葉 泥 ， 顏其貴 ， 王 彬

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 ， 四川 成都 611130)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗稱“豬藍(lán)耳病”，主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、呼吸困難、耳部皮膚發(fā)紺、厭食，懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱仔、木乃伊胎等。根據(jù)基因序列的差異，豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)可以分為2個(gè)基因型：歐洲Ⅰ型和北美Ⅱ型，兩者同源性在60%左右，我國(guó)流行株主要屬于北美Ⅱ型。目前，我國(guó)在防控該病過程中主要以疫苗預(yù)防為主，藥物治療效果往往不佳。中藥作為天然藥物的代表，在治療新型冠狀肺炎中療效十分顯著，充分顯示天然藥物在抗病毒中的巨大潛力。天然藥物具有藥效不易喪失、耐藥性產(chǎn)生較少、副作用較小等特點(diǎn)，部分天然藥物還有提高機(jī)體免疫力的優(yōu)點(diǎn)，其抗病毒作用不僅體現(xiàn)在直接作用于病毒上，還能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，保護(hù)機(jī)體免受病毒損害。中藥在我國(guó)有悠久的歷史，經(jīng)歷此次新冠疫情后，天然藥物研究受到了極大的重視，在天然藥物抗PRRSV的研究中，以體外細(xì)胞試驗(yàn)和豬日糧中添加藥物試驗(yàn)為主，目前選用的細(xì)胞主要是非洲綠源猴腎細(xì)胞(Marc-145細(xì)胞)和豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/2細(xì)胞)，本文對(duì)部分抗PRRSV天然藥物的研究進(jìn)行了整理，希望能為尋找抗PRRSV的新型獸藥提供參考。

1 天然藥物在Marc-145細(xì)胞上抵抗PRRSV感染的作用

1.1 葛根連芩提取液抗PRRSV的作用 葛根芩連湯最早出自《傷寒論》，是經(jīng)典古方之一，主要成分是葛根、甘草、黃芩和黃連，原主治邪熱下痢，在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)應(yīng)用中已遠(yuǎn)超原方之治。在治療細(xì)菌性痢疾[1]、輪狀病毒感染[2]、糖尿病等[3]方面都有良好的效果，此外，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析提示該方對(duì)治療新型冠狀肺炎也有一定效果[4]。汪志等[5]在Marc-145細(xì)胞上研究葛根連芩提取液抗PRRSV的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根連芩提取液1∶250和1∶500倍稀釋時(shí)，對(duì)PRSSV的阻斷作用明顯，但所有設(shè)置的稀釋倍數(shù)對(duì)PRRSV的抑制作用不理想，推測(cè)該藥通過與細(xì)胞膜作用，減弱病毒與受體的結(jié)合能力，增強(qiáng)了細(xì)胞對(duì)PRRSV的抗感染能力。單獨(dú)使用葛根芩連湯的部分成分提取物對(duì)抗PRRSV依然具有效果，曾強(qiáng)等[6]研究甘草粗提物對(duì)PRRSV 突變株(PRRSV PX)感染Marc-145細(xì)胞的作用中發(fā)現(xiàn)，在最大安全質(zhì)量濃度下，甘草粗提物能阻斷、抑制和直接殺滅PRRSV PX(質(zhì)量濃度分別為3.125、0.319 g/L和0.782 g/L)，同時(shí)對(duì)Marc-145細(xì)胞分裂增殖有促進(jìn)效果，且最佳質(zhì)量濃度與試驗(yàn)中板藍(lán)根和魚腥草粗提物濃度一致，都為1.563 g/L，這可能與提取物中的未知生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子有關(guān)。甘草酸是甘草的主要作用成分之一，胡安君等[7]在體外用Marc-145細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸阻斷PRRSV感染是通過減少PRRSV GP4的表達(dá)，降低細(xì)胞CD163和CD151受體的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。CD163是PRRSV感染的主要受體，介導(dǎo)病毒內(nèi)化和宿主細(xì)胞中病毒核酸的釋放，能與PRRSV的重要包膜蛋白GP4在脂筏內(nèi)相互作用[8]，介導(dǎo)病毒入侵細(xì)胞。冼瓊珍等[9]研究發(fā)現(xiàn)，黃連、黃芩水提物對(duì)Marc-145細(xì)胞的最大安全濃度均為1.56 mg/mL，2種藥物對(duì)PRRSV的抑制作用最顯著，直接殺滅作用次之，阻斷作用相對(duì)較弱。藥物抑制作用(先加病毒后加中藥)的機(jī)理可能是病毒先入侵了細(xì)胞并產(chǎn)生破壞，后加入的中藥干擾了細(xì)胞內(nèi)病毒的復(fù)制，抑制病毒增殖和釋放；直接殺滅作用(中藥與病毒同時(shí)加入)則同中藥的生物活性成分與病毒直接結(jié)合破壞病毒結(jié)構(gòu)或與藥物干擾病毒RNA和蛋白質(zhì)的合成有關(guān)；阻斷作用(先加中藥后加病毒)中細(xì)胞先與藥物作用，可能是藥物中的多糖、黃酮類等活性成分增強(qiáng)了細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使細(xì)胞避免了受病毒的吸附而得到保護(hù)，提高了細(xì)胞抗病毒感染的能力。

