唐春閨，鄧兆龍，劉 瓊，金維環(huán)，向世鵬，謝鵬飛，郭紅祥，劉衛(wèi)群

（1. 湖南省煙草公司長(zhǎng)沙市公司，湖南 長(zhǎng)沙 410011；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002）

植物中，CCCH 類鋅指蛋白不僅參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程[1‐2]，同時(shí)也參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的響應(yīng)[3]。植物CCCH 類鋅指蛋白通常包含1～6個(gè)保守CCCH 基序[4]，CCCH 基序最初被定義為CX6～14-C-X4～5-C-X3～4-H（X 代表任意氨基酸）[5]，但后續(xù)在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)了不同于原始分類的CCCH 基序[6]，因此，CCCH 基序被定義為C-X4～15-CX4～6-C-X3～4-H[6]。不同植物包含有相同的CCCH 基序[7]，并且C-X7-8-C-X5-C-X3-H 為最常見的基序[8]。TZF（Tandem CCCH zinc‐finger）蛋白通常包含有串聯(lián)重復(fù)的CCCH 基序[2]，到目前為止，CCCH 蛋白功能研究主要集中在TZF 類蛋白上，非TZF 類CCCH類鋅指蛋白研究較少[2‐3]。

CCCH 類鋅指蛋白在脫落酸（ABA）、赤霉素（GA）等激素介導(dǎo)的信號(hào)通路中發(fā)揮作用[9‐10]。擬南芥中，SOMNUS 蛋白通過調(diào)節(jié)內(nèi)源ABA 和GA 含量從而調(diào)控ABA 和GA 的代謝[11]；AtTZF1、AtTZF4、AtTZF5 和AtTZF6 通過ABA 和GA 信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)高鹽、冷和干旱脅迫的耐受性[12‐13]。OsC3H47 通過降低對(duì)ABA 的敏感性從而增加水稻對(duì)干旱脅迫的耐受性[14]。棉花GhTZF1、水稻OsTZF1 和OsTZF2 、擬南芥AtTZF2 和AtTZF3 都通過茉莉酸（JA）信號(hào)途徑調(diào)節(jié)植物葉片衰老[9，15‐17]。除了激素信號(hào)途徑之外，CCCH 鋅指蛋白還參與其他多種生物和非生物脅迫[3，18]。盡管在擬南芥、水稻等物種中發(fā)現(xiàn)CCCH鋅指蛋白家族基因參與多種脅迫過程，但煙草CCCH 類鋅指蛋白基因家族成員的鑒定、環(huán)境信號(hào)感知以及激素信號(hào)響應(yīng)研究鮮有報(bào)道。鑒于此，運(yùn)用生物信息學(xué)方法，以擬南芥CCCH類鋅指蛋白家族成員蛋白質(zhì)基序?yàn)榛A(chǔ)，在煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行煙草CCCH 類鋅指蛋白家族鑒定，并從系統(tǒng)進(jìn)化、染色體分布、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)、Motif 預(yù)測(cè)等方面分析煙草CCCH 類鋅指蛋白家族成員的特性；同時(shí)，分析家族成員基因NtC3H-39啟動(dòng)子順式作用元件、基因表達(dá)模式以及對(duì)干旱、激素的響應(yīng)，為進(jìn)一步探究CCCH 類鋅指蛋白基因在煙草應(yīng)對(duì)非生物脅迫中發(fā)揮的功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 CCCH類鋅指蛋白基因家族鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從茄科數(shù)據(jù)庫（https://solgenomics.net/）下載普通煙草（Nicotiana tabacum）基因組數(shù)據(jù)（2017 年發(fā)布）并建立本地?cái)?shù)據(jù)庫。利用HMMER 3.0軟件構(gòu)建隱馬可夫模型，通過擬南芥CCCH 類鋅指蛋白基因家族pfam（PF00642）進(jìn)行本地比對(duì)，經(jīng)過在線網(wǎng)站CD-seach（https://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）篩選得到煙草中含CCCH 的序列。利用MEGA 7.0 軟件，采用最大似然法（Maximum likelihood，ML）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（泊松模型，Bootstrap 檢驗(yàn)重復(fù)1 000 次），對(duì)煙草CCCH 類鋅指蛋白基因家族進(jìn)行亞族分類。

