岳檸檸，吳 真，張旭敏

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200433)

基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定思路大致分為“Bottom-up”[1-2]、“Top-down”[3-4]及“Middle-down”[5]3種，其中“Bottom-up”(又稱“Shotgun”，即鳥槍法)最為普遍。該策略將蛋白樣品預(yù)處理后使用特定蛋白酶進行酶切，對酶切后肽段進行質(zhì)譜檢測分析，通過將檢測譜圖與理論數(shù)據(jù)庫的譜圖匹配以進行蛋白質(zhì)鑒定[6]。其中，樣品酶切是影響鑒定結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，優(yōu)質(zhì)的特異性蛋白酶能將蛋白樣品依據(jù)特定位點盡可能完全酶切成合適長度的肽段，方便質(zhì)譜檢測，且與數(shù)據(jù)庫匹配時可提高蛋白序列覆蓋度[7-8]。LysargiNase屬于鋅金屬蛋白酶的一種，最初發(fā)現(xiàn)于嗜乙酸甲烷八疊球菌(MethanosarcinaacetivoransC2A)[9]，在對其進行點突變修飾(C269A)后發(fā)現(xiàn)該蛋白酶穩(wěn)定性及酶切特異性顯著提高[10-11]。在酶切樣品時，LysargiNase能夠特異性識別賴氨酸及精氨酸的氨基端(胰蛋白酶識別羧基端)，因此與胰蛋白酶互為鏡像酶[12]。

與胰蛋白酶不同的是，LysargiNase對于部分發(fā)生翻譯后修飾的酶切位點識別度更高[13-15]，基于該特點，將LysargiNase與胰蛋白酶進行組合酶切蛋白質(zhì)的甲基化[16]或磷酸化修飾位點[17-18]時能夠產(chǎn)生更多鑒定數(shù)目。此外，LysargiNase在C末端組學(xué)分析中相比于胰蛋白酶存在獨特優(yōu)勢，其酶切能夠特異性產(chǎn)生以堿性氨基酸起始的C末端肽段，通過增加電荷數(shù)來提高C末端肽段在質(zhì)譜分析中的響應(yīng)，這為蛋白質(zhì)C末端鑒定提供了新的思路[19-20]。然而由于LysargiNase酶切效率不及胰蛋白酶，使用范圍相對局限。本研究首先在原核表達系統(tǒng)中純化出重組LysargiNase，在對其活性及酶切效率進行組學(xué)分析后，確認(rèn)了該蛋白酶具有近似商品化產(chǎn)品的性能以及與胰蛋白酶的互補能力。同時為彌補LysargiNase的漏切缺陷，提出酶原水平的雙甲基化修飾及活化水平的乙酰化修飾方法來提高該酶的酶切效率，從而優(yōu)化了該酶的性能?；谝陨辖Y(jié)果，本研究為后續(xù)應(yīng)用LysargiNase進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析提供了借鑒作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

將LysargiNase(簡寫為LA)編碼基因(NCBI Reference Sequence： NC_003552.1)前端結(jié)合His-tag標(biāo)簽一并整合至pET-28a表達載體，經(jīng)設(shè)計后交由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司合成，得到重組質(zhì)粒pET28a-LA(卡那霉素抗性)。Ni-NTA親和層析介質(zhì)購自德國QIAGEN公司，三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸胍(Guanidine hydrochloride)購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，咪唑(imidazole)、4-羥乙基哌嗪四磺酸(HEPES)、二硫蘇糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAM)、丙烯酰胺(Acrylamide)、乙腈(ACN)、甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、α-氰基-4-羥基-肉桂酸(CHCA)、氰基硼氫化鈉(NaBH3CN)、甲醛(HCHO)、羥胺(NH2OH)購自美國Sigma公司，Microcon YM-10kD超濾管購自德國Merck公司，Poros Oligo R3柱料購自美國Applied Biosystems公司。

