趙瑋晗，畢景文，趙玉杰，邱士允，Madalin Parepa，Oliver Bossdorf，Christina Richards,3，鞠瑞亭，吳紀華，廖志勇，李 博

(1.復旦大學 生命科學學院 生物多樣性和生態(tài)工程教育部重點實驗室，上海 200438；2.圖賓根大學 進化與生態(tài)研究所，德國 圖賓根 D-72076;3.南佛羅里達大學 整合生物學系，美國 坦帕 33617;4.中國科學院 西雙版納植物園 熱帶森林生態(tài)學重點實驗室，云南 勐臘 666303)

植物次生代謝物質是一大類在植物體內合成但卻不直接用于植物生長或繁殖的有機物[1]，其通常是初級代謝過程的中間產(chǎn)物[2]。植物葉片次生代謝物的表達被廣泛認為是植物響應外界環(huán)境變異的重要性狀[3-6]，在植物防御草食昆蟲和動物取食、抵御病原菌侵染[3-4]和響應非生物環(huán)境因子脅迫中具有重要作用[7]。植物次生代謝物質含量的變化能夠進一步改變植物體內其他代謝途徑[8]，影響凋落物理化水平[8]，并最終影響生態(tài)系統(tǒng)過程。在自然界，植物次生代謝物質含量被認為是生物間相互作用、氣候因子以及土壤養(yǎng)分狀況三方面互作的結果[9-12]。其中，草食作用被認為是植物防御性次生代謝物質含量變異的主要因素[13]，由此提出了草食作用-植物防御的緯度梯度假說[3]。然而，由于植物次生代謝物質具有廣泛的生態(tài)功能，其他非生物因子對于其含量同樣具有顯著影響[9,11]。因此，雖然不同生物與非生物因子對植物次生代謝物質含量的影響在以往研究中有報道，但尚未得到一致性結論。

沿緯度梯度環(huán)境因子的變異是生態(tài)學和生物地理學中的經(jīng)典格局[14]，被廣泛用來研究多種生物與非生物因子對于植物次生代謝物質含量的影響[9,15-16]。例如，烏桕(Triadicasebifera(L.) Small)種群葉片單寧含量隨緯度升高而降低，在受到嚴重草食作用影響的種群中，作為防御物質的單寧含量顯著較高，而非生物環(huán)境因子對于其變異沒有顯著影響[12]。但對于夏櫟(QuercusroburL.)不同緯度的多個種群葉片草食作用與防御性次生代謝物質的研究發(fā)現(xiàn)，與生境溫度、降水和土壤孔隙率相關的因子能夠直接影響葉片酚類物質的含量，而草食作用強度與防御作用的次生代謝物質含量顯著負相關，進一步通過結構方程模型說明次生代謝物質的含量首先響應非生物環(huán)境影響，進而產(chǎn)生對草食者的影響[11]。類似地，對該物種的另一項研究發(fā)現(xiàn)，葉片酚類物質含量受到溫度和土壤碳儲量的影響，與草食作用強度沒有顯著關系[9]。因此，亟待結合草食作用以及非生物環(huán)境因子分析影響種內重要次生代謝物質含量變異的主要因素[3]，為進一步認識次生代謝物質的生態(tài)功能，深入理解物種響應環(huán)境變異的關鍵性狀與策略選擇[17-18]，及更普遍的宏觀生態(tài)格局研究提供參考[19]。

虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)是蓼科虎杖屬的多年生草本植物，由于其能夠代謝產(chǎn)生大量活性物質，在我國作為藥材已有1500年歷史[20-21]。其中，白藜蘆醇作為一種植物天然代謝的多酚類抗氧化劑[7]，是虎杖較為特殊的次生代謝物之一[22]，因其對人類健康的潛在益處(包括抗癌作用，抗衰老和廣譜抗菌特性等)而在近年來受到廣泛關注[7]。植物葉片白藜蘆醇含量與真菌侵染和紫外輻射強度有關[23-24]。同時，白藜蘆醇溶液對部分植物的廣食性和專食性草食者能產(chǎn)生負面影響，可能有抵御葉片取食者的防御功能[25]。但是，野外跨緯度梯度白藜蘆醇含量的變異與影響因子及其與實際草食作用的關系，尚未有研究報道。同樣作為酚類化合物，單寧類物質廣泛存在于大量植物中，具有明顯的化學防御作用[26-27]。單寧能利用其結合蛋白質的能力，作為草食性昆蟲的消化抑制劑以抵御其進一步取食[28]；能在堿性環(huán)境中起到氧化作用，對昆蟲造成不利影響[26-27]。作為虎杖響應生物和非生物環(huán)境因子變異的潛在性狀，尚未有研究報道其葉片單寧類物質含量的緯度變異格局。本文擬通過對華南與華東地區(qū)不同虎杖種群葉片中白藜蘆醇與總單寧含量，以及草食作用程度的調查，分析兩種次生代謝物質與各種群草食作用強度及來源生境中非生物環(huán)境因子間的關系，回答下列科學問題: (1) 虎杖葉片重要次生代謝物質白藜蘆醇和單寧含量是否存在顯著的緯度變異；(2) 影響兩種次生代謝物質緯度變異的因素是什么，二者之間是否存在差異；(3) 不同影響因素的相對重要性在兩種物質之間是否存在差異？

1 材料與方法

1.1 研究材料與研究區(qū)概況

虎杖(R.japonicaHoutt.)原產(chǎn)于亞洲大陸東岸的亞熱帶與溫帶地區(qū)[29-30]，包括中國、朝鮮與日本，在我國的東南部地區(qū)各省份有較為廣泛的分布，尤其偏好小溪、農田與竹林邊緣的生境。

1.2 研究區(qū)與調查方案

野外調查于2020年植物生長旺季進行。在我國華東與華南地區(qū)(北緯23.29°～32.85°)虎杖主要分布范圍內，對虎杖37個野生種群進行了調查與采樣(圖1,表1)。

圖1 虎杖種群調查和采樣地點及主要環(huán)境因子Fig.1 Locations and main environmental factors of the sampled R.japonica populations

表1 虎杖種群調查和采樣地點及主要環(huán)境因子Tab.1 Sampling locations and main environmental predictors of R.japonica population

在每一個地點，盡量選擇相對較大的種群(長度>30 m)進行調查，每個種群設置5個1 m×1 m的調查樣方，相鄰樣方間至少間距5 m。在各樣方內隨機選擇1株中等大小的虎杖目標個體，采集其主莖頂端的5片完全展開葉，用于測定葉片所受草食作用程度。同時采集3～5個分枝上的所有完全展開葉，用于葉片次生代謝物質的測定。采集后立即將所有葉片置于放有冷凍冰袋的保溫箱中，并于采集當天對所有葉片進行葉面積測定。同時，在每個樣方內應用五點法隨機采集表層10 cm深的土壤樣品，去除樣品中的根系等植物組織，混合均勻后用于后續(xù)的養(yǎng)分指標分析。土壤樣品同樣置于放有冷凍冰袋的保溫箱中于次日寄回實驗室保存在4 ℃冷庫中直至送樣分析。

1.3 葉片草食作用程度的測定

前期野外觀察發(fā)現(xiàn)不同虎杖種群在野外存在不同程度的葉片缺刻，所以本研究僅關注缺刻型草食作用強度。本研究使用虎杖個體主莖頂端的5片完全展開葉，基于兩種方式衡量個體葉片所受草食作用程度: (1) 目標個體葉片中受損葉片數(shù)量比例，和(2) 葉片被取食面積占比。其中，葉片受損面積比例=(總葉面積-實際葉面積)/總葉面積[31]；首先利用新鮮葉片掃描照片(Epson Perfection V330)，使用Image J軟件(Image J 64-bit Java 1.8.0 172)計算實際葉面積，之后使用Adobe Photoshop CC 2018軟件基于虎杖葉形進行葉面積補全，使用Image J軟件計算總葉面積(圖2)。

圖2 葉片所受草食作用程度計算方法Fig.2 Method of estimating the degree of herbivory damage on leaves

