藺豆豆，琚澤亮，柴繼寬，趙桂琴

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院，草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070）

青藏高原是我國(guó)主要牧區(qū)之一，氣候嚴(yán)酷，暖季短暫、冷季漫長(zhǎng)，枯草期長(zhǎng)達(dá)7個(gè)月之久。冷季氣溫大幅度下降，使家畜在暖季放牧中增加的體重及營(yíng)養(yǎng)被大量消耗，加之冷季飼草料供給不足，使老、弱、病畜難以安全越冬，形成“夏壯、秋肥、冬瘦、春死”的惡性循環(huán)，成為制約青藏高原畜牧業(yè)發(fā)展的主要因素［1］。人工種草是解決這一問(wèn)題的有效途徑［2］。燕麥（Avena sativa）對(duì)青藏高原高寒氣候有獨(dú)特的適應(yīng)能力，具有易種植栽培、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)等優(yōu)點(diǎn)，是該地區(qū)人工種草的首選草種，對(duì)緩解家畜季節(jié)性飼草緊缺、防止冬季掉膘、促進(jìn)當(dāng)?shù)夭莸匦竽翗I(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。燕麥可曬制成青干草，也可生產(chǎn)青貯。但該地區(qū)草產(chǎn)品加工機(jī)械化程度低，技術(shù)手段落后，調(diào)制燕麥干草仍采用自然晾曬的方式，青藏高原地區(qū)秋季多雨，曬制青干草受天氣影響很大，營(yíng)養(yǎng)損耗較多，因此更適于青貯，在灌漿至乳熟期刈割，稍加晾曬含水量即可達(dá)到青貯要求［3］。調(diào)制青貯受天氣影響小、生產(chǎn)的草產(chǎn)品適口性好、最大限度保留了飼草的營(yíng)養(yǎng)，適宜在青藏高原及周邊海拔較高、收獲季節(jié)多雨的冷涼地區(qū)推廣應(yīng)用，也是長(zhǎng)期保存飼草料的一種方式［4-6］。

一般情況下，低海拔地區(qū)飼草青貯發(fā)酵在40～45 d 即可完成，而青藏高原地區(qū)牧草多在8月底至9月收獲，這時(shí)最高氣溫已降至 15～18 ℃左右，且晝夜溫差非常大［7］，進(jìn)入 10月后氣溫更低。Liu 等［8］發(fā)現(xiàn) 10 ℃下柱花草（Stylosanthes guianensis）青貯料中乳酸含量較30 °C 降低了61.11%，乙酸含量下降了63.91%，好氣性細(xì)菌數(shù)量增加了83.72%。玉米（Zea mays）在不同溫度（5、10、15、20 和25 ℃）下的青貯，pH 下降速度隨溫度降低而顯著減緩，發(fā)酵 30 d 后，5 ℃下青貯料的 pH 仍為 5.0［9］。垂穗披堿草（Elymus nutans）在 5 ℃下青貯 60 d 后 pH 值為 6.08，乳酸含量為0.34%，基本無(wú)青貯效果；在15 ℃下青貯60 d 后pH 值降至5.68，乳酸含量?jī)H為1.44%，發(fā)酵程度較低［7］。在青藏高原高寒牧區(qū)，由于秋冬季氣溫很低，完成青貯發(fā)酵所需的時(shí)間明顯增加，燕麥與箭筈豌豆（Vicia sativa）混播捆裹青貯要80 d 才能完成發(fā)酵，較長(zhǎng)的發(fā)酵時(shí)間增加了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的流失［10］。添加外源乳酸菌可促進(jìn)青貯發(fā)酵，但一般乳酸菌適宜生長(zhǎng)溫度為20～37 ℃［10-11］，市售乳酸菌添加劑的適宜溫度遠(yuǎn)高于青藏高原的氣溫，因此在低溫發(fā)酵中收效甚微［12］。要想盡快完成發(fā)酵，就需要添加低溫下活性較高的耐低溫乳酸菌。目前市場(chǎng)上未見(jiàn)此類乳酸菌制劑，但已有相關(guān)研究報(bào)道。崔棹茗等［13］發(fā)現(xiàn)，青藏高原乳酸菌具有耐低溫、耐酸和耐鹽性強(qiáng)等特性。保安安［14］從不同地區(qū)不同發(fā)酵階段的垂穗披堿草青貯料中也分離得到6 株產(chǎn)酸和耐低溫能力強(qiáng)的優(yōu)異菌株。陳明霞等［15］通過(guò)限制性培養(yǎng)方法篩選得到3 株耐低溫乳酸菌并成功應(yīng)用于黑麥草（Lolium multiflorum）低溫青貯。從不同溫度和發(fā)酵階段的垂穗披堿草青貯料中也分離得到耐低溫的清酒乳桿菌、植物乳桿菌和戊糖片球菌［7］。由此可見(jiàn)，從植物生長(zhǎng)地采集和分離適應(yīng)環(huán)境的乳酸菌是可行的。