1.2 重組蛋白的誘導(dǎo)表達及純化

將重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，挑取陽性單克隆進行擴增培養(yǎng)，待菌液OD600值為0.5～0.6時，加入0.25 mmol/L IPTG在16 ℃誘導(dǎo)12 h，該條件下表達出大量可溶性LA蛋白酶原。收集菌體進行冰浴超聲處理，離心后將上清結(jié)合至Ni-NTA親和層析介質(zhì)，分別使用含20 mmol/L與250 mmol/L咪唑的Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)進行清洗及洗脫，SDS-PAGE電泳檢測洗脫組分純度，隨后透析至HEPES緩沖液(pH 7.5)中，Bradford法測定蛋白酶濃度后保存于-80 ℃。LA使用前需在10 mmol/L Ca2+條件下在20 ℃活化12 h。

1.3 蛋白酶修飾反應(yīng)

對LA進行雙甲基化修飾： 加入終濃度20 mmol/L NaBH3CN、20 mmol/L HCHO在25 ℃反應(yīng)15 min，再加入終濃度100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)終止反應(yīng)。對LA進行乙?；揎棧?加入終濃度10 mmol/L Ac-NHS在25 ℃反應(yīng)15 min，再加入終濃度100 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)終止反應(yīng)。

1.4 蛋白樣品預(yù)處理及酶切

以大腸桿菌E.coliDH5α蛋白樣品為材料，配制裂解緩沖液(8 mol/L鹽酸胍+100 mmol/L Tris-HCl)進行蛋白質(zhì)提取，Bradford法檢測蛋白樣品濃度。使用DTT及IAM對牛血清白蛋白(BSA)及E.coliDH5α蛋白樣品進行烷基化處理，將蛋白質(zhì)二硫鍵打開并還原。

以人腎上皮細胞系HEKHEK 293T蛋白樣品為材料，使用8 mol/L鹽酸胍+100 mmol/L TEAB為裂解緩沖液進行蛋白質(zhì)提取，Bradford法檢測蛋白樣品濃度。使用DTT及丙烯酰胺對蛋白樣品進行烷基化處理，將蛋白質(zhì)二硫鍵打開并還原。對部分樣品使用Ac-NHS對蛋白樣品進行氨基乙?；揎棧褂肨ris-HCl及NH2OH進行終止與副反應(yīng)去除。

對E.coliDH5α、HEK 293T蛋白樣品均采用FASP(Filter Aided Sample Preparation)方法[21]進行樣品預(yù)處理： 將經(jīng)過還原烷基化處理的蛋白樣品轉(zhuǎn)移至超濾管中，離心去除裂解緩沖液后，分別使用置換緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl/TEAB，15% ACN)及酶切緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl/HEPES，pH 7.5)經(jīng)過多次置換徹底去除鹽酸胍，以1∶25(質(zhì)量比)比例加入已活化的LA或1∶50(質(zhì)量比)比例加入胰蛋白酶于37 ℃進行消化。離心收集消化后肽段，真空凍干儀內(nèi)濃縮體積后使用FA進行酸化，使用Poros Oligo R3柱料對肽段進行脫鹽處理，凍干后保存于-20 ℃。

1.5 MALDI-TOF MS分析

使用Bruker Ultraflex TOF/TOF質(zhì)譜儀(Bruker, Bremen, Germany)進行MALDI-TOF MS分析。將酶切后樣品使用FA酸化處理后與基質(zhì)(將5 mg/mL CHCA溶于70% ACN和1% TFA而得)以適當(dāng)比例混勻滴加至進樣靶上，使用TFA進行靶上脫鹽處理，隨后進行質(zhì)譜檢測。獲取圖譜均在正反射模式下進行，使用Bruker FlexAnalysis軟件(2.4版本)進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析處理。

