葉調(diào)琴，楊順義，李文平

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，甘肅省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

二斑葉螨(Tetranychusurticae)是一種世界性的農(nóng)牧業(yè)害螨，為害多種作物，如苜蓿、三葉草等。二斑葉螨的成、若螨群集于植物葉背刺吸汁液，受害葉片呈白色失綠斑點，嚴重時枯死。二斑葉螨有體型小，繁殖快，世代短，分布廣和突變率高等特點，加之不合理的使用化學(xué)農(nóng)藥，使其對多種藥劑產(chǎn)生了抗藥性，給現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了嚴重損失[1-2]。

在甘肅地區(qū)二斑葉螨主要危害果樹、蔬菜、農(nóng)作物及牧草，且危害范圍有擴大的趨勢。梁旭東[3]研究發(fā)現(xiàn)蘭州市二斑葉螨中度為害。張廷偉等[4]研究發(fā)現(xiàn)二斑葉螨3個不同蟲口密度下白三葉體內(nèi)葉綠素含量、POD、PPO活性差異顯著(P<0.05)。

三唑錫，化學(xué)名稱為1-(三環(huán)已基甲錫烷基)-1氫-1,2,4-三氮雜茂，是一種廣譜的有機錫類殺螨劑，廣泛用于防治果樹、蔬菜和花卉上發(fā)生的害螨，對柑橘紅蜘蛛(Panonychuscitri)、蘋果全爪螨(P.ulmi)二斑葉螨的防治效果顯著，對抗有機磷農(nóng)藥的螨類有較好的防治效果，可殺滅若螨及成螨，對夏卵也有一定殺滅效果[5-6]。劉敏等[7]研究發(fā)現(xiàn)三唑錫亞致死濃度與土耳其斯坦葉螨(T.turkestani)運動速率成反比。安曉寧等[8]研究發(fā)現(xiàn)20%三唑錫懸浮劑對蘋果紅蜘蛛防效好且對蘋果樹安全。于士將等[9]研究發(fā)現(xiàn)20%四螨嗪·三唑錫懸浮劑對柑桔全爪螨(P.citri)防效較好且對柑桔和天敵安全。

螨類抗藥性的形成與其代謝作用及靶標部位的敏感性密切相關(guān)。螨類主要通過調(diào)節(jié)體內(nèi)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)、羧酸酯酶(CarE)和多功能氧化酶(MFOs)等解毒酶表達量或活性的增加，來提高對藥劑的解毒能力[10]。目前，已有大量研究表明葉螨對多種農(nóng)藥產(chǎn)生抗性，包括神經(jīng)毒素類(如有機磷類、氨基甲酸酯類、擬除蟲菊酯類)、線粒體電子傳遞鏈抑制劑類(噠螨靈)等[11-12]。但三唑錫對葉螨的抗藥性研究報道較少。本文研究了三唑錫亞致死劑量LC10和LC30處理下二斑葉螨體內(nèi)3種解毒酶(CarEs、GSTs和MFOs)酶比活性的變化情況，旨在為深入研究二斑葉螨的抗藥性機制及三唑錫的合理使用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試昆蟲 二斑葉螨敏感品系由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實驗室提供，在室溫(25±1)℃，相對濕度(70±5)%條件下，用新鮮、干凈的豇豆葉片飼養(yǎng)，期間不接觸任何藥劑，連續(xù)繁殖，取雌成螨作供試蟲源。