燕麥作為青藏高原地區(qū)主要的青貯原料，在青貯生產(chǎn)中面臨秋冬氣溫低、發(fā)酵緩慢、營(yíng)養(yǎng)損耗嚴(yán)重等問(wèn)題［10，16］，能否在其生產(chǎn)地分離得到耐低溫的乳酸菌，用于促進(jìn)低溫發(fā)酵，目前尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)擬收集青藏高原不同海拔區(qū)燕麥植株附著乳酸菌資源，分析其耐低溫和低pH 及產(chǎn)酸能力，篩選具有促進(jìn)燕麥低溫發(fā)酵的潛力菌株，以期為發(fā)掘和利用青藏高原本土特有乳酸菌資源、改善燕麥低溫青貯發(fā)酵品質(zhì)和促進(jìn)優(yōu)質(zhì)燕麥青貯生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 采樣點(diǎn)地理信息

在甘肅省天祝抓喜秀龍鄉(xiāng)、山丹軍馬二場(chǎng)、甘南州合作市那吾鄉(xiāng)、甘南州瑪曲縣歐拉鄉(xiāng)，青海省西寧市湟中縣魯沙爾鎮(zhèn)、海北州海晏縣西海鎮(zhèn)、果洛瑪沁縣大武鎮(zhèn)、玉樹(shù)稱多縣清水河鎮(zhèn)共8個(gè)地點(diǎn)進(jìn)行采樣。各樣點(diǎn)的地理信息見(jiàn)表1。

表1 采樣點(diǎn)地理信息Table 1 Geographical information of sampling sites

1.2 樣品采集

于2020年8-9月在8個(gè)不同海拔區(qū)，采集處于開(kāi)花至灌漿期的燕麥材料，裝于提前滅菌的樣袋，低溫保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后在無(wú)菌環(huán)境下裝入1 L 無(wú)菌聚乙烯瓶中密封，室溫條件下進(jìn)行青貯發(fā)酵，經(jīng)3 和60 d 青貯發(fā)酵后用于乳酸菌的采集、分離、篩選和鑒定。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的采集、分離與純化 在無(wú)菌環(huán)境中分別稱取青貯3 和60 d 后的燕麥青貯料10 g，放入錐形瓶中，加入90 mL 無(wú)菌生理鹽水，置于搖床上振動(dòng)（轉(zhuǎn)速120 rpm·min-1）2 h，用無(wú)菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，取3個(gè)適宜梯度涂板，每個(gè)梯度3個(gè)重復(fù)。在葡萄糖酵母膏蛋白胨培養(yǎng)基（glucose yeast extract peptone medium，GYP）（葡萄糖10 g，酵母提取物5 g，蛋白胨5 g，乙酸鈉2 g，吐溫805 mL，碳酸鈣5 g，氯化鈉5 g，鹽溶液5 mL，瓊脂15 g，溴甲酚紫0.04 g，蒸餾水1000 mL，pH=6.8）上對(duì)乳酸菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后進(jìn)行菌落挑選和分離。根據(jù)菌落大小、顏色、光澤、形狀和是否具有透明環(huán)等特征采集單菌落。在MRS 培養(yǎng)基（蛋白胨10.0 g，牛肉粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母粉4.0 g，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.2 g，檸檬酸三銨2.0 g，硫酸錳0.05 g，吐溫801 mL，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH：6.2±0.2）上劃線培養(yǎng)（37 ℃，1 d），重復(fù)劃線分離培養(yǎng)3次，獲得純化的單菌株。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察、過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，初步認(rèn)定革蘭氏染色陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶陰性的菌株為乳酸菌［17］。利用MRS 液體培養(yǎng)基（不加瓊脂）進(jìn)行富集（37 ℃，1 d）后加入等體積甘油（40%），分裝后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將低溫保存?zhèn)溆玫木昕焖倭魉鈨?，置于MRS 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)（37 ℃，1 d），進(jìn)行2 次傳代培養(yǎng)后，離心收集菌體，采用比濁法加入生理鹽水調(diào)制菌液濃度為108 cfu·mL-1。