1.6 LC-ESI-MS/MS分析

使用納升EASY-nLC 1000液相系統(tǒng)串聯(lián)LTQ-Orbitrap Elite質(zhì)譜(Thermo Fisher Scientific)對脫鹽后樣品進行LC-ESI-MS/MS分析。色譜柱尺寸為長25 cm×內(nèi)徑75 μm，使用Reprosil-Pur 120 C18-AQ填料。液相系統(tǒng)中流動相A為0.1% FA(溶劑為H2O)，流動相B為0.1% FA(溶劑為ACN)，采用80 min的非線性梯度進行洗脫，流速為200 nL/min。質(zhì)譜分析采用數(shù)據(jù)依賴采集(Data Dependent Acquisition， DDA)方法，使用HCD碎裂模式產(chǎn)生碎片離子。

1.7 數(shù)據(jù)分析

質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)(.raw文件)使用Proteome Discoverer(1.4版本，Thermo Fisher Scientific)軟件進行分析，使用Mascot(2.3版本，Matrix Science，London，UK)服務(wù)器進行搜索，從Uniprot網(wǎng)站下載大腸桿菌E.coli蛋白(包含4 304條蛋白質(zhì)序列)及人類蛋白數(shù)據(jù)庫(包含20 186條序列)。搜索時設(shè)置參數(shù)選擇TrypsinN(即LA)酶切(對進行乙酰化保護的樣品選擇ArgN酶切)，根據(jù)樣品預(yù)處理方式選擇固定修飾(半胱氨酸上的碘代乙酰胺化或丙酰胺化修飾，在進行蛋白水平乙酰化時增加賴氨酸上的乙?；揎?及可變修飾(甲硫氨酸的氧化及蛋白質(zhì)N末端乙?；揎?類型。為使搜索結(jié)果置信度提高，使用Proteome Discoverer的Target Decoy PSM以及設(shè)置Mascot的期望值進行驗證，當(dāng)FDR≤0.01且MASCOT期望值≤0.05時視為結(jié)果可信。

2 結(jié)果與分析

2.1 LA誘導(dǎo)表達及親和純化

LA序列全長342 aa，以酶原形式表達，分子量(Mr)約38 kDa，在Ca2+存在條件下可發(fā)生自切(Arg61～Ala322)，得到具有酶切活性的成熟蛋白，分子量約29 kDa。在LA編碼基因前添加His-tag標(biāo)簽(20 aa)，基因合成后經(jīng)NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切克隆入pET-28a表達載體，得到重組質(zhì)粒pET-28a- LA(圖1)。

圖1 重組LysargiNase氨基酸序列分析Fig.1 Analysis of recombinant LysargiNase amino acid sequences

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞，對該酶進行誘導(dǎo)表達，并使用Ni-NTA親和層析介質(zhì)進行純化，第一次洗脫組分中能夠得到純度很高的目的蛋白，對該組分進行透析，即得帶有His-tag標(biāo)簽的LA酶原。

在20 ℃條件下加入10 mmol/L Ca2+進行活化12 h后，SDS-PAGE檢測到明顯的分子量變化(圖2(a))，條帶大小由約40 kDa降低為29 kDa，與預(yù)期結(jié)果一致。取考馬斯亮藍染色的目的條帶，使用胰蛋白酶酶切膠粒蛋白樣品并進行MALDI-TOF MS檢測，將肽段圖譜與數(shù)據(jù)庫圖譜進行比對(圖2(b)、表1)，確定純化所得主要成分為LA蛋白酶。

圖2 (a) LA活化前后分子量變化；(b) 胰蛋白酶酶切LA的肽段圖譜Fig.2 (a) Molecular weight changes between pro-LA and activated LA; (b) Peptide spectrum of LA digested by trypsin

表1 胰蛋白酶酶切LA后與數(shù)據(jù)庫匹配的肽段(蛋白序列覆蓋度46%)Tab.1 Peptides of LA digested by Trypsin and matched with database(protein sequence coverage 46%)