1.2 龍膽草、苦參堿抗PRRSV的作用 中藥成分復(fù)雜，需明確中藥發(fā)揮作用的有效成分，才能更好的發(fā)展和利用中藥。為探究龍膽草總苷、龍膽草總黃酮及龍膽草水提物在體外抗PRRSV的作用，以Marc-145細(xì)胞為體外模型，利巴韋林為陽性對(duì)照，發(fā)現(xiàn)龍膽草總苷、龍膽草總黃酮及龍膽草水提物對(duì)病毒的阻斷、抑制和直接殺滅作用分別為33.4%、78.2%、81.9%；66.1%、41.1%、42.7%；43.1%、57.4%、56.4%，龍膽草總苷的抑制和直接殺滅作用高于龍膽草總黃酮、龍膽草水提物和陽性對(duì)照利巴韋林。綜合阻斷、抑制和直接殺滅作用的結(jié)果，龍膽草總苷抗PRRSV效果較佳，其次是龍膽草水提物和龍膽草總黃酮[10]。秦楓等[11]運(yùn)用同樣的研究方式得出半邊蓮水提物、半邊蓮總黃酮和半邊蓮總生物堿都具有體外抗PRRSV的作用，其中，半邊蓮總黃酮抗PRRSV的效果最好，半邊蓮水提物的效果最差?？鄥⑹俏覈?guó)傳統(tǒng)藥物之一，其主要活性成分為苦參堿，苦參堿具有抗炎、抗皮膚纖維化、抗免疫抑制等作用，氧化苦參堿能改變細(xì)胞受體和干擾細(xì)胞內(nèi)核酸的合成[12]。趙昕等[13]用Marc-145細(xì)胞于體外研究苦參堿對(duì)PRRSV的復(fù)制抑制、阻斷吸附和直接殺滅作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)苦參堿的最大安全濃度為750 mg/L，在安全濃度范圍內(nèi)對(duì)PRRSV感染Marc-145細(xì)胞的抑制率達(dá)到93.6%，直接殺滅作用的最高抑制率大于95%，表明苦參堿在體外有抗PRRSV的作用和對(duì)PRRSV有直接殺滅作用，但不能阻斷PRRSV對(duì)Marc-145細(xì)胞的吸附。孫盼盼等[14-15]對(duì)苦參堿抗PRRSV的機(jī)制進(jìn)行了探索，發(fā)現(xiàn)在PRRSV感染Marc-145細(xì)胞24 h內(nèi)，苦參堿能顯著降低該病毒N基因的表達(dá)，并且在病毒感染Marc-145細(xì)胞的不同時(shí)間通過抑制不同細(xì)胞受體的表達(dá)來抑制PRRSV吸附和入侵宿主細(xì)胞，從而持續(xù)性抑制PRRSV在細(xì)胞中的復(fù)制，此外，還發(fā)現(xiàn)苦參堿不是通過抑制ERK1/2信號(hào)通路的激活來發(fā)揮抗PRRSV作用的。在研究不同苦參堿和甘草酸組方對(duì)PRRSV的作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，兩者按質(zhì)量比1∶4，組方藥物質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí)，效果最好且使用最安全，增殖抑制和直接殺滅PRRSV的Marc-145細(xì)胞病變抑制率分別為76.95%和83.25%[16]。此外，人參多糖、牛蒡苷元、辣蓼黃酮正丁醇在體外Marc-145細(xì)胞中對(duì)PRRSV都有一定的阻斷、抑制和直接殺滅作用。