1.3.2 耐低溫乳酸菌篩選 在MRS 液體培養(yǎng)基中接種活化菌株，接種量為3%，分別在20、15、10 和5 ℃恒溫培養(yǎng)，其中5 ℃下培養(yǎng)10 d，10 和15 ℃下培養(yǎng)7 d，20 ℃下培養(yǎng)5 d，分析乳酸菌對(duì)溫度的適應(yīng)能力。配制含3.0%和6.0% NaCl 的MRS 液體培養(yǎng)基，接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃培養(yǎng)3 d，分析乳酸菌的耐鹽能力。用HCl溶液將 MRS 液體培養(yǎng)基 pH 分別調(diào)至 3.0、3.5、4.0、4.5 和 5.0，接種活化菌株，接種量為 3%，37 ℃培養(yǎng) 3 d，分析乳酸菌的耐酸性［18］。

將滅菌MRS 液體培養(yǎng)基分裝，每試管5 mL，倒置放入杜氏小管，接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃下培養(yǎng)3 d，觀察是否產(chǎn)氣。MRS 液體培養(yǎng)基中接種活化菌株，接種量為3%，37 ℃下培養(yǎng)30 h，每隔5 h 取樣一次，測(cè)定培養(yǎng)液的pH 值，分析乳酸菌菌株的產(chǎn)酸速率。同時(shí)，以培養(yǎng)液為對(duì)照，測(cè)定樣品在600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值（optical density value，OD 值），分析乳酸菌的生長(zhǎng)速度［19］。

1.3.3 耐低溫乳酸菌的鑒定 利用16S rDNA 基因序列同源性分析方法進(jìn)行菌種的初步鑒定。將活化的菌株在MRS 培養(yǎng)基中富集培養(yǎng)24 h 后離心收集菌體，參照生工Bacteria DNA Ki（t上海生工生物科技有限公司）試劑盒使用說(shuō)明提取 DNA，進(jìn)行 16S rDNA 擴(kuò)增，引物序列為：27f（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492r（5′-TACCTTGTTACGACT-3′），由上海生工生物科技有限公司合成。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PCR Master Mix，上下游引物各 1 μL，DNA 模板 1 μL，9.5 μL ddH2O，總體積為 25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性 5 min；94 ℃變性 30 s，51 ℃退火 45 s、72 ℃延伸 1 min，30個(gè)循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。取 5 μL PCR 產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠上電泳以檢測(cè)目的條帶。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物科技有限公司測(cè)序。