為檢測LA是否具有酶切活性及能否特異性識別酶切位點，將該蛋白酶梯度稀釋后酶切BSA，對酶切后的肽段用SDS-PAGE電泳檢測酶切程度，用MALDI-TOF MS分析其酶切位點。按照常規(guī)使用時LA正常工作濃度為1∶25(質(zhì)量比)，酶切BSA結(jié)果顯示該酶工作濃度稀釋100倍仍能酶切完全，稀釋200倍則開始出現(xiàn)殘余蛋白樣品(圖3(a))，表明純化所得蛋白酶具有足夠酶切活性。此外MALDI-TOF MS鑒定結(jié)果能夠正確匹配庫中的BSA蛋白序列，且匹配結(jié)果能夠覆蓋到絕大部分強度較高的肽段(圖3(b)、表2，見第288頁)，其序列覆蓋度與使用胰蛋白酶酶切BSA(1∶50)得到的肽段不存在明顯差距(表3，見第288頁)，表明酶切位點能夠精確定位在賴氨酸及精氨酸的氨基端，酶切特異性與胰蛋白酶相近，符合預(yù)期結(jié)果?；谝陨辖Y(jié)果，表明重組LA的活性及酶切特異性符合預(yù)期，能夠用于常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

圖3 (a) LA在不同濃度下的酶切效率；(b) LA酶切BSA(濃度比1∶25)的肽段圖譜Fig.3 (a) Digestion efficiency of LA in different concertrations; (b) Peptide spectrum of BSA digested by LA (1∶25)

表2 LA酶切BSA后與數(shù)據(jù)庫匹配的肽段(蛋白序列覆蓋度51%)Tab.2 Peptides of BSA digested by LA and matched with database(protein sequence coverage 51%)

表3 胰蛋白酶酶切BSA后與理論數(shù)據(jù)庫匹配的肽段(蛋白序列覆蓋度47%)Tab.3 Peptides of BSA digested by Trypsin and matched with database(protein sequence coverage 47%)

(續(xù)表)

2.2 LA與胰蛋白酶的性能差異分析

胰蛋白酶(Trypsin)是蛋白質(zhì)組學(xué)中的首選蛋白酶，LA依據(jù)酶切位點的特異性被認(rèn)為是胰蛋白酶鏡像酶，理論上在酶切效果上與胰蛋白酶存在充分的互補性。對HEK 293T細胞樣品分別使用胰蛋白酶及LA酶切(n=3)，鑒定結(jié)果顯示在肽段及蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目上LA大致為胰蛋白酶的70%(圖4(a))，印證了胰蛋白酶出色的酶切效率，同時LA在蛋白質(zhì)鑒定數(shù)目上的差距尚能接受。此外，對3次平行實驗中鑒定到的所有蛋白質(zhì)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)二者共同鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量為3 265個，占LA鑒定到的所有蛋白質(zhì)的91%(圖4(b))，表明LA在蛋白質(zhì)鑒定種類上與胰蛋白酶極為相近。

圖4 胰蛋白酶與LA鑒定結(jié)果的差異Fig.4 Difference of identification result between Trypsin and LA digestion(a) 鑒定到的蛋白和多肽的總數(shù)量；(b) 共同鑒定到的蛋白和多肽的數(shù)量。