1.3 板藍(lán)根、黃芪抗PRRSV的作用 板藍(lán)根具有清熱解毒、涼血消腫的功效，板藍(lán)根多糖是其主要作用成分，具有抗病毒和促進(jìn)免疫等功能。早年的研究證實(shí)，板藍(lán)根對(duì)PRRSV有明顯的阻斷和抑制作用。王學(xué)兵等[17]用水煮醇沉法提取板藍(lán)根多糖，觀察其在體外對(duì)PRRSV的作用效果，發(fā)現(xiàn)阻斷和抑制效果較好，最小阻斷濃度為2.094 μg/mL，最小抑制濃度為8.375 μg/mL。梅春升[18]在Marc-145細(xì)胞上綜合評(píng)判了12種中藥的安全濃度及與豬γ干擾素聯(lián)合用藥抗PRRSV的效果，結(jié)果顯示黃芪、黃芩和板藍(lán)根的治療指數(shù)位于前三，且它們分別與重組的豬γ干擾素聯(lián)合用藥時(shí)具有明顯的協(xié)同作用。劉櫻等[19]的研究發(fā)現(xiàn)，黃芪及其提取物具有較強(qiáng)的抗PRRSV的作用，研究板藍(lán)根、黃芪和青蒿及其提取物體外抗PRRSV作用時(shí)發(fā)現(xiàn)，在最大安全濃度的基礎(chǔ)上，3種中藥單方中黃芪的阻斷作用和直接殺滅作用最強(qiáng)，都能達(dá)到100%的保護(hù)率；中藥提取物中板藍(lán)根多糖對(duì)PRRSV的阻斷作用最強(qiáng)，青蒿素最差，抑制試驗(yàn)中三者作用相當(dāng)，但板藍(lán)根多糖對(duì)病毒不具有直接殺滅作用，綜合3種作用方式得出，3種中藥單方中黃芪效果最好，青蒿最差，提取物中黃芪多糖抗PRRSV作用最好，板藍(lán)根多糖最差。

2 天然藥物在3D4/2細(xì)胞上抵抗PRRSV感染的作用

目前認(rèn)為，PRRSV感染的原發(fā)性靶細(xì)胞是豬肺部巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞通過直接吞噬和分泌淋巴因子而在非特異性免疫中起著十分重要的作用，PRRSV感染后機(jī)體會(huì)出現(xiàn)免疫抑制，有利于病毒在宿主體內(nèi)的傳播，且在豬中能發(fā)生持續(xù)性感染。梁亞俊[20]從金銀花、連翹和板藍(lán)根中分別提取有效成分綠原酸、連翹酯苷A和表告依春，研究以上有效成分對(duì)PRRSV感染3D4/2細(xì)胞的抑制效果，綠原酸、連翹酯苷A和表告依春的最大安全濃度分別為250、125 μg/mL和1 000 μg/mL，在最大安全濃度下都能增加3D4/2細(xì)胞TNF-α和IL-6的分泌并抑制IL-10的分泌；綠原酸和連翹酯苷A還能增強(qiáng)細(xì)胞的吞噬能力[20]。宿主在感染PRRSV后，具有抗病毒活性的TNF-α的表達(dá)被PRRSV抑制[21]，IL-6具有多種免疫調(diào)節(jié)作用和干擾素樣活性，能抑制病毒和抗腫瘤，PRRSV感染的病豬外周血液中的IL-6表達(dá)水平會(huì)增加[22]，IL-10能抑制巨噬細(xì)胞分泌促炎性細(xì)胞因子，造成PRRSV復(fù)制和持續(xù)感染[23]。加入綠原酸、連翹酯苷A和表告依春后，以上細(xì)胞因子表達(dá)量都向有利于細(xì)胞存活方向發(fā)生了改變，增強(qiáng)了細(xì)胞的非特異性免疫，此外，綠原酸、連翹酯苷A和表告依春還具有直接滅活PRRSV和抑制PRRSV引起的細(xì)胞凋亡的作用[20]。

3 天然藥物抗PRRSV的豬體內(nèi)試驗(yàn)