1.2 CCCH類鋅指蛋白基因在染色體上的位置、亞細(xì)胞定位以及啟動(dòng)子分析

利用TBtools[19]提取基因組注釋文件中的基因定位信息，并利用其染色體定位可視化功能，展示煙草CCCH 類鋅指蛋白基因序列在染色體上的位置。在煙草數(shù)據(jù)庫中找出Nitab4.5_0004188g0030.1和Nitab4.5_0005411g0020.1（NtC3H-39）基因啟動(dòng)子上游2 000 bp 序列，利用PlantCARE 網(wǎng)站分析其順式作用元件，并利用TBtools工具進(jìn)行可視化處理。

1.3 材料的種植、處理和取樣

將野生型煙草K326 種子播種在育苗盤中，置于光照培養(yǎng)箱（26～28 ℃，相對(duì)濕度70%，光照16 h/黑暗8 h）中培養(yǎng)，至煙苗四葉期時(shí)移入花盆（直徑15 cm，高22 cm）中。在不同生長(zhǎng)時(shí)期，分別取根、葉組織，液氮速凍后放于-80 ℃冰箱中保存，用于后續(xù)分析。

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的野生型K326 煙株進(jìn)行如下處理：對(duì)照組（噴施清水）、生長(zhǎng)素組（噴灑20 mL 0.5 mmol/L 生長(zhǎng)素溶液）、茉莉酸甲酯（MeJA）組（噴灑20 mL 4.0 mmol/L MeJA 溶液）、乙烯利組（噴灑20 mL 4.0 mmol/L 乙烯利溶液）、脫落酸組（噴灑20 mL 4.0 mmol/L ABA 溶液），24 h 后取頂端第2片葉，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定NtC3H-39基因表達(dá)量。

干旱脅迫：選取長(zhǎng)勢(shì)一致的6 株煙草，3 株正常澆水，另外3株停止供水，采取自然干燥法進(jìn)行干燥處理。7 d 后分別取樣，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，用于測(cè)定NtC3H-39基因表達(dá)量。

1.4 煙草NtC3H-39基因表達(dá)分析

采用TRIzol 法提取煙草總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以煙草β-Actin（GenBank：AF126810）作為內(nèi)參基因，使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（BioRad）檢測(cè)NtC3H-39基因表達(dá)情況，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，采用2–ΔΔCt法進(jìn)行基因表達(dá)水平分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草CCCH類鋅指蛋白家族的鑒定

通過本地?cái)?shù)據(jù)庫比對(duì)，從煙草數(shù)據(jù)庫中共獲得213 條包含CCCH 基序的蛋白質(zhì)序列。通過進(jìn)一步結(jié)構(gòu)域篩選，保留E 值<0.01 且包含CCCH 基序的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列，最終得到86 個(gè)蛋白質(zhì)。分析發(fā)現(xiàn)，86 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白中，氨基酸殘基長(zhǎng)度不一，多數(shù)集中在300～800 個(gè)（表1）。目前已鑒定的最短的煙草CCCH 類鋅指蛋白基因序列號(hào)為Nitab4.5_0002783g0030.1，包含148 個(gè)氨基酸殘基；最長(zhǎng)的煙草CCCH 類鋅指蛋白基因序列號(hào)為Nitab4.5_0000753g0060.1，包含1 615 個(gè)氨基酸殘基。大多數(shù)CCCH類鋅指蛋白定位在細(xì)胞核中，少部分定位在葉綠體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上。通過計(jì)算CCCH類鋅指蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)發(fā)現(xiàn)，煙草CCCH 類鋅指蛋白分子質(zhì)量變化較大，分布在16 662.65～176 551.48 u，等電點(diǎn)在4.51～9.43（表1）。

表1 煙草中CCCH類鋅指蛋白基因家族成員Tab.1 The CCCH type zinc-finger proteins in Nicotiana tabacum

續(xù)表1 煙草中CCCH類鋅指蛋白基因家族成員Tab.1（Continued） The CCCH type zinc-finger proteins in Nicotiana tabacum

續(xù)表1 煙草中CCCH類鋅指蛋白基因家族成員Tab.1（Continued） The CCCH type zinc-finger proteins in Nicotiana tabacum

