林鷙 趙本進(jìn) 何錫忠 朱永軍 彭麗英

摘? 要：為了建立全懸浮STHN-XF種子細(xì)胞庫(kù)，本研究將馴化成功的全懸浮STHN-XF細(xì)胞連續(xù)傳代至F36代，通過(guò)純凈性和核型分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代的STHN-XF細(xì)胞均無(wú)菌、無(wú)支原體、無(wú)外源病毒，細(xì)胞染色體數(shù)目均為19對(duì)，即38條，結(jié)果表明各代STHN-XF細(xì)胞都是純凈的，且核型相同。

關(guān)鍵詞：STHN-XF細(xì)胞;無(wú)菌檢驗(yàn);支原體檢驗(yàn);外源病毒檢驗(yàn);核型分析

基金項(xiàng)目：上海市農(nóng)業(yè)委員會(huì)重點(diǎn)項(xiàng)目[滬農(nóng)科攻字（2015）第1-7號(hào)];上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院助推項(xiàng)目（ZT2018009）

作者簡(jiǎn)介：林鷙（1987— ），男，博士，助理研究員，主要從事豬偽狂犬病相關(guān)疫畝及致病機(jī)理研究;E-mail：linzhiplain@163.com

#共同第一作者

*通信作者：彭麗英（1968— ），推廣研究員，主要從事獸用疫苗研究;E-mail：pengliying2010@ aliyun.com

懸浮培養(yǎng)細(xì)胞在國(guó)際上發(fā)展較快，已趨向成熟，是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用較普遍的一種生產(chǎn)工藝模式。與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)細(xì)胞相比，該工藝具有操作簡(jiǎn)單、省時(shí)、成本低等優(yōu)點(diǎn)。根據(jù)前期對(duì)豬偽狂犬病病毒株的細(xì)胞適應(yīng)性的研究結(jié)果，用豬源傳代細(xì)胞系——豬睪丸細(xì)胞（swine testis cell，ST細(xì)胞）繁殖豬偽狂犬病病毒株來(lái)制備疫苗效果最佳。本文對(duì)ST細(xì)胞進(jìn)行懸浮培養(yǎng)馴化、傳代，并對(duì)全懸浮STHN-XF細(xì)胞的F1、F5、F26、F36代進(jìn)行純凈性和核型分析。

1? 試驗(yàn)材料

1.1 全懸浮STHN-XF細(xì)胞

全懸浮STHN-XF細(xì)胞為上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所課題組自行馴化和傳代的懸浮細(xì)胞株。

1.2 培養(yǎng)基

培養(yǎng)細(xì)胞用的VirusPro ST-S細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基購(gòu)自上海源培生物科技股份有限公司。無(wú)菌檢驗(yàn)用的硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基均購(gòu)自中海生物技術(shù)有限公司。支原體檢驗(yàn)用的液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基均購(gòu)自中海生物技術(shù)有限公司。

1.3 熒光抗體檢測(cè)試劑盒

牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬瘟病毒的間接熒光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中海生物技術(shù)有限公司。

1.4 細(xì)胞核型分析試劑

秋水仙堿、0.075 M氯化鉀溶液、Carnoy固定液[V（甲醇）∶V（冰醋酸）=3∶1]，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.5 其他

其他化學(xué)試劑、液氮罐、低溫冰箱、? ?37 ℃的CO2培養(yǎng)箱、25 ℃的CO2培養(yǎng)箱、搖床、生物反應(yīng)器及其他儀器設(shè)備由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供。

2? 試驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞傳代

將懸浮馴化好的STHN-XF細(xì)胞37 ℃懸浮培養(yǎng)48 h，細(xì)胞密度達(dá)到3×106個(gè)/mL以上進(jìn)行傳代，連續(xù)傳代至F36代，其中將F7～F16代細(xì)胞作為生產(chǎn)細(xì)胞進(jìn)行凍存。細(xì)胞凍存液成分為：新生牛血清20%、二甲基亞砜（DMSO）10%、最低必需（MEM）培養(yǎng)基70%。凍存程序?yàn)? ℃ 30 min，-20 ℃? 1 h，-70 ℃ 8 h（或過(guò)夜），將F0和F1代作為原始細(xì)胞于液氮中保存。

