棄去上清液，PBS浸洗2次，加純甲醇固定15min。然后去固定液，加適量蘇木精染色液染5min，在自來水中返藍(lán)。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)>50個細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。集落抑制率(%)=(1-實驗組集落形成率/對照組集落形成率)×100%；集落形成率(%)=集落數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

7.PI/Hoechest 33342熒光雙染色：取處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液，離心，棄上清，用 1ml全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，給予不同濃度的大蒜素，分別培養(yǎng)4、8、12h，加入 Hoechest 33342，終濃度為1μg/ml，37℃孵育7～10min。加入1ml PI染液，4℃避光染色15min，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

8.caspase-3活性檢測：培養(yǎng)收集細(xì)胞后，PBS洗滌2次，按每2×105細(xì)胞加入100μl裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min。4℃離心裂解10～15min，蛋白定量后，取上清液10μl加檢測緩沖液90μl，再加入10μl的Ac-DEVD-pNA，在37℃下避光反應(yīng)過夜，測定A405nm的吸光度值，根據(jù)凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞的吸光度值與空白對照細(xì)胞的吸光度值的比值，計算caspase-3的相對活性。

9.Western blot法檢測蛋白表達(dá)：取對數(shù)生長期細(xì)胞，PBS洗2次，加入預(yù)冷的細(xì)胞裂解液，超聲后4℃放置15min，4℃15000r/min離心10min，BCA法測定蛋白濃度，取樣品上清液提取總蛋白，測蛋白濃度，取等量總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂奶室溫封閉1h，分別加入PARP、caspase-3，室溫孵育2h，洗膜后加入IgG抗體，室溫反應(yīng)1h，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，以相應(yīng)蛋白條帶的平均吸光度值與β-actin蛋白平均吸光度值的比值表示蛋白的表達(dá)水平。

結(jié) 果

1.大蒜素對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響:為了確定大蒜素的合理使用劑量，通過MTT法測定不同濃度的大蒜素對細(xì)胞活力的影響。低劑量的大蒜素對HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞的生存率沒有明顯的影響；隨著大蒜素濃度的增加，HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞的生存率均明顯降低，且HO-8910PM細(xì)胞的生存率明顯低于HO-8910細(xì)胞(圖1)。

圖1 不同濃度大蒜素對卵巢癌細(xì)胞增殖的影響

2.大蒜素對卵巢癌細(xì)胞集落形成的影響:集落抑制實驗結(jié)果顯示，與HO-8910細(xì)胞比較，HO-8910PM細(xì)胞形成的集落更大，更有侵襲性。大蒜素明顯抑制HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞集落的生成，隨著大蒜素濃度的增加，對HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞集落生成的抑制作用增強(圖2、圖3)，兩種細(xì)胞系集落生成逐漸減少，而且大蒜素對HO-8910PM細(xì)胞集落生成的抑制作用要比對HO-8910的抑制作用強(圖4)。根據(jù)細(xì)胞增殖和細(xì)胞集落形成實驗結(jié)果，選擇75、150和300μmol/L的大蒜素作為后續(xù)實驗的劑量。

圖2 不同時間、不同濃度大蒜素對HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞集落生成的抑制作用(HE染色，×100)

圖3 同一時間、不同濃度大蒜素對HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞集落生成的抑制作用

圖4 大蒜素對HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞集落形成率的影響

3.大蒜素對卵巢癌細(xì)胞caspase-3活性的影響:caspase-3活性實驗結(jié)果顯示，大蒜素明顯增加HO-8910細(xì)胞和HO-8910PM細(xì)胞caspase-3的活性，并隨時間的延長活性明顯增加(P<0.05)。大蒜素給藥濃度為75和150μmol/L時，HO-8910細(xì)胞在12h的活性明顯高于8h(圖5)；大蒜素給藥濃度為150和300μmol/L時，HO-8910PM細(xì)胞在12h的活性明顯高于8h(P<0.05，圖6)。

圖5 大蒜素對HO-8910細(xì)胞卵巢癌細(xì)胞caspase-3活性的影響

圖6 大蒜素對HO-8910PM細(xì)胞卵巢癌細(xì)胞caspase-3活性的影響

4.大蒜素對卵巢癌細(xì)胞PARP蛋白表達(dá)的影響:不同濃度的大蒜素作用12h后，大蒜素給藥濃度為300μmol/L時，在HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞中，caspase-3出現(xiàn)裂解；大蒜素給藥濃度為150和300μmol/L時，PARP蛋白出現(xiàn)裂解(圖7)。