2.2 煙草CCCH類鋅指蛋白分類分析

為了研究CCCH 類鋅指蛋白家族特性，采用最大似然法將比對(duì)出來的86個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析。參照擬南芥分類方法，將86 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白家族中的51 個(gè)蛋白質(zhì)聚類到9 個(gè)亞家族中（Bootstrap值>50%），而位于進(jìn)化樹其他分支的35 個(gè)鋅指蛋白Bootstrap 值<50%，認(rèn)為沒有聚到一個(gè)亞家族中。在這些亞家族中，Ⅰ類亞家族最大，包含11個(gè)蛋白質(zhì)；其次為Ⅹ和Ⅺ亞家族，包含9個(gè)蛋白質(zhì)；最小的家族為Ⅲ亞家族，包含1 個(gè)蛋白質(zhì)（圖1）。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在Ⅰ類亞家族蛋白質(zhì)中，大部分包含5 個(gè)CCCH 基序和6個(gè)CCCH 基序，而在Ⅸ、Ⅹ、Ⅺ類亞家族中的蛋白質(zhì)包含2 個(gè)CCCH 基序，在Ⅵ、Ⅶ類亞家族中的蛋白質(zhì)包含3 個(gè)CCCH 基序，Ⅲ類亞家族只有1個(gè)蛋白質(zhì)，其包含1個(gè)CCCH基序。

圖1 煙草與擬南芥CCCH類鋅指蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic tree of CCCH type zinc-finger proteins in Nicotiana tabacum and Arabidopsis thaliana

2.3 煙草CCCH類鋅指蛋白結(jié)構(gòu)分析

通過對(duì)煙草CCCH類鋅指蛋白家族成員包含的基序數(shù)目進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)煙草中該類蛋白質(zhì)包含的基序?yàn)?～6 個(gè)不等。按照基序拷貝數(shù)目不同，可將煙草CCCH類鋅指蛋白分為6類，其中含有2個(gè)基序數(shù)目的蛋白質(zhì)最多，共包括29 個(gè)蛋白質(zhì)，占蛋白質(zhì)總數(shù)的33.7%；其次為包含1 個(gè)基序的蛋白質(zhì)，共25個(gè)，占蛋白質(zhì)總數(shù)的29.1%；包含6 個(gè)基序的蛋白質(zhì)共2個(gè)（圖2）。

圖2 煙草CCCH類基序Motif鋅指蛋白的統(tǒng)計(jì)特征以及其部分基序的序列標(biāo)識(shí)Fig.2 Characterization of CCCH type zinc-finger proteins and sequence logos for common CCCH zinc finger motifs

根據(jù)半胱氨酸和組氨酸之間間隔的氨基酸數(shù)目不同，可以對(duì)基序進(jìn)一步分類。煙草CCCH 類鋅指蛋白共包含11 類基序（圖2）。與擬南芥和水稻CCCH 類鋅指蛋白一樣，煙草CCCH 類鋅指蛋白家族結(jié)構(gòu)域高度保守。其中，含有CCCH 基序最多的為C-X8-C-X5-C-X3-H，占比57.71%，其次為C-X7-C-X5-C-X3-H，占比20.57%；基序含量第三的為CX5-C-X4-C-X3-H，占比為8.00%，而C-X8-C-X4-CX3-H、C-X5-C-X10-C-X3-H、C-X9-C-X5-C-X3-H、C-X6-C-X4-C-X3-H 以及C-X10-C-X5-C-X3-H 各有2個(gè)，占比均為1.14%。

使用在線工具M(jìn)EME 與TBtools 對(duì)煙草86 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白家族成員蛋白質(zhì)序列進(jìn)行可視化分析（圖3），結(jié)果表明，煙草CCCH 鋅指蛋白共包含10 個(gè)保守的基序，將其命名為Motif1—Motif10。不同Ccch類鋅指蛋白家族成員包含的基序數(shù)目不同，Ⅰ類亞家族主要包含Motif9 和Motif5，Ⅵ包含Motif1、Motif4 和Motif8，Ⅹ類亞家族包含Motif1、Motif2、Motif3 和Motif7，說明不同亞家族基序?yàn)楦叨缺Ｊ亟Y(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)，CCCH 類鋅指蛋白還攜帶其他幾種已知的功能性結(jié)構(gòu)域，包括KH、RRM 和zf-CCCH 等（圖3）。值得一提的是，這些結(jié)構(gòu)在擬南芥、玉米和水稻中也有發(fā)現(xiàn)[6，20]?？梢?，煙草中CCCH 類鋅指蛋白功能可能與擬南芥、玉米和水稻中CCCH類鋅指蛋白功能相似。