2.2 樣本準(zhǔn)備

分別隨機(jī)取F1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞各3瓶，將同一代細(xì)胞充分混合、培養(yǎng)后，將其作為待檢樣本分別進(jìn)行無(wú)菌、支原體及外源病毒檢驗(yàn)。

2.3 純凈性檢驗(yàn)

無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)均按現(xiàn)行2015《中華人民共和國(guó)獸藥典》進(jìn)行[1]。

2.3.1 無(wú)菌檢驗(yàn)

分別將0.2 mL F1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞的待檢樣本移植到2支硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基管中，1支置37 ℃培養(yǎng)，1支置25 ℃培養(yǎng);另分別取0.2 mL各代細(xì)胞移植到1支胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基管，置25 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d后，觀察硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基和胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的顏色是否變黃或變渾濁。

2.3.2 支原體檢驗(yàn)

分別將5 mL F1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞的待檢樣本移植到裝有20 mL液體培養(yǎng)基的小瓶中，搖勻后從中取0.4 mL移植到含1.8 mL培養(yǎng)基的2支小管中，每支0.2 mL，將小管和小瓶置37 ℃培養(yǎng)，分別于移植后? 5 d、10 d、15 d從小瓶中取0.2 mL培養(yǎng)物到小管中，每日觀察培養(yǎng)物顏色有無(wú)變黃或變紅。如果無(wú)變化，在最后一次移植到小管中培養(yǎng)14 d后停止觀察。如果發(fā)現(xiàn)小瓶或任何一支小管培養(yǎng)物顏色出現(xiàn)明顯變化，應(yīng)立即將小瓶中的培養(yǎng)物移植到小管液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基中，觀察液體培養(yǎng)基是否出現(xiàn)恒定的pH變化，及固體培養(yǎng)基上有無(wú)典型的“煎蛋”狀支原體菌落。

2.3.3 外源病毒檢驗(yàn)

分別將1 mL F1、F5、F26、F36代細(xì)胞的待檢樣本移植到3瓶單層Vero細(xì)胞和ST細(xì)胞（總面積不少于100 cm2），培養(yǎng)7 d，連傳2代，用吉姆薩染色液對(duì)單層細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)染色，觀察是否出現(xiàn)包涵體、巨細(xì)胞或其他外源病毒所致的細(xì)胞病變。

接種各代次細(xì)胞時(shí)加入適量0.2%豚鼠紅細(xì)胞和雞紅細(xì)胞的等體積混合液，分別在? ? 2 ℃～8 ℃和20 ℃～25 ℃條件下觀察紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象。

按照間接熒光檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢驗(yàn)各代次細(xì)胞是否感染牛病毒性腹瀉病毒、豬圓環(huán)病毒2型及豬瘟病毒。

2.4 細(xì)胞核型分析

2.4.1 收獲細(xì)胞

取分裂旺盛期的F1、F5、F26、F36代的STHN-XF細(xì)胞，用新鮮的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×106個(gè)/mL～4×106個(gè)/mL，加入秋水仙堿，使其質(zhì)量濃度為0.05 μg/mL，置? ?37 ℃培養(yǎng)箱中處理2 h～3 h，即可收獲細(xì)胞。

2.4.2 低滲處理

取出用秋水仙堿處理后的細(xì)胞，用吸管輕輕吹打混勻，移入10 mL離心管中，? ? ? ? 1 200 r/min離心10 min，去掉上清液，加入10 mL 0.075 M氯化鉀溶液，用吸管輕輕吹打混勻，置37 ℃培養(yǎng)箱中低滲處理30 min。

2.4.3 預(yù)固定

取出離心管，加入Carnoy固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，1 200 r/min離心10 min。

2.4.4 固定

取出離心管，去掉上清液。沿管壁緩慢加入Carnoy固定液1 mL，用吸管輕輕吹打混勻，室溫固定30 min，1 200 r/min離心? ? ? 10 min。連續(xù)固定3次。

2.4.5 制片

取出離心管，去掉上清液。用少量新鮮的固定液制成細(xì)胞懸液，常規(guī)法制片;70 ℃烤片2 h～3 h;標(biāo)本片用0.25%吉姆薩染色液染色10 min。