1.4 葉片次生代謝物質的測定

白藜蘆醇的測定參照劉臣和唐長波[32]的方法，使用甲醇溶液避光超聲提取過篩后的葉片樣品，取上清液，使用高效液相色譜進行測定(Waters 2695 HPLC System w/UV Detector, Marshall Scientific, USA)。單寧的測定參照Folin & Denis[33]的方法，使用酶標儀(M200 microplate fluorometer, Grodig Tecan infinite, Switzerland)完成測定。

1.5 野外種群環(huán)境參數(shù)的測定與信息收集

野外采集的土壤樣品自然風干，稱取部分研磨后樣品使用元素分析儀(vario MACRO cube, Elementar, Germany)測定土壤總碳、總氮以及有機碳、有機氮含量。同時針對其他元素的不同特性，分別使用比色法(UV-755B分光光度計，上海精密科學儀器有限公司)和火焰原子吸收分光光度法(Z-2300火焰原子吸收分光光度計，日本日立公司)測定土壤總磷、總鉀、總鈣、總鎂含量，及有效磷、有效鉀、有效鈣和有效鎂含量。

為研究不同環(huán)境因子對虎杖葉片次生代謝物緯度變異的影響程度，基于野外調查中確定的各虎杖種群位置，從世界氣候數(shù)據(jù)庫(WorldClim version 2.1)[34]的生物氣候數(shù)據(jù)產(chǎn)品中提取部分氣候數(shù)據(jù)，分辨率約為30 s，這些氣候數(shù)據(jù)均為近30年的平均數(shù)值，適用于植物功能性狀生物地理格局及其影響因素的研究[11]。基于以往研究[9-12]，溫度、降水和太陽輻射變量可能葉片次生代謝物質含量有較大相關性，因此我們提取數(shù)據(jù)庫中的年均溫(BIO1，℃)、溫度季節(jié)性(BIO4)、年最高溫(BIO5，℃)、年最低溫(BIO6，℃)、溫度年較差(BIO7，℃)、年降水量(BIO12，mm)、最濕潤月降水量(BIO13，mm)、最干燥月降水量(BIO14，mm)和降水季節(jié)性(BIO15)用于后續(xù)分析。其中季節(jié)性變量表示溫度和降水在一年內變化的平均幅度，使用各月溫度和降水多年平均值的標準偏差計算得到[34]。由于葉片白藜蘆醇含量可能受到太陽輻射強度的影響[23-24]，我們同時在該數(shù)據(jù)庫中提取近30年中每個月的平均太陽輻射量數(shù)據(jù)，分辨率約為30 s；計算太陽輻射年均值(kJ·m-2·d-1)、太陽輻射年較差(kJ·m-2·d-1)、夏季太陽輻射值(kJ·m-2·d-1)以及冬季太陽輻射值(kJ·m-2·d-1)。

1.6 統(tǒng)計分析

由于非生物環(huán)境變量間存在共線性，我們首先對溫度、降水、土壤和太陽輻射變量分別進行主成分分析，并基于變量相關系數(shù)，選擇部分變量進行后續(xù)分析。

本研究使用線性混合效應模型分析次生代謝物質與緯度的關系，同一采樣種群內的5個目標個體作為緯度內的重復加入隨機效應。由于pop 6次生代謝物質數(shù)據(jù)測定異常，所以在統(tǒng)計分析過程中剔除該記錄。由于葉片次生代謝物質含量有可能隨緯度呈現(xiàn)非單調關系，所以在“緯度”作為固定效應的模型基礎上，增加“緯度的平方項”重新建立模型，使用赤池信息準則AIC值較小的模型[12]，確定變量與緯度的關系。使用針對所有固定效應的殘差圖檢驗模型的正態(tài)性與方差齊性假設。使用似然比檢驗方法(likelihood ratio tests,χ2test)檢驗緯度對各個變量影響的顯著性，并計算模型決定系數(shù)。