將乳酸菌菌株 16S rDNA 基因序列用 BLAST（basic local alignment search tool，http：//blast. ncbi. nlm. nih.gov/blast.cgi）在GenBank 中搜索，與待測(cè)菌株相似性最高的已知分類地位的菌種比對(duì)，初步確定待測(cè)菌株的屬種。然后從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中下載已知乳酸菌菌株的16S rDNA 基因序列，用Clustal X 進(jìn)行序列比對(duì)后，用MEGA 5.0 的Neighbor-joining 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)行2000 次Bootstrap 檢驗(yàn)。結(jié)合API 50 CHL 發(fā)酵試劑盒（BioMérieux，法國(guó)），按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定不同菌株的碳源利用差異，鑒定菌種。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步整理，采用SPSS 21.0 軟件對(duì)不同菌株測(cè)定指標(biāo)進(jìn)行單因子ANOVA 模型分析，結(jié)合Duncan 法進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。試驗(yàn)誤差以平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤（standard error of mean，SEM）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離純化及耐低溫菌株篩選

通過(guò)挑選GYP 培養(yǎng)基上有黃色溶菌環(huán)的菌株，初步獲得232 株乳酸菌。對(duì)初獲菌株進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢觀察和過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)，篩選出56 株乳酸菌。將其分別在 5 ℃培養(yǎng)10 d、10 和 15 ℃培養(yǎng) 7 d，20 ℃培養(yǎng)5 d，根據(jù)生長(zhǎng)情況進(jìn)行篩選，得到18 株耐低溫乳酸菌菌株（表2）。

表2 燕麥青貯中分離的乳酸菌信息Table 2 Information of lactic acid bacteria isolated from oat silage

2.2 耐低溫乳酸菌生理特性分析

分離篩選的18 株耐低溫乳酸菌生理特性如表3所示。所有乳酸菌菌株均為革蘭氏陽(yáng)性、過(guò)氧化氫酶促陰性細(xì)菌。其中，OLP1、OCLB7、OCWC8和 OCWC9為異型發(fā)酵乳酸菌，OCEF2、OCPP3、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77、OL122、OL194和 OL205為 同 型 發(fā) 酵 乳 酸 菌 。 OCEF2、OCPP3、OL36、OL77和 OL205為球菌，OLP1、OCLB7、OCWC8、OCWC9、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194為桿菌。

OL205菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL19 4菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL122菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL77菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL54菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL36菌 型mo球ccus Co 同Ho +--OL25菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL8菌 型mo桿Bacillus同Ho +--OL3菌 型mo桿Bacillus同Ho +--WC9菌 型OC 桿Bacillus異Hetero+-+WC8菌 型OC 桿Bacillus異Hetero+-+L B7 OC 菌 型桿Bacillus異Hetero+-+L F6 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--L P5 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--acteria strains LF4 OC 菌 型mo桿Bacillus同Ho +--P P3 OC 菌 型mo球ccus Co 同Ho +--cid b EF2 ccus菌 型mo OC 球Co 同Ho +--征8 lactic a Bacillus菌Hetero P1型+-+OL特f 1桿 異se菌e cs o的p o ++ ++++W ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++ ++ ++++W ++++ ++ +++++ ++++ ++ ++++W ++++e. ++ +++++ ++++ositiv ++ ++++W ++++eakly p eans w ++ +++++ ++++。性陽(yáng)e；“W”m ++ ++++W ++++弱示ativ eg ++ +++++ ++++eans n性陰cteristi 示酸，“-”e；“-”m aracteristics乳tation ty Catalase c lu m g 表ositiv s p Gas fro性低ra stain en Ch℃）陽(yáng)溫ble 3 C Ferm 8 株e 色表Gram耐ha酶erature（ap 氣+”+”mean表征Sh 3 1型 染氫產(chǎn)化類氏糖Temp蘭表Ta 狀 酵 氧萄，“W”0%0%特pH5.050度形NaCl發(fā)過(guò)3.葡6.05革4.4.3.3.示溫2015105：“te：“注No