1996年，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所首次從國(guó)內(nèi)的疑似豬繁殖與呼吸綜合征病例中分離出PRRSV。2006年，我國(guó)暴發(fā)了大范圍的高致病性藍(lán)耳病，養(yǎng)豬業(yè)損傷嚴(yán)重。目前，仍沒有針對(duì)該病的特效藥，天然藥物抗PRRSV和提高宿主免疫力的研究中已有部分進(jìn)入豬體內(nèi)試驗(yàn)階段。吳小萍等[21]用PRRSV攻毒健康仔豬后，用姜黃素拌料飼喂仔豬，發(fā)現(xiàn)姜黃素不能降低PRRSV感染引起的溫度升高，也不能誘導(dǎo)抗PRRSV特異性抗體的顯著升高，但能誘導(dǎo)特異性淋巴細(xì)胞增殖，攻毒21 d后可顯著降低病毒血癥水平，顯示姜黃素對(duì)抑制仔豬體內(nèi)的PRRSV有一定的作用，也有體外試驗(yàn)證實(shí)姜黃素是通過誘導(dǎo)血紅素加氧酶-1的表達(dá)來抑制PRRSV復(fù)制的[22]。王惠[23]使用PRRSV弱毒苗免疫后備母豬后，飼喂板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根顆粒配合黃芪多糖、板青顆粒配合黃芪多糖，研究其對(duì)免疫抗體的影響，30 d后檢測(cè)血液發(fā)現(xiàn)，板藍(lán)根顆粒配合黃芪多糖作為免疫調(diào)節(jié)劑效果明顯，能穩(wěn)定抗體水平，降低散毒風(fēng)險(xiǎn)；板藍(lán)根顆粒、板藍(lán)根顆粒配合黃芪多糖能有效降低血液中PRRSV的核酸載量。多個(gè)天然藥物的提取成分對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征疫苗有免疫增強(qiáng)作用，如板藍(lán)根多糖、黃芪多糖、白花蛇舌草多糖、山藥多糖和馬尾藻多糖。嚴(yán)安毓[24]將黃芪多糖、銀黃可溶性粉和板藍(lán)根顆?？茖W(xué)配伍后添加于飼料中給各階段豬食用，發(fā)現(xiàn)其可明顯降低仔豬血液、母豬臍帶血和公豬精液中的帶毒率，降低仔豬發(fā)病率及促進(jìn)保育仔豬生長(zhǎng)和發(fā)育。劉洋[25]、田春雷[26]、袁威[27]在對(duì)復(fù)方中藥“豬康散”(主要成分為金銀花、連翹、板藍(lán)根、黃連、黃芪、黃柏、大黃、白芍、石膏、知母、梔子、甘草)的研究中發(fā)現(xiàn)，其在人工感染PRRSV的仔豬體內(nèi)抗PRRSV的作用表現(xiàn)在如下方面：促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，減少凋亡，提高機(jī)體細(xì)胞免疫能力；提高血清和組織抗氧化功能，以清除自由基、改善機(jī)體功能，提高抗PRRSV的能力；明顯提高血清中免疫球蛋白和細(xì)胞因子水平，增強(qiáng)機(jī)體特異性免疫功能，而達(dá)到抗PRRSV的作用。除豬體內(nèi)試驗(yàn)外，蔡丙嚴(yán)等[28]通過給SD大鼠飼喂野大黃，分離其含藥血清，用于研究含藥血清在體外對(duì)PRRSV的抑制作用發(fā)現(xiàn)，含野大黃的血清有抑制和直接殺滅PRRSV的功效。

近些年，通過體外和體內(nèi)研究中藥/復(fù)方/中獸藥制劑對(duì)PRRSV作用的研究較多，如冼瓊珍等[9,29]先后研究了26種中藥對(duì)PRRSV的阻斷、抑制、直接殺滅作用，表1中整理了部分抗PRRSV的藥物。

表1 抗豬繁殖與呼吸綜合征病毒的有效中藥/復(fù)方/中獸藥制劑

4 展望

我國(guó)天然藥物資源豐富，同時(shí)也是中藥的發(fā)源國(guó)，可作為抗病原微生物天然藥物的篩選庫，在許多著作中都有應(yīng)用天然藥物預(yù)防和治療人和動(dòng)物疾病的記錄。在探索天然藥物治療豬繁殖與呼吸綜合征的過程中，雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種藥物有抗PRRSV和提升機(jī)體免疫力的作用，但中藥的成分復(fù)雜，有效成分、抗PRRSV機(jī)制、配伍禁忌、最佳劑量等資料尚不全面，皆可作為今后研究的方向。