圖3 煙草CCCH類鋅指蛋白的結(jié)構(gòu)Fig.3 Schematic structures of tobacco CCCH type zinc-finger proteins

2.4 煙草CCCH類鋅指蛋白基因的染色體定位分析

利用Tbtools 染色體定位可視化功能，展示序列在染色體上的位置。在這86 個(gè)基因中，只有37個(gè)基因定位在17 條染色體上（圖4），在煙草的24條染色體中，最長(zhǎng)的染色體為17 號(hào)染色體，長(zhǎng)度為220 Mb，上面定位1 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白基因，第2長(zhǎng)的染色體為22 號(hào)染色體，上面定位4 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白基因。19 號(hào)染色體上定位的CCCH 類鋅指蛋白基因最多，達(dá)到6 個(gè)，最短的染色體為21 號(hào)染色體，上面定位到了3 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白基因，其中1號(hào)、3號(hào)、10號(hào)、11號(hào)、16號(hào)、18號(hào)以及20號(hào)染色體沒有定位到CCCH類鋅指蛋白基因。

圖4 煙草CCCH類鋅指蛋白基因在染色體上的位置分析Fig.4 Chromosomal location of CCCH type zinc-finger proteins in Nicotiana tabacum

2.5 煙草NtC3H-39蛋白的序列分析

前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，煙草基因NtC3H-39（Nitab4.5_0004188g0030.1）在機(jī)械損傷后表達(dá)量上升（未發(fā)表）。為了進(jìn)一步研究該基因編碼蛋白質(zhì)的功能，以NtC3H-39 蛋白序列構(gòu)建不同物種的進(jìn)化樹，同時(shí)對(duì)該蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、理化特性、亞細(xì)胞定位以及啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析。

通過分析發(fā)現(xiàn)，NtC3H-39 和擬南芥AtC3H39、水稻OsC3H56、玉米ZmC3H56 同源性很高，屬于一個(gè)亞家族（圖5）。該亞家族具備C-X8-C-X5-C-X3-H 基序結(jié)構(gòu)，并且有3 個(gè)重復(fù)基序（圖5）。對(duì)NtC3H-39 序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)包含331個(gè)氨基酸。ExPaSy網(wǎng)站預(yù)測(cè)其編碼蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量為37.7 ku，等電點(diǎn)為8.02；亞細(xì)胞定位（CELLO v.2.5）預(yù)測(cè)表明，該蛋白質(zhì)定位在細(xì)胞核中。

圖5 煙草NtC3H-39蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系及序列分析Fig.5 Phylogenetic relationships and sequence analysis of NtC3H-39

通過對(duì)NtC3H-39啟動(dòng)子進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，煙草NtC3H-39啟動(dòng)子包含有茉莉酸響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、防御和脅迫響應(yīng)元件以及水楊酸響應(yīng)元件（圖6）。NtC3H-39-1（Nitab4.5_0004188g0030.1）與NtC3H-39-2（Nitab4.5_0005411g0020.1）蛋白質(zhì)序列相似度高達(dá)94.86%，并且二者的啟動(dòng)子包含的響應(yīng)元件也非常類似，表明二者在煙草中的生物學(xué)功能可能相似。

圖6 煙草NtC3H-39基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式作用元件Fig.6 Cis-acting elements in the promoter regions of NtC3H-39

2.6 煙草NtC3H-39基因?qū)γ{迫的響應(yīng)

為了進(jìn)一步分析煙草CCCH 亞家族NtC3H-39基因的功能，檢測(cè)了該基因在不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同處理下的表達(dá)情況。結(jié)果如圖7 所示，該基因在煙草不同生長(zhǎng)時(shí)期都有表達(dá)，旺長(zhǎng)期根和葉中表達(dá)量低于幼苗期和成熟期，成熟期根和葉中的表達(dá)量最高，表明NtC3H-39基因參與煙草的發(fā)育過程。