1.1.2 供試藥劑 20%三唑錫懸浮劑(陜西標正作物科學(xué)有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 室內(nèi)毒力測定及亞致死劑量確立 毒力測定：室內(nèi)毒力測定參照FAO(1980)推薦的玻片浸漬法[16](slide-dip method)并加以改進。取1 cm寬的雙面膠帶剪成1.5 cm長，貼在載玻片的一端，用鑷子揭去雙面膠上的紙片，再用零號毛筆挑取行動活潑的雌成螨，將其背部粘在雙面膠帶上(不能粘住螨足、螨須和口器)，每片粘35頭，分成3行。在溫度(25±1)℃，相對濕度為(70±5)%的智能人工氣候箱中放置1 h后，用雙目鏡觀察，去除死亡和不活潑個體，保留30頭。移取1 mL 20%三唑錫懸浮劑，分別加水稀釋為1、0.66、0.5、0.4、0.33 mg/L等5個濃度，將帶螨載玻片一端浸入藥液中，輕輕搖動5 s后取出，用濾紙吸干螨體周圍多余的藥液，放入鋪有海綿的托盤中，置于溫度(25±1)℃、光周期L∶D=16 h∶8 h、相對濕度為(70±5)%的智能人工氣候箱，24 h后檢查結(jié)果，用筆尖輕觸螨體，以螨足不動者為死亡；試驗重復(fù)3次，以無菌室作為對照，計算出毒力回歸方程，得出LC10與LC30值。

1.2.2 解毒酶系酶液制備 供試螨處理 根據(jù)室內(nèi)毒力測定結(jié)果，以LC10和LC30濃度，采用葉片噴霧法處理二斑葉螨雌成螨，每處理設(shè)3個重復(fù)，以無菌水作對照[14]。噴藥后放置于溫度為(25±1)℃，相對濕度(70±5)%，光周期16 h∶8 h的條件下飼養(yǎng)。將噴藥后的雌成螨分別于3、6、12、24、48 h，每個時間段各挑取100頭活螨置于干凈的1.5 mL離心管中，放置4 ℃冰箱下保存待用。

解毒酶系酶液制備 用零號毛筆分別挑取三唑錫藥劑處理和無菌水處理后的二斑葉螨雌成螨100頭，置于3個1.5 mL離心管中，于4 ℃冰箱冰凍24 h，再分別加入0.04 mol/L pH 7.0磷酸緩沖液、66 mmol/L pH 7.0磷酸緩沖液和0.1 mol/L pH 7.8磷酸緩沖液1.5 mL，用研磨棒于冰水浴中研磨，在10 000 r/min，4 ℃下離心15 min，取上清液備用。

酶源蛋白含量及解毒酶系酶比活性測定：牛血清蛋白、α-萘酚和對硝基苯酚標準曲線制作：參照何恒果[15]的方法。酶源蛋白含量測定：參考Bradford[16]的方法。羧酸酯酶(CarEs)活性測定參考Van Asperen[17]方法；谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSTs)活性測定參考Clark等[18]方法；多功能氧化酶(MFOs)活性測定參考Hansen和Hodgson[19]方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運用新復(fù)極差法(Duncan’s)分析各處理間酶比活力差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 三唑錫毒力測定結(jié)果

三唑錫毒力回歸方程為y=3.959x+1.882，卡方值x2=4.589，相關(guān)系數(shù)R=0.928，LC50值為0.335 mg/L，LC10值為0.159 mg/L，LC30值為0.247 mg/L。

2.2 亞致死劑量三唑錫對二斑葉螨解毒酶比活性的影響

2.2.1 亞致死劑量三唑錫對GSTs酶比活性的影響 三唑錫亞致死劑量LC10處理二斑葉螨后，其體內(nèi)的GSTs在3～6 h和12～24 h酶比活性逐漸升高，6 h達到最高，其余時間段酶比活性下降，整體明顯高于對照；LC30劑量處理后，變化規(guī)律與LC10相似，除24 h酶比活性低于LC10外，其余時間段GSTs活力緩慢升高，在6 h和48 h時達到最大，處理6～12 h酶比活性下降，12 h時達到最低，但酶比活性整體高于對照和LC10(圖1)。

圖1 三唑錫亞致死劑量處理下二斑葉螨體內(nèi)GSTs酶比活性的變化

2.2.2 三唑錫亞致死劑量對CarEs酶比活性的影響 二斑葉螨CarEs酶比活性在LC10劑量下，總體呈上升趨勢，6～12 h酶比活性降低，其余時間段內(nèi)均逐漸增加，至48 h時達到最大，除3 h時低于對照外，其余均高于對照。LC30劑量下整體呈上升趨勢，12～24 h酶比活性降低，其余時間段內(nèi)均逐漸增加，至48 h時達到最大，明顯高于對照和LC10(圖2)。

