崔國峰 劉丹 武軍龍 魏戎 劉瑞宇 王坤正*

1.西安交通大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨與關(guān)節(jié)外科，陜西 西安 710004

2.鄭州大學(xué)附屬洛陽中心醫(yī)院骨科，河南 洛陽 471009

3.西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，陜西 西安710077

軟骨細胞凋亡及炎癥反應(yīng)引起的軟骨損傷是導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)形成的重要原因[1-2]。探討軟骨細胞凋亡在OA發(fā)生發(fā)展中的作用機制，可為OA的預(yù)防及早期治療提供理論基礎(chǔ)。轉(zhuǎn)化生長因子α(transforming growth factor α，TGFα)是一種與OA相關(guān)的生長因子，其通過抑制基質(zhì)合成并促進分解代謝因子的表達在關(guān)節(jié)軟骨細胞中誘導(dǎo)OA樣表型，TGFα可能會成為未來OA治療的新靶點[3]。TGFα基因的rs2862851等位基因可顯著增加膝關(guān)節(jié)OA易感性風(fēng)險[4-5]。生物學(xué)軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)TGFα與miR-183-5p有結(jié)合位點，miR-183-5p與LncRNA NUTM2A-AS1有結(jié)合位點。有研究[6]報道circ_DHRS3能夠通過競爭性靶向miR-183-5p正向調(diào)節(jié)GREM1表達，介導(dǎo)IL-1β作用的軟骨細胞增殖、凋亡和細胞外基質(zhì)降解。沉默NUTM2A-AS1可減輕脂多糖誘導(dǎo)的牙髓細胞凋亡和炎癥[7]。然而NUTM2A-AS1對OA軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及分子機制尚不清楚。白細胞介素-1β(IL-1β)在OA中起重要作用，可誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)[8]。本研究旨在探討NUTM2A-AS1對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響及其分子機制是否與調(diào)控miR-183-5p、TGFα有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料

關(guān)節(jié)軟骨細胞(北京科瑞思搏生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、白細胞介素-1β(IL-1β)(美國Sigma)；Trizol試劑、熒光定量PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)；細胞計數(shù)試劑盒8(CCK-8)、凋亡檢測試劑盒(日本同仁研究所)；RIPA蛋白裂解液、TNF-α、IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒(艾美捷科技有限公司)；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(武漢純度生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細胞處理與分組：將關(guān)節(jié)軟骨細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，用5 μg/L的IL-1β處理軟骨細胞24 h，記為模型組，以正常培養(yǎng)的細胞作為對照組；將miR-183-5p、miR-NC、si-LncRNA NUTM2A-AS1、si-TGFα、si-NC分別轉(zhuǎn)染至軟骨細胞，后經(jīng)IL-1β處理，記為miR-183-5p+模型組、miR-NC+模型組、si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組、si-TGFα+模型組、si-NC+模型組；將pcDNA-TGFα、pcDNA與si-LncRNA NUTM2A-AS1共轉(zhuǎn)染至軟骨細胞，后經(jīng)IL-1β處理，記為pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組、pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組。

1.2.2RT-qPCR檢測LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平：提取各組細胞總RNA，合成cDNA后進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。PCR反應(yīng)體系：2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、10 μL SYBR Green Mix、上下游引物各0.5 μL，7 μL無菌水；循環(huán)條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)；融解曲線：95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，95 ℃ 15 s。

1.2.3蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達：提取細胞總蛋白，取50 μL蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，后轉(zhuǎn)至PVDF膜，5 %脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入TGFα 、CyclinD1、Cleaved-caspase-3-抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜3次后加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h；洗膜3次，顯影，定影，Quantity One測定蛋白條帶灰度值，以β-actin為參照計算其相對表達水平。

1.2.4CCK-8檢測細胞活性：將各組細胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后每孔中加入10 μL CCK-8試劑，孵育2 h后，酶標儀檢測450 nm處吸光度值(A)。

