張文德, 趙浩東, 孫明會(huì), 余岢駿, 郭意龍, 朱樂(lè)冉,胡 穎, 趙 蕭, 葉亞萍, 陳大福,2,*, 郭 睿,2,*

(1. 福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院(蜂學(xué)學(xué)院),福州 350002; 2. 福建農(nóng)林大學(xué)蜂療研究所, 福州 350002)

東方蜜蜂微孢子蟲Nosemaceranae是一種專性寄生蜜蜂中腸上皮細(xì)胞的單細(xì)胞真菌病原，最早在東方蜜蜂Apiscerana上被鑒定到，隨后跨種感染西方蜜蜂Apismellifera，隨著蜂產(chǎn)品貿(mào)易全球化和跨國(guó)引種日益頻繁已傳播至各養(yǎng)蜂國(guó)家(Papinietal., 2017)。該病原不僅對(duì)蜜蜂宿主的食物消化、營(yíng)養(yǎng)吸收、免疫應(yīng)答、能量代謝和細(xì)胞凋亡造成全方位的影響，還能導(dǎo)致蜜蜂的壽命縮短、生產(chǎn)力下降和采集日齡提前，嚴(yán)重危害蜜蜂健康和養(yǎng)蜂生產(chǎn)(Martín-Hernándezetal., 2011)。Cornman等(2009)利用第二代焦磷酸測(cè)序技術(shù)組裝并公布了東方蜜蜂微孢子蟲的參考基因組，為其組學(xué)及分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。近期，Huang等(2021)利用第三代納米孔(nanopore)長(zhǎng)讀段測(cè)序技術(shù)重新組裝了東方蜜蜂微孢子蟲基因組，基因組大小約為8.8 Mb，包含2 280個(gè)蛋白編碼基因。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一類長(zhǎng)度約為19～24 nt的細(xì)胞內(nèi)源性小非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)，在真核生物中廣泛存在且高度保守。miRNA能通過(guò)切割靶mRNA或阻止蛋白翻譯調(diào)控基因表達(dá)，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育﹑細(xì)胞分化和增殖、神經(jīng)發(fā)生、能量代謝、細(xì)胞凋亡及晝夜節(jié)律等諸多生物學(xué)進(jìn)程(Legeaietal., 2010)。目前，miRNA在小鼠Musmusculus、擬南芥Arabidopsisthaliana和黑腹果蠅Drosophilamelanogaster等模式生物中的研究較為深入(Babiarzetal., 2008; Enderetal., 2008; Zhan and Lukens, 2010)。但真菌miRNA的相關(guān)研究較為滯后，蜜蜂真菌病原的miRNA研究更為有限。前期研究中，筆者所在團(tuán)隊(duì)對(duì)蜜蜂的另一種主要真菌病原蜜蜂球囊菌Ascosphaeraapis的miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析(郭睿等, 2018)，揭示了差異表達(dá)miRNA(differentially expressed miRNA, DEmiRNA)在菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)和有性生殖等方面的潛在作用(陳華枝等, 2020)，并全面解析了蜜蜂球囊菌在侵染意大利蜜蜂Apismelliferaligustica幼蟲和中華蜜蜂Apisceranacerana幼蟲發(fā)育過(guò)程的miRNA差異表達(dá)譜及DEmiRNA的調(diào)控作用(熊翠玲等, 2020; 杜宇, 2021)。此前，Huang和Evans(2016)利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲感染的西方蜜蜂工蜂中腸進(jìn)行測(cè)序，并結(jié)合RT-qPCR鑒定到病原的6個(gè)miRNA-like RNA(milRNA)。近期，Shao等(2021)基于更新的東方蜜蜂微孢子蟲基因組版本(Huangetal., 2021)又鑒定到3個(gè)新miRNA，分析發(fā)現(xiàn)3個(gè)新miRNA參與了病原增殖過(guò)程的自我調(diào)控。然而，東方蜜蜂微孢子蟲的miRNA研究仍比較有限，對(duì)于病原孢子中是否存在miRNA以及miRNA發(fā)揮何種功能，相關(guān)研究仍然缺失。