圖2 亞致死劑量三唑錫處理下二斑葉螨體內(nèi)CarEs酶比活性

2.2.3 三唑錫亞致死劑量對MFOs比活力的影響 二斑葉螨MFOs活力在LC10劑量下總體呈緩慢上升趨勢，在6～12 h和24～48 h升高，至48 h時達最大，除3和24 h時低于對照外，其余時間段內(nèi)均高于對照；在LC30劑量下整體呈下降趨勢，其中在3～6 h時上升較快，而后下降，在6 h時達到最大，除48 h時外，其余時間酶活均高于LC10，且各時間點間差異不顯著。

3 討論

化學(xué)藥劑殺蟲是防治害蟲的最普遍的措施。殺蟲劑除了直接殺滅害蟲外，殘存于環(huán)境中的有效成分也會隨著時間的推移降解至亞致死濃度，引起亞致死效應(yīng)[20]。亞致死劑量殺蟲劑不僅對昆蟲生長發(fā)育、繁殖力及抗性等有影響，也會對其體內(nèi)多種解毒代謝酶產(chǎn)生誘導(dǎo)或抑制作用[24-25]。而亞致死效應(yīng)作為預(yù)測害蟲種群發(fā)生動態(tài)和害蟲抗藥性監(jiān)測的重要手段，其研究主要為體內(nèi)的解毒酶(主要是GSTs、CarEs和MFOs)的比活力變化。

圖3 亞致死劑量三唑錫處理下二斑葉螨體內(nèi)MFOs比活性

本試驗研究了三唑錫亞致死劑量處理二斑葉螨后，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、羧酸酯酶和多功能氧化酶的酶比活性在不同時間點的變化。用LC30和LC10處理二斑葉螨后，其體內(nèi)3種解毒酶LC30處理均高于LC10處理且明顯高于對照組，表明隨著時間的變化藥劑濃度越高酶比活性越高，說明三唑錫對3種解毒酶有抑制作用且濃度越高抑制作用越明顯。這與前人報道的研究結(jié)果一致，如常蕓等[23]通過二斑葉螨經(jīng)乙唑螨腈和聯(lián)苯肼酯亞致死劑量(LC10、LC30)處理后，其體內(nèi)GSTs的酶比活性除乙唑螨腈LC10處理在12 h和24 h、聯(lián)苯肼酯LC10處理在24 h時表現(xiàn)為抑制作用外，其余時間段均較對照高，表現(xiàn)為激活作用。金晶等[24]研究在亞致死劑量苦參堿處理后，二斑葉螨體內(nèi)解毒酶比活性會隨時間發(fā)生改變，但整體上，3大解毒酶的比活性較對照都有所增加。李瑞娟等[25]研究梅嶺霉素和溴蟲腈對二斑葉螨的抗性機理的影響發(fā)現(xiàn)在處理6 h后溴蟲腈對MFO酶活力誘導(dǎo)顯著，并且隨時間的增長酶活力增強，但在處理24～48 h處理組與對照組相比無顯著差異。由此得出二斑葉螨對溴蟲腈的代謝與MFO有關(guān)。楊娟生等[26]研究發(fā)現(xiàn)致死劑量溴蟲腈和毒死蜱亞處理等鉗蠊螨(Blattisociusdentriticus)24 h后、GST細胞色素P450、CarE的酶比活性較對照高且P450的酶比活性明顯高于對照。

綜上所述，本試驗結(jié)果可為研究二斑葉螨的抗藥性機制及三唑錫的合理使用提供前期理論依據(jù)。但試驗僅測定了解毒酶比活性，繼續(xù)探討二斑葉螨對三唑錫的抗性需進行更深入的研究。

4 結(jié)論

本試驗經(jīng)過三唑錫處理二斑葉螨后，發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)GSTs酶比活性在LC30劑量下均高于LC10(除24 h外)和對照。CarEs酶比活性在LC30劑量下均高于LC10和對照。MFOs酶比活性在LC30劑量均高于LC10和對照；LC10劑量處理與LC30劑量處理相一致，均高于對照。說明3種解毒酶的酶比活性的變化與三唑錫的抗性有關(guān)。