18 株乳酸菌都能在3.0%和6.0% NaCl 條件下穩(wěn)定生長(zhǎng)，具有良好的耐鹽性（表3），其在pH 為3.0～5.0 條件下也生長(zhǎng)良好，尤其是 OLP1、OCPP3、OCLP5、OCLB7、OL3、OL8、OL36、OL54、OL77和 OL122在 pH 為 3.0 的條件下仍可良好生長(zhǎng)，表明其對(duì)酸性環(huán)境的適應(yīng)性更強(qiáng)。由于同型乳酸菌產(chǎn)酸效率更高，造成的干物質(zhì)損失更小，因此，選取 14 株同型發(fā)酵乳酸菌（OCEF2、OCPP3、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77、OL122、OL194和OL205）測(cè)定產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速度。

由表 4 可知，培養(yǎng) 5 h 后，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的產(chǎn)酸速度較快，pH 均降至4.7 以下，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。培養(yǎng) 10 h 后，菌株 OL77產(chǎn)酸最快，pH 降至 3.74，其次為 OL3和 OL25，pH降至 3.79。菌株 OCEF2、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL194和 OL205產(chǎn)酸引起的 pH 值降幅加大。培養(yǎng) 15 h 后，菌株OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的 pH 降至 3.8 以下，顯著低于其他菌株（P＜0.05）。培養(yǎng) 20 h后，所有菌株的pH 值變化均趨于平緩，在30 h 后所有菌株的pH 值均降至4.2 以下，最低的為菌株OL8，pH 為3.61，其次為 OL77和 OL54，pH 均為 3.62。

表4 供試乳酸菌的產(chǎn)酸速率Table 4 Acid production rate of tested lactic acid bacteria

供試菌株的生長(zhǎng)速度呈現(xiàn)出和產(chǎn)酸速率類似的規(guī)律（表 5）。培養(yǎng) 0～5 h，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和OL122處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD 值迅速上升，均大于1.60（P＜0.05），其他菌株的生長(zhǎng)在起始階段較為遲滯。5～10 h，菌株 OCEF2、OCLF4、OCLP5、OCLF6、OL194和 OL205的生長(zhǎng)速度增加，OD 值上升，平均為 1.68。10～25 h，所有菌株的生長(zhǎng)速度開(kāi)始放緩，仍以菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122的繁殖量較高（P＜0.05）。培養(yǎng) 25 h 后，菌株 OL77的 OD 值在所有培養(yǎng)菌株中最高，達(dá)2.52，其次為OL54，為2.50。培養(yǎng)30 h 后所有菌株均未出現(xiàn)明顯衰退。

表5 供試乳酸菌的生長(zhǎng)速率Table 5 Growth rate of tested lactic acid bacteria

2.3 耐低溫乳酸菌的分子鑒定

結(jié)合表6 和圖1 可知，菌株OLP1與類谷糠乳桿菌（Lactobacillus parafarraginis）處于同一族群，進(jìn)化親緣度100%，與對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)菌株序列相似性為99.73%。菌株OCEF2與屎腸球菌（Enterococcus faecium）處于同一族群，進(jìn)化親緣度98%，序列相似度為97.94%。OCPP3、OL36、OL77和 OL205與戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）處于同一族群，進(jìn)化親緣度98%，且與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列相似度達(dá)97.99%以上。菌株OCLF4和 OCLF6與香腸乳桿菌（Lactobacillus farciminis）處于同一族群，進(jìn)化親緣度為96%，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列相似度分別為99.51%和98.72%。OCLP5與類食品乳桿菌（Lactobacillus paralimentarius）和消化乳桿菌（Lactobacillus alimentarius）處于同一族群，進(jìn)化親緣度為89%，與標(biāo)準(zhǔn)菌株的序列相似度為98.43%。OCLB7與布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）處于同一族群，進(jìn)化親緣度為100%，序列相似度99.46%。OCWC8和OCWC9與魏氏乳桿菌聚在同一族群中，進(jìn)化親緣度為100%，與標(biāo)準(zhǔn)菌株16S rDNA 基因序列相似度達(dá) 99% 以上。菌株 OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）和 類植物 乳桿 菌（Lactobacillus paraplantarum）聚為一個(gè)族群，進(jìn)化親緣度為 100%，其中，菌 株 OL3、OL54、OL122和 OL194的16S rDNA 基因序列與植物乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度均大于戊糖乳桿菌，而菌株OL8和OL25與植物乳桿菌和戊糖乳桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的相似度一致，但僅根據(jù)這一結(jié)果尚難鑒定到種水平。