1.2.5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡：收集各組細胞，用預(yù)冷的PBS漂洗2次，與500 μL的結(jié)合緩沖液混勻，加入10 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL的PI，混勻后避光孵育10 min；最后上流式細胞儀檢測。

1.2.6酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測TNF-α、IL-6水平：各組細胞培養(yǎng)48 h后取上清，按照試劑盒操作檢測TNF-α、IL-6水平。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗：將LncRNA NUTM2A-AS1和TGFα的野生型、突變型熒光素酶報告基因載體分別與miR-NC和miR-183-5p共轉(zhuǎn)染至軟骨細胞，按試劑盒說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 RT-qPCR檢測各組細胞中LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平

與對照組比較，模型組LncRNA NUTM2A-AS1、TGFα mRNA表達升高(P<0.05)，miR-183-5p表達降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組LncRNA NUTM2A-AS1、TGFα mRNA表達降低(P<0.05)，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組TGFα mRNA表達降低(P<0.05)，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TGFα mRNA表達降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TGFα mRNA表達升高(P<0.05)，見表1。

表1 RT-qPCR檢測各組細胞中LncRNA NUTM2A-AS1、miR-183-5p和TGFα mRNA的表達水平Table 1 RT-qPCR was used to detect the expression levels of LncRNA NUTM2A-AS1, miR-183-5p and TGFα mRNA in each group of

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組細胞中蛋白表達

與對照組比較，模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達減少(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達降低(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達升高(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TGFα和Cleaved-caspase-3蛋白表達升高(P<0.05)，CyclinD1蛋白表達降低(P<0.05)，見圖1和表2。

表2 Western Blot檢測各組細胞中蛋白表達Table 2 Western Blot was used to detect the protein expression in each group of

2.3 CCK-8檢測各處理組細胞活性

與對照組比較，模型組活性降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組活性升高(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組活性升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組活性升高(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組活性降低(P<0.05)，見表3。

2.4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況

與對照組比較，模型組凋亡率升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組凋亡率降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組凋亡率升高(P<0.05)，見圖2和表3。

表3 CCK-8檢測各處理組細胞活性Table 3 CCK-8 was used to detect the cell viability of each treatment

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細胞TNF-α、IL-6水平

與對照組比較，模型組TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與miR-NC+模型組比較，miR-183-5p+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與si-NC+模型組比較，si-TGFα+模型組TNF-α和IL-6水平降低(P<0.05)；與pcDNA+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組比較，pcDNA-TGFα+si-LncRNA NUTM2A-AS1+模型組TNF-α和IL-6水平升高(P<0.05)，見表5。

表5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細胞TNF-α、IL-6水平Table 5 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the levels of TNF-α and IL-6 in each group of

2.6 LncRNA NUTM2A-AS1通過miR-183-5p調(diào)控TGFα的表達

Starbase預(yù)測顯示LncRNA NUTM2A-AS1與miR-183-5p有結(jié)合位點，miR-183-5p與TGFα有結(jié)合位點(圖3A、3B)。LncRNA NUTM2A-AS1或TGFα野生型報告質(zhì)粒與miR-183-5p共轉(zhuǎn)染后熒光素酶活性降低(P<0.05)，見表6、表7。與si-NC比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1組LncRNA NUTM2A-AS1和TGFα蛋白表達降低，miR-183-5p表達升高(P<0.05)；與si-LncRNA NUTM2A-AS1+anti-miR-NC比較，si-LncRNA NUTM2A-AS1+anti-miR-183-5p組miR-183-5p表達降低，TGFα蛋白表達升高(P<0.05)，見表8、圖3C。

表6 miR-183-5p與NUTM2A-AS1報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性Table 6 Cellular luciferase activity after co-transfection of miR-183-5p with NUTM2A-AS1 reporter

表7 miR-183-5p與TGFα報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后的細胞熒光素酶活性Table 7 Cellular luciferase activity after co-transfection of miR-183-5p with TGFα reporter n=9)