本研究基于已獲得的small RNA-seq(sRNA-seq)數(shù)據(jù)對(duì)東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的miRNA進(jìn)行鑒定和分析，并利用分子生物學(xué)手段驗(yàn)證miRNA的表達(dá)和序列真實(shí)性，以期明確東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的數(shù)量、結(jié)構(gòu)特征及潛在調(diào)控作用，豐富東方蜜蜂微孢子蟲的miRNA信息，并為進(jìn)一步探究miRNA在病原孢子及病原致病過(guò)程中的功能提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 東方蜜蜂微孢子蟲孢子的sRNA-seq數(shù)據(jù)來(lái)源

筆者所在團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建了東方蜜蜂微孢子蟲純凈孢子3份平行樣品Nc-1, Nc-2和Nc-3的cDNA文庫(kù)，并委托北京百邁克生物科技有限公司進(jìn)行單端測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumina HiSeq Xten。測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)已上傳NCBI SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，BioProject號(hào)為PRJNA395137。 Nc-1, Nc-2和Nc-3的sRNA-seq分別產(chǎn)生16 597 883, 15 451 791和12 248 316條raw reads，經(jīng)嚴(yán)格質(zhì)控分別得到15 608 370, 14 249 255和11 440 684條clean reads，Q30分別達(dá)到98.61%, 98.65%和98.58%，分別有7 717 280, 7 801 135和6 482 422條clean reads能比對(duì)到東方蜜蜂微孢子蟲參考基因組(周丁丁等, 2020)，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可滿足本研究的相關(guān)分析。

1.2 sRNA分類注釋及參考基因組比對(duì)

為獲得包含miRNA的未注釋讀段(unannotated reads)，使用Bowtie軟件(Langmeadetal., 2009)將clean reads分別比對(duì)至Silva(https:∥www.arb-silva.de/)、GtRNAdb(http:∥gtrnadb.ucsc.edu/)、Rfam(http:∥rfam.xfam.org/)和Repbase(https:∥www.girinst.org/repbase/)數(shù)據(jù)庫(kù)，濾除核糖體RNA(rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核內(nèi)小RNA(snRNA)、核仁小RNA(snoRNA)等ncRNA及重復(fù)序列。進(jìn)一步采用Bowtie軟件將上述未注釋讀段與東方蜜蜂微孢子蟲參考基因組(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/?term=nosema%20ceranae)進(jìn)行序列比對(duì)以獲取未注釋讀段在參考基因組上的位置信息，從而得到比對(duì)上讀段(mapped reads)。

1.3 miRNA鑒定

采用miRDeep2(Friedl?nderetal., 2012)軟件包將1.2節(jié)的mapped reads與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.mirbase.org/)中的已知miRNA前體序列進(jìn)行比對(duì)，以鑒定保守miRNA的表達(dá)。同時(shí)，通過(guò)reads比對(duì)到基因組上的位置信息得到可能的前體序列，基于reads在miRNA前體(mature, star和loop)上的分布信息及前體結(jié)構(gòu)能量信息(RNAfold randfold)采用貝葉斯模型經(jīng)打分最終實(shí)現(xiàn)新miRNA的鑒定。進(jìn)一步對(duì)鑒定到的miRNA進(jìn)行結(jié)構(gòu)特征分析，包括長(zhǎng)度分布和首位及每位堿基偏向性。采用TPM(transcripts per million)法(Fahlgrenetal., 2007)對(duì)鑒定到的miRNA進(jìn)行表達(dá)量計(jì)算。

1.4 miRNA的莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄PCR(stem-loop RT-PCR)檢測(cè)和Sanger測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)1.3節(jié)鑒定到的10個(gè)miRNA的核酸序列，利用DNAMAN軟件(https:∥www.lynnon.com/dnaman.html)設(shè)計(jì)特異性Stem-loop引物和上游引物(F)及通用下游引物(R)，委托上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成(表1)。東方蜜蜂微孢子蟲感染的意大利蜜蜂外勤蜂取自福州市閩侯縣荊溪源安養(yǎng)蜂場(chǎng)?；诠P者所在團(tuán)隊(duì)前期已建立東方蜜蜂微孢子蟲孢子純化的技術(shù)流程(Chenetal., 2019; 耿四海, 2020)制備東方蜜蜂微孢子蟲的純凈孢子，利用RNA抽提試劑盒(Promega，美國(guó))提取東方蜜蜂微孢子蟲孢子樣品的總RNA，按照cDNA第1鏈合成試劑盒(諾唯贊，南京)說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA作為模板進(jìn)行常規(guī)PCR。PCR體系(20 μL): cDNA模板1 μL, 上下游引物(2.5 pmol/μL)各1 μL, PCR Mix 10 μL, 無(wú)菌水7 μL。PCR程序: 95℃ 5 min; 95℃ 50 s, 50℃ 30 s, 72℃ 50 s 34個(gè)循環(huán); 72℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段經(jīng)切膠回收和分子克隆后送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行Sanger測(cè)序。