對于葉片草食作用程度變量(受損葉片數(shù)量比例與葉片受損面積比例)的相關性分析顯示，二者呈現(xiàn)顯著的正相關關系(r=0.47，P<0.001)，所以后續(xù)使用受損葉片數(shù)量比例作為衡量草食作用的指標。本研究使用線性混合效應模型分析次生代謝物質含量變異的影響因素，分別以葉片白藜蘆醇與單寧含量為響應變量，建立多元回歸模型，使用方差膨脹因子(VIF)檢驗解釋變量共線性，并使用解釋變量的殘差圖進行模型假設檢驗，通過似然比檢驗方法檢驗各個變量影響的顯著性，并計算模型決定系數(shù)。進一步基于多元回歸模型結果，使用hier.part包提供的層次劃分算法[35]，計算顯著解釋變量對響應變量的獨立影響百分比，得到變量的相對貢獻度。最后基于Larsen和McCleary的方法[36]繪制偏殘差圖，分析多元回歸中響應變量與主要解釋變量的關系。所有分析均在R 4.0.3軟件中進行(R Core Team, 2021)。

2 結 果

2.1 非生物環(huán)境因子的主成分分析

草食作用與所有非生物環(huán)境因子主成分得分值的相關性分析結果顯示，部分變量之間存在較強相關關系。為排除解釋變量共線性的影響，同時基于主成分分析的結果，選擇草食作用，以及溫度、降水、土壤和太陽輻射各自的第一主成分用于后續(xù)分析。溫度第一主成分解釋了原始變量69.9%的變異，溫度季節(jié)性(BIO4)與年最低溫(BIO6，℃)對其貢獻最大，其中溫度季節(jié)性與溫度第一主成分呈正相關，而年最低溫與之呈負相關。降水第一主成分解釋了原始變量58.5%的變異，最濕潤月降水量(BIO13，mm)對其貢獻最大，呈正相關。土壤變量第一主成分解釋了原始變量36.8%的變異，碳、氮元素以及有機碳、有機氮含量對其貢獻最大，呈正相關。太陽輻射變量主成分結果顯示，第一主成分解釋了原始變量67%的變異，太陽輻射年較差對于第一主成分貢獻最大，呈正相關。

2.2 虎杖葉片次生代謝物質的緯度變異

圖3 虎杖葉片(a) 白藜蘆醇含量與(b) 總單寧含量的緯度格局Fig.3 Latitudinal variation of the content of (a) resveratrol and (b) tannin in leaves from different Reynoutria japonica populations圖中P值為線性混合效應模型似然比檢驗的P值，NS表示變量與緯度無顯著關系。

表2 虎杖葉片白藜蘆醇與單寧含量的(a) 緯度變異及(b) 其與草食作用和非生物影響因子的檢驗總結Tab.2 Latitudinal variation (a), and the effects of herbivory damage and abiotic factors (b) on the content of resveratrol and total tannin in leaves from different R.japonica populations

2.3 虎杖葉片次生代謝物質緯度變異的影響因素及其相對重要性

對虎杖不同種群葉片白藜蘆醇含量多元回歸分析結果表明，其含量變異受到草食作用、溫度、降水以及太陽輻射的顯著影響(表2(b))。對顯著解釋變量的相對貢獻分析結果顯示(圖4)，溫度第一主成分是對葉片白藜蘆醇含量解釋度最高的因子，其次是太陽輻射與降水第一主成分，草食作用程度解釋度次之。偏殘差分析顯示，溫度第一主成分與白藜蘆醇含量顯著正相關(圖5(a)，表2(b))，即在溫度季節(jié)性越高、年最低溫越低的生境中，虎杖葉片白藜蘆醇含量越高。降水與太陽輻射第一主成分，以及草食作用程度與葉片白藜蘆醇含量變異方向相反(圖5(b～d)，表2(b))，即隨著最濕潤月降水量的下降、太陽輻射年較差的下降，同時葉片所受草食作用程度的下降，虎杖種群葉片白藜蘆醇含量上升。對虎杖葉片單寧含量多元回歸分析結果表明，其含量變異與草食作用無顯著關系，而只受溫度因子的影響(表2(b))。偏殘差分析顯示，溫度第一主成分與單寧含量顯著正相關(圖5(e)，表2(b))，與白藜蘆醇結果相似，即在溫度季節(jié)性越高、年最低溫越低的生境中，虎杖葉片單寧含量越高。

圖4 虎杖來源生境中不同影響因子對葉片 白藜蘆醇含量的相對貢獻度Fig.4 The relative importance of different factors to the content of resveratrol in leaves from different R.japonica populations