2.4.6 核型分析

F1、F5、F26、F36代的STHN-XF細(xì)胞在顯微鏡下計(jì)數(shù)分析30～50個(gè)中期分裂相。

3? 結(jié)果

3.1 細(xì)胞庫(kù)的建立

將STHN-XF細(xì)胞連續(xù)傳代至F36代，其中F0～F16代細(xì)胞每代凍存50管于液氮中，F(xiàn)26和F36代各凍存10管于液氮中。每管上標(biāo)記細(xì)胞名稱、凍存代次及時(shí)間。

3.2 無(wú)菌檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞不管是在37 ℃，還是在25 ℃下培養(yǎng)7 d，硫乙醇鹽流體培養(yǎng)基的顏色均未變黃和變渾濁;在25 ℃下培養(yǎng)7 d，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的顏色也未變黃或變渾濁。結(jié)果表明，各代次細(xì)胞均無(wú)細(xì)菌感染。結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 支原體檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照液體培養(yǎng)基的顏色沒(méi)有變化，移植到固體培養(yǎng)基后沒(méi)有出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落;陽(yáng)性對(duì)照液體培養(yǎng)基的顏色變黃，在每次移植到固體培養(yǎng)基后的第7天出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落;F1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞移植到液體培養(yǎng)基后顏色均沒(méi)有變化，移植到固體培養(yǎng)基后均未出現(xiàn)典型的“煎蛋”狀菌落。結(jié)果表明，各代次細(xì)胞均無(wú)支原體感染。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.4 外源病毒的檢驗(yàn)結(jié)果

3.4.1 致細(xì)胞病變檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，陰性對(duì)照未出現(xiàn)包涵體、巨細(xì)胞或其他外源病毒所致的細(xì)胞病變，陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了典型的細(xì)胞病變，F(xiàn)1、F5、F16、F26、F36代細(xì)胞均未出現(xiàn)細(xì)胞病變。結(jié)果表明各代次細(xì)胞均未感染外源病毒。

3.4.2 紅細(xì)胞吸附檢驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不管在2 ℃～8 ℃，還是? 20 ℃～25 ℃條件下，各代次細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)有紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象，結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4.3 熒光抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)F1、F5、F26、F36代細(xì)胞進(jìn)行牛病毒性腹瀉病毒、豬瘟病毒和豬圓環(huán)病毒2型的免疫熒光抗體檢測(cè)后，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)熒光，表明各代次細(xì)胞均未感染上述3種病毒。結(jié)果見(jiàn)表4。

3.5 核型分析

對(duì)F1、F5、F26、F36代細(xì)胞的染色體進(jìn)行計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)，各代細(xì)胞的染色體數(shù)目均為38條。詳見(jiàn)圖1。

4? 結(jié)論

F1、F5、F16、F26、F36代的懸浮STHN-XF細(xì)胞經(jīng)無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、外源病毒檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，各代次的STHN-XF細(xì)胞均無(wú)菌，無(wú)支原體，無(wú)外源病毒，表明各代次STHN-XF細(xì)胞都是純凈的。

通過(guò)對(duì)STHN-XF細(xì)胞的F1、F5、F26、F36代核型分析，結(jié)果表明細(xì)胞染色體數(shù)目均為19對(duì)，即38條，且核型相同。

懸浮培養(yǎng)指的是非貼壁依賴性細(xì)胞的培養(yǎng)，細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基中生長(zhǎng)或維持。懸浮培養(yǎng)可以降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)效率，便于擴(kuò)大生產(chǎn)規(guī)模[2]。國(guó)內(nèi)生物制品行業(yè)應(yīng)快速實(shí)現(xiàn)行業(yè)升級(jí)，早日實(shí)現(xiàn)新技術(shù)的引進(jìn)、消化和吸收，并進(jìn)一步創(chuàng)新，早日與國(guó)際接軌，提高我國(guó)生物制品行業(yè)在國(guó)際上的競(jìng)爭(zhēng)力[3]。

參考文獻(xiàn)

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[3] 陳文慶，王建超，劉華杰.懸浮培養(yǎng)工藝與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較分析[J].中國(guó)獸藥雜志，2010，44（10）：37-41.