1.5 miRNA靶基因預(yù)測(cè)、分析及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)預(yù)測(cè)到的miRNA與東方蜜蜂微孢子蟲的基因序列信息，利用TargetFinder(Allenetal., 2005)軟件對(duì)1.3節(jié)鑒定到的miRNA進(jìn)行靶向預(yù)測(cè)，得到靶基因集合。再利用BLAST軟件將靶基因分別比對(duì)到Nr(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/blast/db), Swiss-Prot(http:∥www.uniprot.org/uniprot/?query=*&fil=reviewed%3Ayes), eggNOG(http:∥eggnogdb.embl.de/#/app/emapper)和KOG(ftp:∥ftp.ncbi.nih.gov/pub/COG/KOG/kyva)數(shù)據(jù)庫(kù)。利用基迪奧云平臺(tái)(https:∥www.omicshare.com/tools)對(duì)靶基因進(jìn)行GO(http:∥www.geneontology.org/)和KEGG(http:∥www.genome.jp/kegg/pathway.html)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋。根據(jù)miRNA與靶基因的靶向結(jié)合關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)Cytoscape(https:∥cytoscape.org/)軟件進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的鑒定與特征

共鑒定到10個(gè)miRNA，長(zhǎng)度分布介于21～25 nt，不同長(zhǎng)度miRNA的首位堿基偏向性相似，多為U(圖1: A)。對(duì)于特定長(zhǎng)度的miRNA，其每一位堿基的偏向性差異明顯(圖1: B)。分布在24 nt和25 nt的miRNA數(shù)量較多，分別為3個(gè)和4個(gè)，分布在21, 22和23 nt的miRNA均為1個(gè)(表1)。 這10個(gè)>miRNA的TPM值介于844 910.04～274.06之間；其中相對(duì)表達(dá)量最高的為NW_003313949.1_26675，最低的為NW_003312818.1_15325(表1)。

2.2 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的檢測(cè)和測(cè)序驗(yàn)證

利用stem-loop RT-PCR對(duì)已鑒定的10個(gè)miRNA進(jìn)行檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示10個(gè)miRNA均能擴(kuò)增出符合預(yù)期的目的片段(圖2: A)；進(jìn)一步對(duì)其中2個(gè)miRNA的擴(kuò)增片段進(jìn)行分子克隆與Sanger測(cè)序，結(jié)果顯示基因組比對(duì)鑒定的miRNA序列與測(cè)序結(jié)果一致(圖2: B)。結(jié)果表明本研究鑒定到的miRNA真實(shí)表達(dá)和存在。

2.3 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的靶基因

圖2 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的Stem-loopRT-PCR檢測(cè)(A)和Sanger測(cè)序驗(yàn)證(B)Fig. 2 Stem-loop RT-PCR detection (A) and Sangersequencing verification (B) of miRNAs inNosema ceranae sporesMarker: DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA molecular weight marker. miRNA信息見(jiàn)表1。For information of miRNAs, see Table 1. 下同The same below.

靶向預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，已鑒定的10個(gè)miRNA共靶向249個(gè)基因，其中分別有249, 118和3個(gè)靶基因可注釋到Nr, Swiss-Prot和eggNOG數(shù)據(jù)庫(kù)；有136個(gè)靶基因可注釋到KOG數(shù)據(jù)庫(kù)(圖3)；有134個(gè)靶基因可注釋到GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的30個(gè)功能條目，包括細(xì)胞進(jìn)程(cellular process)(77)和代謝進(jìn)程(metabolism process)(77)等15個(gè)生物學(xué)進(jìn)程相關(guān)條目，細(xì)胞(cell)(51)和細(xì)胞組件(cell part)(51)等6個(gè)細(xì)胞組分相關(guān)條目，結(jié)合(binding)(84)和催化活性(catalytic activity)(78)等9個(gè)分子功能相關(guān)條目(圖4: A)；有71個(gè)靶基因可注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的54條通路，包括代謝進(jìn)程(17)、次生代謝產(chǎn)物的生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)(9)和氨?；?tRNA的生物合成(biosynthesis of aminoacyl-tRNA)(7)、細(xì)胞周期-酵母(cell cycle-yeast)(6)和蛋白酶體(proteosome)(5)等(圖4: B)。