表8 LncRNA NUTM2A-AS1通過miR-183-5p調(diào)控TGFα的表達Table 8 LncRNA NUTM2A-AS1 regulates TGFα expression via n=9)

3 討論

OA是多種因素所致的炎性病癥，軟骨細胞凋亡可直接導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退變甚至鈣化；炎癥在關(guān)節(jié)軟骨退變過程中起重要驅(qū)動作用，其不僅引起軟骨組織細胞外基質(zhì)降解，而且導(dǎo)致軟骨細胞凋亡[9-11]。因此，抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)對防治OA具有重要意義。已有研究[3-5]報道TGFα與OA的發(fā)生有關(guān)，TGFα基因的rs2862851等位基因影響漢族人群膝關(guān)節(jié)OA的易感性，且與其嚴重程度之間呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中TGFα mRNA和蛋白表達水平升高，提示TGFα確實可能與OA進展有關(guān)。TNF-α、IL-6是促炎因子，其可促進炎癥反應(yīng)，加重軟骨破壞損傷[12]；本研究發(fā)現(xiàn)低表達TGFα可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡，抑制TNF-α、IL-6水平，提高細胞活性，這表明低表達TGFα可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進細胞存活，提示TGFα低表達可保護軟骨免受損傷。

為進一步研究TGFα上游可能的分子機制，本研究通過生物學(xué)軟件預(yù)測到TGFα是miR-183-5p的潛在靶基因。IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中miR-183-5p低表達，提示miR-183-5p可能與軟骨細胞損傷有關(guān)。有研究[13]報道骨髓間充質(zhì)干細胞的細胞外囊泡通過攜帶miR-183-5p改善腦神經(jīng)功能，降低腦水含量并抑制炎癥反應(yīng)。miR-183-5p通過負調(diào)節(jié)PTEN來減輕缺血性損傷[14]。miR-183-5p還通過減少凋亡細胞和降低凋亡相關(guān)蛋白水平來減輕心肌缺血/再灌注損傷[15]。說明miR-183-5p具有抑制細胞炎癥反應(yīng)及損傷的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-183-5p可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進細胞存活，提示miR-183-5p可保護IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞免受損傷。此外，本研究證實miR-183-5p可靶向調(diào)控TGFα，提示miR-183-5p可能通過調(diào)控TGFα影響關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)。

表4 流式細胞術(shù)檢測各組細胞凋亡情況Table 4 Flow cytometry was used to detect cell apoptosis in each

研究[16-18]表明lncRNA參與OA的發(fā)病機制，可影響軟骨細胞的增殖、凋亡、炎癥和細胞外基質(zhì)的降解。因此，本研究進一步預(yù)測miR-183-5p可能上游調(diào)控基因，發(fā)現(xiàn)miR-183-5p與LncRNA NUTM2A-AS1有結(jié)合位點。本研究結(jié)果顯示，IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞中LncRNA NUTM2A-AS1表達水平升高，提示LncRNA NUTM2A-AS1可能與OA的進展有關(guān)。已有研究[7]表明沉默NUTM2A-AS1可減輕LPS誘導(dǎo)的牙髓細胞凋亡和炎癥。本研究轉(zhuǎn)染si-RNA來抑制NUTM2A-AS1表達，結(jié)果顯示低表達LncRNA NUTM2A-AS1可抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，促進細胞存活。

此外，本研究證實了LncRNA NUTM2A-AS1可靶向調(diào)控miR-183-5p，低表達LncRNA NUTM2A-AS1可下調(diào)TGFα的表達，且TGFα過表達可逆轉(zhuǎn)LncRNA NUTM2A-AS1低表達對IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞增殖、凋亡及炎癥反應(yīng)的影響，提示LncRNA NUTM2A-AS1可通過miR-183-5p進而調(diào)控TGFα表達影響軟骨細胞損傷。

綜上所述，低表達LncRNA NUTM2A-AS1能夠通過調(diào)控miR-183-5p/TGFα抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞凋亡及炎癥反應(yīng)，促進細胞存活。