在質(zhì)譜鑒定中，使用單一酶切鑒定時氨基酸序列覆蓋度通常有限，即對于特定蛋白質(zhì)而言，實際經(jīng)過質(zhì)譜鑒定出的肽段序列無法完全覆蓋數(shù)據(jù)庫中的理論蛋白質(zhì)全部序列，通常使用多種酶切以提高序列覆蓋度。在對比LA與胰蛋白酶酶切鑒定蛋白質(zhì)的序列覆蓋度時顯示，單酶切最高均只能達到80%左右覆蓋度，且覆蓋度在20%以下的蛋白質(zhì)數(shù)目超過總鑒定數(shù)目的一半。但結(jié)合兩種酶切結(jié)果分析時，最高序列覆蓋度能夠達到90%，且整體覆蓋度均有提升，覆蓋度超過30%的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果明顯優(yōu)于單酶切(圖5)，表明LA與胰蛋白酶酶切鑒定結(jié)果的組合分析在提高序列覆蓋度方面效果明顯，在蛋白質(zhì)鑒定及定量等研究方向上具有極大應(yīng)用價值。以上結(jié)果說明LA與胰蛋白酶的鑒定結(jié)果互補性較強，且與胰蛋白酶組合使用能夠優(yōu)化蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定結(jié)果。

圖5 LA與胰蛋白酶酶切的序列 覆蓋度分布Fig.5 Distribution of sequence coverage digested by LA and Trypsin

2.3 純化的LA酶與商品化酶的酶切效率比較

為確定純化所得LA的酶切效率是否達到相應(yīng)商品化產(chǎn)品效果，選取兩種國內(nèi)公司(北京華大、北京華利世)的商品化產(chǎn)品(cLA-1、cLA-2)與純化的LA(purified LA, pLA)的酶切效果進行對比。兩種商品化產(chǎn)品同樣為重組表達的LA，cLA-1所用質(zhì)粒與pLA相同，但二者誘導(dǎo)表達條件存在較大差異，cLA-2則為不同種重組質(zhì)粒，且其產(chǎn)品為已活化狀態(tài)，選取以上兩種商品化產(chǎn)品作為參考能夠?qū)Φ鞍椎恼T導(dǎo)表達及重組質(zhì)粒的構(gòu)建結(jié)果做出有效評價。在酶切HEK 293T細胞蛋白樣品時，相同條件下經(jīng)由兩種商品化LA酶切鑒定的肽段數(shù)目及漏切率相近，表明二者酶切效率相當(dāng)，而重組LA在肽段鑒定數(shù)目處于同一水平的基礎(chǔ)上，漏切率略低于兩種商品化產(chǎn)品，表明重組LA的酶切特異性較好(圖6(a、b))。此處由于重組LA漏切率稍低，因此相對而言存在稍多錯切位點，但錯切比例相近(圖6(c))，因此結(jié)果仍符合預(yù)期。綜合考慮下，認(rèn)為純化所得重組LA具有接近商品化產(chǎn)品同等的酶切能力，足夠用于后續(xù)常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。

圖6 (a) pLA與商品化產(chǎn)品(cLA-1、cLA-2)的酶切效率；(b) LA漏切位點(K/R)比例； (c) LA錯切比例；(d) LA酶切乙?；疕EK 293T的漏切率Fig.6 (a) Digestion efficiency of purified LA and commercial LA; (b) Miss cleavage (K/R) rates of LA; (c) Wrong cleavage rates of LA; (d) Miss cleavage rates of LA digesting Acetylated HEK 293T

考慮到LA在賴氨酸位點上的明顯漏切(圖6(b))，通過對蛋白樣品進行賴氨酸乙?；幚韥碜璧KLA在該位點的識別，理論上能夠降低整體漏切率。在同樣使用LA酶切乙?；揎椀腍EK 293T細胞蛋白樣品時，鑒定結(jié)果顯示3種蛋白酶均能在維持相近肽段鑒定數(shù)目的情況下顯著降低漏切率，即識別位點準(zhǔn)確率提高至95%以上，且重組LA在該條件下的酶切效率同樣最好，此時所有漏切位點均為精氨酸(圖6(d))?；谠撍悸罚瑧?yīng)用LA酶切預(yù)處理樣品時對樣品使用乙?；揎椖軌驕p少漏切，從而極大程度地提高酶切效率。