圖5 虎杖葉片白藜蘆醇和總單寧含量與多元回歸模型中各顯著影響因子的關系(圖中的所有值均為偏殘差結果)Fig.5 The relationships between significant variables of multiple regressions and the content of resveratrol and total tannin in leaves from different R.japonica populations (All the values of the X and Y axis are the partial residuals for different variables)

3 討 論

葉片次生代謝物質對植物響應外界環(huán)境變化具有重要作用[3-6]。已有研究表明，植物葉片次生代謝物的含量會受到以草食作用為主的生物間相互作用、氣候因子和土壤因子等因素的影響[9-12]，但不同影響因子對葉片次生代謝物質含量變異的相對貢獻尚未得到一致性的結論。本研究結果顯示，虎杖葉片中白藜蘆醇含量隨緯度增加而顯著降低，而總單寧含量隨緯度變化未呈現(xiàn)顯著變異。二者含量均與生境的溫度季節(jié)性呈顯著正相關，葉片白藜蘆醇含量還與最濕潤月降水量、太陽輻射年較差和葉片草食作用呈顯著負相關。由此可見，虎杖葉片中兩種酚類次生代謝物質的含量是以溫度季節(jié)性為主的多種環(huán)境因子綜合影響的結果，暗示不同次生代謝物質可能具有多種不同的生態(tài)功能。本研究結果加深了對植物葉片次生代謝物質的緯度變異格局及其成因的認識，同時對虎杖資源的開發(fā)利用具有一定參考價值。

雖然很多研究關注白藜蘆醇的抗癌、抗衰老作用和廣譜抗菌特性等有益于人體健康的功效[22]，但早期研究更傾向關注白藜蘆醇在植物體內合成的影響因素及其生態(tài)功能[23]。白藜蘆醇最初被認為是植物體內響應真菌侵染和紫外輻射的保護性次生代謝產(chǎn)物[7]，是重要的誘導性物質[24]，葡萄果實和葉片中的白藜蘆醇含量被認為是其對真菌侵染抗性水平的體現(xiàn)[37]。野外生境中白藜蘆醇含量的影響因素研究較為有限[7]。本研究的結果顯示，野外生境中較高的溫度季節(jié)性，可能是驅動虎杖葉片白藜蘆醇含量升高最為重要的環(huán)境因子，生境太陽輻射條件與最濕潤月降水量也對于葉片白藜蘆醇含量有顯著影響。有研究表明，植物生長季的溫度與降水總量對于草本植物葉片真菌病害的發(fā)生具有顯著影響[38-40]。同時，在本研究的野外調查中也發(fā)現(xiàn)，虎杖種群葉片真菌病害的發(fā)生情況較為普遍。因此，虎杖生境年尺度上較大的溫度波動和夏季更豐富的降水，可能通過促進虎杖葉片真菌病害的發(fā)生，進而誘導葉片白藜蘆醇平均含量上升。本研究還發(fā)現(xiàn)虎杖葉片白藜蘆醇含量受到太陽輻射年較差的影響，即在生境太陽輻射條件越穩(wěn)定、總量越高的情況下，其含量越多。該結果與在其他物種中發(fā)現(xiàn)的紫外輻射是誘導植物合成白藜蘆醇的研究結果一致[23-24]。說明虎杖葉片白藜蘆醇含量可能受太陽輻射誘導，在虎杖生長過程中起到了抵御過高輻射的作用。

很多關注草食作用與植物化學防御之間關系的研究，使用單寧類物質含量作為衡量植物化學防御水平的指標，如木本植物葉片中的縮合單寧和沒食子酸單寧[41]。但本研究的結果顯示，虎杖葉片中總單寧含量與草食作用的變異無關。有研究表明，葉片中以單寧為代表的次生代謝物質含量的變異，與植物資源分配和防御策略變異有關[17-18]，即單寧含量與其他植物功能性狀間存在權衡關系。例如，部分植物在應對緯度梯度上外界環(huán)境變異時，表現(xiàn)為以各類功能性狀為基礎的防御綜合征的動態(tài)變化[42-43]，包括物理防御性狀和化學防御性狀的權衡，誘導和組成性防御性狀的權衡，以及抗性和耐受性之間的權衡[43]。因此，本研究中虎杖葉片單寧含量可能由于上述權衡關系的動態(tài)變化而產(chǎn)生變異，這需要繼續(xù)結合虎杖其他功能性狀分析緯度梯度上虎杖適應策略的變異，以深入認識野外情況下虎杖葉片單寧的影響因素與生態(tài)功能。