圖7 大蒜素對卵巢癌細(xì)胞caspase-3和PARP蛋白的影響

討 論

盡管目前卵巢癌的治療和患者的長期存活率已有較大改善，但藥物耐藥性與毒性作用與卵巢癌的預(yù)后差和易復(fù)發(fā)密不可分，因此，尋找耐藥性低、毒性作用小的分子靶向藥物，提高卵巢癌藥物療效，降低其病死率，是世界范圍內(nèi)亟待解決的重要問題[12]。大蒜素是從百合科蔥屬植物大蒜的鱗莖中提取的一種含硫化合物，不易產(chǎn)生耐藥性，且對機(jī)體毒性作用較小。鄭文等[13]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可顯著抑制未分化甲狀腺癌細(xì)胞株增殖(P<0.05)，且不具有細(xì)胞毒性；有文獻(xiàn)報道，大蒜素與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可增加其敏感度[14]；Gao等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與環(huán)磷酰胺單獨用藥比較，大蒜素與環(huán)磷酰胺聯(lián)合用藥對腫瘤的抑制作用更加明顯；此外，大蒜素不僅能降低化療藥物耐藥性,也可預(yù)防其毒性不良反應(yīng)[16]。然而，鮮有實驗探討不同劑量的大蒜素作用于腫瘤細(xì)胞的效果差異，因此，本研究設(shè)計不同濃度的大蒜素(0、75、150、300μmol/L)作用卵巢癌細(xì)胞株相同時間，發(fā)現(xiàn)300μmol/L的大蒜素抑制卵巢癌細(xì)胞效果最顯著，研究結(jié)果提示大蒜素對卵巢癌細(xì)胞的影響呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。

Choi等[17]研究結(jié)果顯示，大蒜素通過激活 AMPK 通路，抑制胃癌AGS 細(xì)胞的生長；Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可影響STAT3信號通路，從而抑制膽管癌細(xì)胞的遷移和侵襲；然而，鮮有實驗設(shè)計比較大蒜素對不同類型卵巢癌細(xì)胞的抑制作用。為此，本實驗采取不同大蒜素濃度(0、75、150、300μmol/L)分別作用于普通型HO-8910細(xì)胞和高侵襲型HO-8910PM細(xì)胞。結(jié)果可見作用相同時間后，在同一濃度條件下，大蒜素對高侵襲型HO-8910PM細(xì)胞的抑制作用強于普通型HO-8910細(xì)胞，但導(dǎo)致兩種類型細(xì)胞作用效果差異的潛在機(jī)制尚不明確。未來需更多高質(zhì)量實驗探究導(dǎo)致其差異性的相關(guān)分子機(jī)制和信號通路。

大蒜素的脂溶性成分包括二烯丙基硫、二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)和二烯丙基三硫(diallyl trisulfide,DATS)，水溶性成分包括 S-烯丙基半胱氨酸(s-allylcysteine,SAC)、S-烯丙基巰基半胱氨酸(s-allylmercaptocysteine,SAMC)等[19]。有研究對小鼠皮下接種HO8910、HO8910PM 和 SKOV3卵巢癌細(xì)胞株，結(jié)果顯示經(jīng)SAMC處理后，源自 HO8910 和 SKOV3細(xì)胞的皮下腫瘤體積明顯減少[20]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報道，SAC可抑制人卵巢癌A2780細(xì)胞株的增殖，并呈劑量和時間依賴性[21]。細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)主要由B細(xì)胞淋巴瘤2(Bcl-2)家族蛋白和caspase家族介導(dǎo)，caspase-3是凋亡級聯(lián)反應(yīng)最關(guān)鍵的促凋亡蛋白酶，因此，調(diào)節(jié)caspase-3的活性可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。PARP 是一種核酶，主要參與 DNA 的損傷修復(fù)。Xu等[23]以人上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞株為模型，證實了SAC抑制卵巢癌細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用；SAC下調(diào)失活的caspase-3的表達(dá)，同時上調(diào)caspase-3的活性，活化的caspase-3裂解PARP-1，導(dǎo)致其下調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)，大蒜素可能通過調(diào)節(jié)caspase-3的活性和PARP蛋白的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞凋亡，與此前文獻(xiàn)報道結(jié)果相一致。探究大蒜素作用卵巢癌細(xì)胞株的合理劑量及時間，以期達(dá)到最佳效果，可為臨床決策提供參考，然而目前對此的文獻(xiàn)研究甚少，為此，本實驗采用不同濃度的大蒜素(75、150、300μmol/L)分別作用HO-8910和HO-8910PM細(xì)胞不同時間(4、8、12h)，結(jié)果提示，大蒜素濃度相同時，caspase-3在作用12h后的活性高于8h；作用相同時間(12h)后，高濃度的大蒜素對PARP蛋白表達(dá)的影響更顯著，由此本研究認(rèn)為大蒜素具有劑量-效應(yīng)和時間-效應(yīng)關(guān)系。該實驗結(jié)論可為臨床科學(xué)用藥提供指導(dǎo)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，大蒜素抑制卵巢癌細(xì)胞生長和集落形成，可能通過調(diào)節(jié)caspase-3和PARP蛋白誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞凋亡，呈濃度和時間依賴性，且高侵襲型卵巢癌細(xì)胞更敏感。