干旱、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯能顯著抑制NtC3H-39基因在葉中表達(dá)，而脫落酸和乙烯利則顯著誘導(dǎo)該基因在葉中表達(dá)；干旱、生長(zhǎng)素、茉莉酸甲酯以及乙烯利能顯著誘導(dǎo)該基因在根中表達(dá)，而脫落酸抑制該基因在根中表達(dá)（圖7）。表明NtC3H-39基因參與植物對(duì)干旱和激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)，該基因在不同部位對(duì)干旱、激素信號(hào)響應(yīng)不一致。

圖7 NtC3H-39在不同生長(zhǎng)時(shí)期以及干旱、生長(zhǎng)素、MeJA、脫落酸、乙烯利脅迫下的表達(dá)Fig.7 Expression of NtC3H-39 in different growth periods and abiotic stress of drought，auxin，MeJA，ABA and ethrel

3 結(jié)論與討論

CCCH 類鋅指蛋白是參與植物生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)生物和非生物脅迫的重要調(diào)節(jié)因子[2‐3]。目前，在多種植物中已經(jīng)完成了對(duì)CCCH類鋅指蛋白基因家族成員的鑒定，如擬南芥中68 個(gè)[6]、水稻中67 個(gè)[6]、玉米中68 個(gè)[20]、甘藍(lán)型油菜中103 個(gè)[7]。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，在煙草中共鑒定到86 個(gè)CCCH 鋅指蛋白家族成員，表明煙草該家族基因多樣化高于擬南芥、水稻、玉米，低于甘藍(lán)型油菜。

86 個(gè)煙草CCCH 類鋅指蛋白氨基酸殘基數(shù)目為148～1 615 個(gè)，分子質(zhì)量分布在16 662.65～176 551.48 u。大多數(shù)CCCH 類鋅指蛋白定位在細(xì)胞核中，少部分定位在葉綠體、細(xì)胞骨架、細(xì)胞質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體上，大多數(shù)CCCH類鋅指蛋白的等電點(diǎn)在4.51～9.43。對(duì)擬南芥和煙草CCCH 類鋅指蛋白家族成員構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，51 個(gè)煙草CCCH 類鋅指蛋白家族成員被聚類到9 個(gè)亞家族中，同一亞族蛋白質(zhì)保守基序較為相似，表明蛋白質(zhì)功能在亞族成員之間高度保守。與擬南芥相比，煙草中包含特有的亞家族成員，如Ⅹ亞家族，表明進(jìn)化中煙草CCCH 類鋅指蛋白基因出現(xiàn)了分化。在染色體定位分析中，只有37 個(gè)CCCH 類鋅指蛋白基因被定位到染色體上，目前煙草基因組注釋不全，可能是造成其他CCCH 類鋅指蛋白基因無法定位的原因。與水稻、玉米以及擬南芥相比，煙草CCCH 類鋅指蛋白基序的種類和數(shù)量上大致相同[6，20]，表明保守的基序起著至關(guān)重要的功能。但煙草也有特有的基序，如C-X6-C-X4-C-X3-H 等，表明不同物種之間的基序也有差異性。

擬南芥中，CCCH 類鋅指蛋白參與植物的發(fā)育[2]、激素響應(yīng)[10‐12]和脅迫反應(yīng)[13‐15]。NtC3H-39 為煙草CCCH 類鋅指蛋白家族成員，該蛋白質(zhì)可能參與對(duì)干旱、ABA、MeJA 等脅迫響應(yīng)[12‐14，16]。實(shí)時(shí)定量PCR 結(jié)果顯示，在煙草不同發(fā)育階段和不同部位，NtC3H-39基因表達(dá)量發(fā)生變化，表明該基因參與煙草發(fā)育過程；同時(shí)，通過干旱和外源激素脅迫處理后，發(fā)現(xiàn)NtC3H-39表達(dá)量發(fā)生顯著變化，表明NtC3H-39參與對(duì)干旱、ABA、生長(zhǎng)素、MeJA 以及乙烯利的響應(yīng)，功能上與擬南芥CCCH 類鋅指蛋白相似。

本研究利用生物信息學(xué)方法對(duì)煙草CCCH類鋅指蛋白基因家族成員進(jìn)行鑒定分析，并對(duì)家族成員NtC3H-39 蛋白進(jìn)行序列和表達(dá)分析，為后續(xù)研究煙草CCCH類鋅指蛋白基因功能提供參考。