經(jīng)典的草食作用-植物防御的緯度梯度假說(Latitudinal Herbivory-Defense Hypothesis, LHDH)[3]認為，低緯度地區(qū)的植物傾向于受到更高的草食作用壓力，植物自身也因此將投入更多資源用于防御相關性狀，即生物間相互作用是影響植物次生代謝物質含量的主要因素。本研究中，僅白藜蘆醇含量與草食作用顯著相關，且相對貢獻度較低，變異方向相反，不符合上述假說。Moles等[44]對于20年來LHDH假說相關研究進行了整合分析，結果發(fā)現(xiàn)缺乏支持該假說的一致性證據(jù)。歸結其原因大致有幾個方面: 研究所采用的衡量草食作用的方法各有差異[45]；相同次生代謝物質在不同的物種和環(huán)境條件下可能有不一致的生態(tài)功能[46]。本研究緯度跨度較小，且只關注缺刻型草食作用強度的變異，一些虎杖專食性葉片草食者和其他類型的草食作用并未記錄，而單寧的消化抑制功能往往針對性響應某些專食性草食者的草食作用[47]，因此虎杖草食作用與單寧的變異與經(jīng)典假說不符。同時本研究結果顯示，更高程度的草食作用會出現(xiàn)在葉片白藜蘆醇含量較低的種群中，說明虎杖葉片中的白藜蘆醇在響應溫度與太陽輻射的同時，可能具有化學防御功能。針對部分植物廣食性和專食性草食者的體外生測實驗結果支持了白藜蘆醇具有潛在的化學防御功能[25]。針對虎杖提取物的研究也顯示，白藜蘆醇具有一定的抗氧化作用[21]；但白藜蘆醇在植物體內是否具有防御草食者的作用需要進一步深入研究?；⒄仁荌UCN認為的全球100種最具威脅性入侵種之一，已在歐洲和北美洲帶來了巨大的生態(tài)災難[48]。有同質園實驗結果表明，不同來源地間不同基因型虎杖芪類次生代謝物的種類和含量有顯著變化[20,49]，并且進一步通過化感作用對鄰體物種產(chǎn)生負面影響[50]，這可能是虎杖在引種后快速進化形成“新武器”的表現(xiàn)。因此，全面剖析虎杖次生代謝物的生態(tài)功能及其影響因素，不僅有助于在理論上深入討論植物化學防御與生物及非生物因子變化的關系，更對于解釋虎杖入侵機制和生態(tài)系統(tǒng)恢復有著重要的實際意義。

本研究測定了虎杖中重要活性物質白藜蘆醇含量，同時測定了被廣泛認為是化學防御物質的總單寧類物質含量，基于葉片實際被取食的情況衡量草食作用強度，結合氣候、太陽輻射和土壤因子數(shù)據(jù)，旨在探索虎杖次生代謝物緯度變異及其影響因素的相對重要性，探究虎杖次生代謝物質生態(tài)功能。虎杖的化學防御物質種類仍然沒有一直的結論[21,50-51]，本研究通過首次對虎杖種群的大范圍野外調查，發(fā)現(xiàn)其葉片酚類次生代謝物質的含量是以溫度季節(jié)性為主的多種環(huán)境因子綜合影響結果，暗示不同次生代謝物質可能具有多種不同的生態(tài)功能。白藜蘆醇含量與虎杖葉片草食作用程度顯著負相關，說明其可能是虎杖的化學防御性狀，有待于后續(xù)深入研究。作為我國重要的傳統(tǒng)藥用植物，針對虎杖次生代謝物質的研究不僅加深了對植物次生代謝物質的緯度變異格局與影響因素的認識，也對于虎杖資源的開發(fā)利用具有一定的參考價值。