圖3 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的靶基因的KOG數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 3 KOG database annotation of target genes of miRNAs in Nosema ceranae spores

圖4 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的靶基因的GO(A)和KEGG(B)數(shù)據(jù)庫(kù)注釋Fig. 4 GO (A) and KEGG (B) database annotation of target genes of miRNAs in Nosema ceranae spores

2.4 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA與靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

進(jìn)一步根據(jù)已鑒定的miRNA和靶基因之間的靶向關(guān)系構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析結(jié)果顯示東方蜜蜂微孢子蟲的miRNA及其靶基因之間可形成較復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中NW_003314208.1_34537的靶基因數(shù)量最多，達(dá)到151個(gè)；NW_003311987.1_11248的靶基因最少，僅2個(gè)；NW_003311645.1_9769, NW_003312821.1_15338, NW_003312212.1_12220, NW_003313799.1_23928, NW_003313949.1_26675, NW_003312818.1_15325, NW_003311862.1_10660和NW_003311484.1_9172分別靶向28, 16, 15, 15, 13, 11, 9和5個(gè)基因(圖5)。

圖5 東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA及其靶基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig. 5 Regulatory network between miRNAs and their target genes in Nosema ceranae spores

3 討論

本研究基于前期獲得的東方蜜蜂微孢子蟲純凈孢子的sRNA-seq測(cè)序數(shù)據(jù)，利用生物信息學(xué)方法共鑒定到10個(gè)miRNA，Stem-loop RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示它們均真實(shí)表達(dá)，進(jìn)一步的分子克隆與Sanger測(cè)序證實(shí)了其中2個(gè)miRNA的序列真實(shí)性(圖2)。鑒于目前東方蜜蜂微孢子蟲的研究較為缺乏，鑒定到的miRNA豐富了東方蜜蜂微孢子蟲的miRNA信息，為進(jìn)一步探究miRNA在病原孢子和病原侵染中的功能提供了候選分子。本研究為東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA的首例報(bào)道，研究結(jié)果為進(jìn)一步探究孢子中miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用及對(duì)生命活動(dòng)的調(diào)節(jié)作用提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果顯示東方蜜蜂微孢子蟲的10個(gè)miRNA的首位堿基表現(xiàn)出U偏向性(圖1: A)，與歐洲油菜Brassicanapus(Fuetal., 2019)、長(zhǎng)牡蠣Crassostreagigas(王雪等, 2020)和家蠶微孢子蟲Nosemabombycis(潘秋玲等, 2015)等物種的miRNA首位堿基偏向性一致。此外，特定長(zhǎng)度miRNA的每一位堿基的偏向性表現(xiàn)出明顯差異(圖1: B)，這與其他動(dòng)植物的研究報(bào)道(Fuetal., 2013; Saminathanetal., 2016)相似。以上結(jié)果表明不同物種的miRNA具有較強(qiáng)的結(jié)構(gòu)保守性。此前，Huang和Evans(2016)以及Shao等(2021)共鑒定到東方蜜蜂微孢子蟲的9個(gè)miRNA。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，本研究鑒定到的10個(gè)miRNA與前人鑒定到的miRNA序列均不相同，這可能是由于本研究的測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)源于東方蜜蜂微孢子蟲的孢子，而前人研究的測(cè)序數(shù)據(jù)主要來(lái)源于侵染西方蜜蜂工蜂狀態(tài)下的東方蜜蜂微孢子蟲。