圖1 篩選菌株及相關(guān)菌種的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of screened lactic acid bacteria strains and related species

表6 乳酸菌菌株的16S rDNA 基因序列分析Table 6 Analysis of 16S rDNA gene sequences of lactic acid bacteria

篩選的18 株耐低溫乳酸菌可初步分為9 種，反映了燕麥附生乳酸菌類群的豐富性。結(jié)合之前的產(chǎn)酸速率及生長(zhǎng)速度試驗(yàn)，菌株 OCPP3、OL3、OL8、OL25、OL36、OL54、OL77和 OL122生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酸速率高。因此，對(duì)這8個(gè)菌株進(jìn)行糖發(fā)酵特性研究。

2.4 8個(gè)優(yōu)選菌株的糖發(fā)酵特性分析

從表7 可知，8個(gè)菌株均能發(fā)酵的糖有L-阿拉伯糖、核糖、半乳糖、D-葡萄糖、D-果糖、D-甘露糖、甘露醇、山梨醇、N-乙酰-葡萄糖胺、苦杏仁苷、熊果苷、七葉靈、水楊苷、纖維二糖、麥芽糖、乳糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、松三糖、β-龍膽二糖和葡萄糖酸鹽，共22 種。均不能發(fā)酵的糖有赤蘚糖醇、D-阿拉伯糖、L-木糖、阿東醇、L-山梨糖、半乳糖醇、肌糖、淀粉、肝糖、木糖醇、D-來(lái)蘇糖、D-海藻糖、L-巖藻糖、L-阿拉伯糖醇、2-酮基-葡萄糖酸鹽和5-酮基-葡萄糖酸鹽，共16 種。

表7 8個(gè)優(yōu)選菌株的糖發(fā)酵特性Table 7 Sugar fermentation profiles of 8 lactic acid bacteria strains

續(xù)表Continued Table

除此之外，菌株 OCPP3、OL36和 OL77均能發(fā)酵 D-木糖、D-棉籽糖、D-塔格糖，均不能發(fā)酵β-甲基-木糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、D-松二糖和D-阿拉伯糖醇。菌株OL3和OL54均能發(fā)酵D-木糖、β-甲基-木糖苷、鼠李糖、胰島素、D-松二糖和D-塔格糖，均不能發(fā)酵α-甲基-D-甘露糖苷、α-甲基-D-葡萄糖苷、D-棉籽糖和D-阿拉伯糖醇。菌株OL8、OL25和 OL122均能發(fā)酵 α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖和 D-阿拉伯糖醇，均不能發(fā)酵 D-木糖、β-甲基-木糖苷、鼠李糖、胰島素和D-塔格糖。

結(jié)合伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)和前人研究結(jié)果，戊糖乳桿菌可以發(fā)酵D-木糖和鼠李糖，植物乳桿菌不能發(fā)酵鼠李糖；植物乳桿菌能利用α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖，而戊糖乳桿菌不能利用α-甲基-D-甘露糖苷和D-棉籽糖［18］。因此將菌株OL3和OL54鑒定為戊糖乳桿菌，菌株OL8、OL25和OL122鑒定為植物乳桿菌。