2.4 常見修飾對LA性能的影響

在酶切蛋白樣品的同時，蛋白酶由于能夠識別自身酶切位點從而發(fā)生降解及影響酶切效率，通常利用位點修飾來抑制這一自降解現(xiàn)象[22]。有研究表明將LA活化后對賴氨酸位點進行乙?；揎椖軌蛴行Ы档妥越到獠⑻岣呙盖行蔥23]。

在此基礎(chǔ)上，為檢測常見修飾對LA性質(zhì)的影響，研究中考慮對LA的修飾反應(yīng)進行綜合分析，包括酶原水平的雙甲基化(Dim-LA)、乙?；?Ac-LA)及活化水平的雙甲基化(CaDim-LA)、乙?；?CaAc-LA)修飾(圖7)。

圖7 LA雙甲基化及乙?；揎棽襟EFig.7 Procedure of LA dimethylation and acetylation圖中紅色圓圈及綠色三角分別代表乙?；揎椉半p甲基化修飾后氨基分子結(jié)構(gòu)變化；橙色R代表活化時切割位點(R61、R323)，活化后精氨酸居于首位，α氨基會發(fā)生雙甲基化/乙?；揎?；“+Dim”為雙甲基化修飾，“+Ac”為乙?；揎?。

對修飾后蛋白酶穩(wěn)定性進行分析，SDS-PAGE結(jié)果顯示酶原水平的乙?；揎桳A的活化(act-Ca)產(chǎn)生明顯抑制，同時雙甲基化修飾同樣有一定抑制效果但不明顯，由此首先考慮排除酶原水平的乙?；揎?。對各處理條件下LA的降解程度(37 ℃ 14 h)檢測時發(fā)現(xiàn)，未處理及修飾后蛋白質(zhì)降解程度均相當(dāng)明顯，說明修飾反應(yīng)后的LA仍然具有活性，因此雙甲基化及乙?；揎棇σ种平到鉄o明顯作用(圖8(a))。

此外分別使用4種修飾的LA酶切E.coli蛋白樣品，對酶切效率進行比較時發(fā)現(xiàn)，除已知的活化水平的乙?；揎?CaAc-LA)能夠提升酶切效率外，酶原水平的雙甲基化修飾(Dim-LA)也有相同效果，在鑒定肽段數(shù)目及位點識別準(zhǔn)確度上均優(yōu)于未處理的LA。而活化水平的雙甲基化修飾(CaDim-LA)提升效果并不明顯，酶原水平的乙?；揎?Ac-LA)只是略有提升，這與電泳顯示的活化水平受到抑制相吻合(圖8(b))。綜上，LA酶原水平雙甲基化修飾與活化水平乙酰化修飾均能夠改善酶切效果，該結(jié)果為蛋白酶的性能優(yōu)化提供了有效思路。

圖8 (a) LA修飾后活化及降解程度；(b) LA修飾對酶切效率的影響Fig.8 (a) Activation and degradation degree after LA modification; (b) Effects of LA modification to digestion efficiency

3 討 論

蛋白質(zhì)組學(xué)中根據(jù)酶切位點處于特定氨基酸的羧基端或氨基端，特異性蛋白酶大致分為C端蛋白酶(如胰蛋白酶、LysC、ArgC等)[7-8，24-25]及N端蛋白酶(如LysargiNase、LysN等)[12,26]兩種。LysargiNase屬于N端蛋白酶的一種，最早發(fā)現(xiàn)于嗜乙酸甲烷八疊球菌(MethanosarcinaacetivoransC2A)中，被命名為ulilysin，其分子量僅為38 kDa，且在Ca2+存在下可活化為29 kDa具有酶切活性的成熟蛋白酶[9]。在將第269位半胱氨酸突變?yōu)楸彼岷?，該蛋白酶穩(wěn)定性及酶切特異性大為提高[10]，后續(xù)研究根據(jù)識別酶切位點特性將其改名為LysargiNase并沿用至今[12]。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，LA獨特的酶切位點表明其具備著巨大應(yīng)用潛力，與互為鏡像酶的胰蛋白酶在特定情況下能夠?qū)崿F(xiàn)良好互補。在鑒定翻譯后修飾位點時，若賴氨酸或精氨酸上存在甲基化、對稱或不對稱的二甲基化修飾，胰蛋白酶識別此類位點效果極差，LA卻仍能進行一定程度的切割[13-15]，這為研究蛋白翻譯后修飾提供了有效信息。此外，在鑒定蛋白質(zhì)C末端時，胰蛋白酶酶切產(chǎn)生的C末端肽段由于缺少堿性氨基酸導(dǎo)致其在質(zhì)譜中響應(yīng)較差，鑒定尤為困難；而LA酶切能夠產(chǎn)生以堿性氨基酸(賴氨酸及精氨酸)開頭的肽段，由此為C末端肽段多提供一個單位正電荷，這為質(zhì)譜儀器檢測提供極大便利[19-20]，因此LA在蛋白質(zhì)C末端研究中存在重要價值。