本研究中，東方蜜蜂微孢子蟲的10個(gè)miRNA共靶向249個(gè)基因，其中有118個(gè)靶基因可注釋到Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)，注釋數(shù)量最多的是染色體結(jié)構(gòu)維持(structural maintenance of chromosomes, SMC)蛋白，涉及4個(gè)靶基因(gene2901, gene1851, gene1125和gene1649)及存在潛在靶向結(jié)合關(guān)系的3個(gè)miRNA(miRNA ID: NW_003311862.1_10660, NW_003314208.1_34537和NW_003312818.1_15325)(表1)。該蛋白與染色體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞周期性動(dòng)態(tài)變化緊密相關(guān)，并參與有絲分裂染色體的集縮和分離，性染色體的劑量補(bǔ)償效應(yīng)，姐妹染色單體的內(nèi)聚作用遺傳重組以及DNA修復(fù)等過(guò)程(彭莉和張飛雄, 2001)。推測(cè)相應(yīng)的miRNA通過(guò)調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)影響SMC蛋白合成，進(jìn)而參與維持東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的染色體結(jié)構(gòu)。此外，有134個(gè)靶基因可注釋到30個(gè)GO條目(圖4: A)，包括應(yīng)激反應(yīng)(response to stimulus)、發(fā)育進(jìn)程(developmental process)、生殖進(jìn)程(reproductive process)、增殖(reproduction)和生長(zhǎng)(growth)等。還發(fā)現(xiàn)有71個(gè)靶基因可注釋到54條KEGG通路(圖4: B)，包括代謝通路和次生代謝產(chǎn)物的生物合成等物質(zhì)代謝通路，氨?；?tRNA的生物合成和蛋白酶體等遺傳信息處理通路，MAPK和磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol)等信號(hào)通路。上述結(jié)果說(shuō)明東方蜜蜂微孢子蟲孢子中miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因表達(dá)潛在參與生長(zhǎng)發(fā)育、新陳代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)進(jìn)程。作為一種休眠態(tài)，真菌孢子中僅維持較低的代謝水平以維持基本的生命活動(dòng)(Sephton-Clark and Voelz, 2018)。前期研究中，筆者所在團(tuán)隊(duì)在東方蜜蜂微孢子蟲孢子中分別鑒定到83條長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)和204條環(huán)狀RNA(circular RNA, circRNA)，分析發(fā)現(xiàn)這些lncRNA和circRNA分別與4和3個(gè)miRNA存在靶向結(jié)合關(guān)系，并潛在通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA(competing endogenous RNA, ceRNA)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)影響諸多生物學(xué)過(guò)程(Guoetal., 2018a, 2018b)。以上結(jié)果表明東方蜜蜂微孢子蟲孢子中存在活躍的基因轉(zhuǎn)錄活動(dòng)，lncRNA和circRNA與miRNA可能通過(guò)ceRNA網(wǎng)絡(luò)而密切互作，共同調(diào)節(jié)孢子中的生命活動(dòng)。未來(lái)可聯(lián)合蛋白組和翻譯組技術(shù)進(jìn)一步深入剖析東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的蛋白翻譯及基因表達(dá)的表觀調(diào)控機(jī)制。

微孢子蟲是一類細(xì)胞內(nèi)寄生的單細(xì)胞真菌病原，因缺乏線粒體，其增殖所需的物質(zhì)和能量高度依賴宿主細(xì)胞提供(耿四海等, 2020)。 ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和ATP/ADP移位酶在兔腦炎微孢子蟲Encephalitozooncuniculi(Tsaousisetal., 2008)和家蠶微孢子蟲(Panetal., 2017)等微孢子蟲竊取宿主細(xì)胞中物質(zhì)和能量過(guò)程中扮演關(guān)鍵角色。本研究發(fā)現(xiàn)，東方蜜蜂微孢子蟲孢子中的2個(gè)miRNA(miRNA ID: NW_003313799.1_23928和NW_003314208.1_34537)可分別靶向ATP/ADP移位酶基因(gene1379)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因(gene2043)，說(shuō)明這2個(gè)miRNA與東方蜜蜂微孢子蟲的增殖與侵染具有潛在關(guān)聯(lián)，值得進(jìn)一步深入研究。鑒于目前來(lái)源于蜜蜂組織或器官的可傳代培養(yǎng)的細(xì)胞系缺失，后續(xù)工作中，我們將根據(jù)已鑒定的miRNA的核酸序列設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的模擬物(mimic)和抑制物(inhibitor)，再通過(guò)飼喂東方蜜蜂微孢子蟲感染的蜜蜂宿主對(duì)病原的miRNA進(jìn)行過(guò)表達(dá)和敲減，以深入探究相關(guān)miRNA調(diào)控東方蜜蜂微孢子蟲侵染的機(jī)制。

綜上，本研究首次在東方蜜蜂微孢子蟲孢子中鑒定到10個(gè)miRNA，并揭示它們的首位堿基具有U偏向性，且每一位堿基的偏向性差異明顯，miRNA通過(guò)潛在靶向調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)調(diào)節(jié)孢子中的細(xì)胞周期、代謝進(jìn)程及次生代謝產(chǎn)物的生物合成等生物學(xué)過(guò)程。