3 討論

青貯過(guò)程受溫度影響比較大，青貯時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)尤為明顯［13］。低溫會(huì)抑制微生物的活動(dòng)和繁殖，延長(zhǎng)青貯發(fā)酵時(shí)間。燕麥附著乳酸菌數(shù)量在高海拔地區(qū)均低于105 cfu·g-1，難以快速啟動(dòng)乳酸發(fā)酵［20］。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，可溶性糖（water soluble carbohydrate，WSC）含量由于乳酸菌的消耗而顯著降低，芽孢桿菌及酵母菌等對(duì)青貯原料中較難利用的物質(zhì)如纖維等具有較強(qiáng)的降解能力，使青貯原料中可溶物質(zhì)增加，營(yíng)養(yǎng)流失加劇。適宜的添加劑可促進(jìn)發(fā)酵進(jìn)程并改善青貯發(fā)酵品質(zhì)，在氣溫偏低、青貯發(fā)酵緩慢的高寒地區(qū)，添加劑的使用更具有重要意義。Zhang 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照菌株相比，在5 ℃下給小麥（Triticum aestivum）秸稈（干物質(zhì)含量32%）接種篩選的耐低溫植物乳桿菌，青貯發(fā)酵30 或60 d 后，可以顯著改善青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)。15 ℃條件下，添加3 株耐低溫乳酸菌均可促進(jìn)黑麥草的發(fā)酵，降低pH 值，減少蛋白質(zhì)或氨基酸的分解，發(fā)酵品質(zhì)顯著提高［21］。因此，從高海拔地區(qū)燕麥附生乳酸菌種群中篩選生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)酸能力強(qiáng)的耐低溫菌株，用于促進(jìn)當(dāng)?shù)匮帑湹蜏厍噘A發(fā)酵是可行的。

在青貯發(fā)酵中，約有20 多種乳酸菌起作用，可分成同型發(fā)酵乳酸菌和異型發(fā)酵乳酸菌兩大類，其代謝過(guò)程差異較大，作用也不盡相同［22］。多數(shù)研究結(jié)果表明，同型發(fā)酵乳酸菌在產(chǎn)生乳酸和改善青貯飼料品質(zhì)方面比異型發(fā)酵乳酸菌更有效［23］；異型乳酸菌則更有利于提高有氧穩(wěn)定性［22］。本研究中，通過(guò)對(duì)不同海拔地區(qū)燕麥青貯乳酸菌的分離篩選，獲得18 株耐鹽、耐酸和耐低溫乳酸菌資源，其中OLP1、OCLB7、OCWC8和OCWC9為異型發(fā)酵乳桿菌，OCEF2、OCPP3和OCLF4等14 株為同型發(fā)酵乳桿菌，為燕麥低溫青貯乳酸菌資源利用提供了基礎(chǔ)材料。4 株異型發(fā)酵乳桿菌均來(lái)自發(fā)酵60 d 的燕麥青貯料，說(shuō)明燕麥自然發(fā)酵后期異型乳酸菌可能成為主導(dǎo)菌株。這與Zhou 等［9］的研究結(jié)果類似，玉米在不同溫度下自然青貯，在20 和25 ℃下，植物乳桿菌和戊糖片球菌在1 d 內(nèi)占據(jù)優(yōu)勢(shì)，7 d 后異型發(fā)酵菌布氏乳桿菌開(kāi)始出現(xiàn)，并最終占據(jù)主導(dǎo)地位；15 ℃可能是布氏乳桿菌生長(zhǎng)的溫度下限。盡管如此，在低于15 ℃的溫度下發(fā)酵60 d 后，其他異型發(fā)酵乳酸菌仍在乳酸菌種群中占主導(dǎo)地位。本研究中，異型發(fā)酵乳桿菌包括類谷糠乳桿菌、布氏乳桿菌和魏氏乳桿菌，反映了燕麥自然青貯發(fā)酵后期異型發(fā)酵乳酸菌種類的豐富性。而菌株OCLB7（布氏乳桿菌）可以在低于15 ℃的環(huán)境中生長(zhǎng)，可見(jiàn)青藏高原極端環(huán)境中分離出的乳酸菌對(duì)低溫的適應(yīng)能力更強(qiáng)。