然而相比于廣泛應(yīng)用的胰蛋白酶，商品化LA獲取途徑少，且蛋白酶性能一般，因此首先考慮誘導(dǎo)表達及純化出重組LA以進行組學(xué)應(yīng)用。在條件篩選后，本研究順利在原核表達系統(tǒng)中純化出帶His-tag標(biāo)簽的重組LA酶原，由于酶原穩(wěn)定性較好，而活化后會自行除去His-tag標(biāo)簽，因此直接以酶原形式保存，使用前再進行活化處理。在對純化產(chǎn)物及酶切特異性進行檢測后，結(jié)果初步確認(rèn)了重組LA的可用性。對重組LA的性能分析主要通過與商品化胰蛋白酶及LA的對比來衡量。在目前應(yīng)用的所有特異性蛋白酶中胰蛋白酶對同種樣品的鑒定效果最好，因此重組LA在鑒定肽段及蛋白質(zhì)數(shù)目上與胰蛋白酶存在差距符合預(yù)期，而重組LA與胰蛋白酶鑒定的蛋白質(zhì)重復(fù)度極高，表明兩種蛋白酶在應(yīng)用中存在相互替代的可能。分析胰蛋白酶及重組LA的鑒定結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，雙酶切鑒定結(jié)果相比于單酶切能夠提高氨基酸序列覆蓋度，因此LA能夠輔助胰蛋白酶進行蛋白質(zhì)鑒定。此外，對比商品化產(chǎn)品與重組LA的酶切效果，顯示3種蛋白酶在鑒定數(shù)目及酶切效率上差異不明顯，印證了重組LA具有較好的酶切性能。而對漏切位點進行分析時發(fā)現(xiàn)LA存在較大比例的賴氨酸位點漏切，對蛋白樣品進行乙酰化修飾能夠顯著降低漏切現(xiàn)象，據(jù)此能夠應(yīng)用至末端肽段的鑒定，相比胰蛋白酶鑒定效果顯著[20]。

除對蛋白樣品進行預(yù)處理外，對蛋白酶本身進行修飾改造同樣能夠優(yōu)化性能[22,27]，有研究表明LA活化后進行賴氨酸乙酰化修飾能夠提高其穩(wěn)定性及酶切效率[23,28]。同樣為提升蛋白酶性能，研究中考慮采用條件較溫和的雙甲基化及乙?；揎棧瑢γ冈盎罨骄鲂揎椃治?，除去預(yù)期的活化水平乙酰化修飾，酶原水平的雙甲基化修飾同樣能夠提升酶切效率，只是均未能檢測到蛋白酶自身穩(wěn)定性的提高，原因可能在于蛋白酶自我識別序列上的精氨酸。基于以上結(jié)果，本研究提供了簡便獲取高純度重組LA的純化途徑，并對其應(yīng)用價值進行了綜合分析，后續(xù)在應(yīng)用LA進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析時會做深入研究。