不同細(xì)菌種類16S rDNA 基因在功能和進(jìn)化上具有同源性，基因序列變異頻率緩慢，因此在整體序列結(jié)構(gòu)上極端保守，且擁有適宜的分子量大小，存儲(chǔ)了豐富的生物信息，是系統(tǒng)進(jìn)化分類的可靠選擇［24］。對(duì)16S rDNA 序列進(jìn)行分析，可以快速對(duì)微生物進(jìn)行初步分類鑒定，基于16S rDNA 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也可以確定菌種在進(jìn)化中的位置。一般認(rèn)為，在種分類水平上若2個(gè)分類單位間16S rDNA 序列同源性高于97.5%，則屬于同一個(gè)種［25］。本研究中，菌株OLP1與類谷糠乳桿菌進(jìn)化親緣度為100%；OCEF2與屎腸球菌進(jìn)化親緣度為98%；OCPP3、OL36、OL77和OL205與戊糖片球菌進(jìn)化親緣度為98%；OCLB7與布氏乳桿菌進(jìn)化親緣度為100%；OCWC8和OCWC9與魏氏乳桿菌進(jìn)化親緣度為100%，基本可以確定屬種。但OCLF4和OCLF6與香腸乳桿菌進(jìn)化親緣度為96%；OCLP5與類食品乳桿菌和消化乳桿菌進(jìn)化親緣度為89%，尚需要進(jìn)一步鑒定。菌株OL3、OL8、OL25、OL54、OL122和OL194與植物乳桿菌、戊糖乳桿菌和類植物乳桿菌進(jìn)化親緣度為100%，但具體為哪一種尚不能確定。植物乳桿菌和戊糖乳桿菌在16S rDNA 序列上僅有2 bp 的差異，表現(xiàn)出極高的序列相似性，只通過(guò)16S rDNA 序列分析很難區(qū)分［13］。因此結(jié)合糖發(fā)酵結(jié)果，菌株OL3和OL54均能發(fā)酵D-木糖和鼠李糖，均不能發(fā)酵α-甲基-D-甘露糖苷和D-棉籽糖，因此鑒定為戊糖乳桿菌。而菌株OL8、OL25和OL122均能發(fā)酵α-甲基-D-甘露糖苷、D-棉籽糖，均不能發(fā)酵D-木糖和鼠李糖，因而將其鑒定為植物乳桿菌［21］。

乳酸菌作為生物型添加劑直接增加了青貯原料中乳酸菌的數(shù)量，提高了發(fā)酵初期乳酸菌與其他微生物的競(jìng)爭(zhēng)能力，有利于促進(jìn)乳酸發(fā)酵的進(jìn)程。關(guān)于植物乳桿菌、戊糖片球菌和戊糖乳桿菌作為青貯添加劑的報(bào)道較多，效果也非常顯著［12，26-31］。生長(zhǎng)速度和產(chǎn)酸速率是篩選青貯用乳酸菌的重要指標(biāo)［18］。本研究篩選的耐低溫菌株中，戊糖片球菌 OCPP3、OL36和 OL77，戊糖乳桿菌 OL3和 OL54，植物乳桿菌 OL8、OL25和 OL122的生長(zhǎng)速度更快，產(chǎn)酸速率也顯著高于其他菌株；其中OL77、OL54和OL122表現(xiàn)較好，可作為燕麥低溫青貯調(diào)制的備選添加菌株。

4 結(jié)論

1）青藏高原地區(qū)燕麥附著乳酸菌資源豐富、種類多樣。從不同海拔地區(qū)初步分離到232 株乳酸菌資源，經(jīng)進(jìn)一步篩選，獲得56 株菌株。

2）56 株菌株中，18個(gè)菌株體現(xiàn)出了良好的耐低溫、耐低pH 和耐鹽能力，其中4 株為異型發(fā)酵乳酸菌，14 株為同型發(fā)酵乳酸菌。

3）14 株同型發(fā)酵乳酸菌中，有8 株產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速度較快，其中3 株為戊糖片球菌，2 株為戊糖乳桿菌，3 株為植物乳桿菌。

4）綜合考慮菌株的耐低溫能力、產(chǎn)酸速率和生長(zhǎng)速度及多樣性，戊糖片球菌OL77、戊糖乳桿菌OL54和植物乳桿菌OL122可作為青藏高原地區(qū)燕麥低溫青貯發(fā)酵的備選添加菌株。