霍佳歡， 溫曉蕾， 李雙民， 馮麗娜， 蘭淑慧， 董立新，郭思柔， 栗佳寧， 王建華， 齊慧霞*

（1.河北科技師范學院農學與生物科技學院，河北省作物逆境生物學重點實驗室，河北 秦皇島 066600；2.河北農業(yè)大學植物保護學院，河北 保定 071002；3.河北省昌黎縣職業(yè)技術教育中心，河北 秦皇島 066600；4.秦皇島市植保植檢站，河北 秦皇島 066000）

根腐病是中藥材生產上常見的病害之一，由多種病原菌引起，造成根部腐爛，削弱植株對水分和養(yǎng)分的吸收能力，地上部變黃脫落，最后導致全株死亡，嚴重威脅中藥材的生產[1]。據(jù)報道，人工栽培紅花[1]、黃芪[2]、白及[3]、百合[4]、鐵皮石斛[5]、大葉黃[6]等均有根腐病發(fā)生，由尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、茄病鐮刀菌(Fusarium solani)、接骨木鐮刀菌(Fusarium sambucinum)、粉紅單端孢(Trichothecium roseum)引起；也有少部分是由細菌引起，如三七根腐病由產吲哚金黃桿菌(Chryseobacterium indoloqenes)引起[7]。除病原微生物侵染外，土壤濕度過大、栽培地低洼且排水不良、重茬連作以及環(huán)境條件惡劣等也是造成根腐病發(fā)生的重要原因。

北蒼術（Atractylodes chinensis）是一種較珍貴的中藥材，主要以干燥的根莖入藥，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目等功效[8]。日益增長的需求導致野生北蒼術資源嚴重匱乏，人們開始大面積人工栽培，但由于缺乏專業(yè)技術及后期管理措施不當，造成北蒼術病害連年發(fā)生，且種類繁多。目前，生產上較為常見的有蒼術菌核病、葉斑病、黑斑病、炭疽病以及根腐病等[9-11]。根腐病在河北秦皇島北蒼術主產區(qū)危害嚴重，育苗期至成株期均有發(fā)生，造成北蒼術育苗成活率較低，但造成該病的致病菌尚不明確。本研究在河北省秦皇島市北倉術主產區(qū)采集發(fā)病植株，采用結合形態(tài)學及分子生物學的方法對該地區(qū)病原菌進行了分離及鑒定，明確主要致病菌類型及其生物學特性，以期為合理選用殺菌劑、有效防治該病害提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

北蒼術根腐病病害樣品采集于秦皇島市青龍縣同盛醫(yī)藥有限公司北蒼術種植基地，在河北科技師范學院植物保護實驗室開展病害鑒定。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：ddH2O 1 000 mL、馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g。

查氏(Czapek)培養(yǎng)基：ddH2O 1 000 mL、硝酸鈉2 g、磷酸二氫鉀1 g、硫酸鎂0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30 g、瓊脂粉20 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離 采用常規(guī)組織分離法[12]對采集的病株根系進行分離和純化。將病株根系用無菌水洗凈，在無菌條件下將病健部位交界處剪成2～3 mm小段,用75%乙醇消毒50 s，蒸餾水沖洗2～3次，最后用吸水紙吸干材料表面水分，將其放置在PDA平板上，于25℃恒溫培養(yǎng)箱內倒置培養(yǎng)。將純培養(yǎng)菌落轉移到PDA斜面試管中，置于4℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原菌形態(tài)學鑒定 將分離得到的病原菌接種到PDA培養(yǎng)基上，25℃恒溫培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌落形態(tài)，在蔡司顯微鏡下觀察其菌絲及分生孢子的形態(tài)結構、生長方式等[13]，并拍照記錄。依據(jù)形態(tài)特征[14-17]對病原菌進行初步鑒定。

1.2.3 病原菌分子生物學鑒定 病原菌培養(yǎng)3～4d，將菌絲收集到離心管中，利用試劑盒（NuClean PlantGenomic DNA Kit，康為世紀）提取該病原菌DNA；以ITS1（5’-TCCGTAGGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）作為引物進行PCR擴增。PCR總體系25 μL：DNA模板1 μL、ddH2O 9.5 μL、Mix 1.5 μL、ITS1和ITS4各1 μL。PCR反應條件：94℃，預變性5 min；94℃變性30 s，5℃退火30 s，72℃延伸1 min，30次循環(huán)。反應結束后，擴增產物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證后進行測序[18]。將獲得的序列結果在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行blast比對，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定北蒼術根腐病的病原菌。

1.2.4 病原菌致病性測定及再分離 根據(jù)柯赫氏法則［12］，采用離體回接北蒼術根系的方式進行致病性測定。取同品種健康的北蒼術幼苗根系，去除表面雜物，用75%乙醇進行消毒，采用微傷噴灑1×106cell·L-1孢子懸浮液的方式接種北蒼術根系，接種后在25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。重復3次，每次接種2株全部根系，每天觀察并記錄接種材料的發(fā)病情況，從接種發(fā)病的根部再次分離病菌,完成柯赫氏法則的驗證。

1.2.5 適宜生長溫度測定 在無菌操作臺內將直徑為0.8 cm的病原菌菌餅接種到PDA培養(yǎng)基中央，分別放置在5、10、15、20、25、30和35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每處理重復3次。采用十字交叉法測量菌落直徑，每天觀察菌落變化[5]。

1.2.6 適宜碳源測定 以查氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基，分別用等量的葡萄糖、甘露醇、乳糖、果糖、可溶性淀粉、木糖、肌醇替換蔗糖制成培養(yǎng)基，在無菌操作臺內將直徑為0.8 cm的菌餅接種到培養(yǎng)基中央，25℃恒溫培養(yǎng)。每處理重復3次，采用十字交叉法測量菌落直徑，每天觀察菌落變化[5],培養(yǎng)5 d計算菌落平均生長速率[19]。

式中，D為菌落直徑；d為培養(yǎng)總天數(shù)。

1.2.7 最佳氮源測定 將查氏培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基分，別用等量的蛋白胨、尿素、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀替換硝酸鈉制成培養(yǎng)基，在無菌操作臺內將直徑為0.8 cm的菌餅接種到培養(yǎng)基中央，25℃恒溫培養(yǎng)，每處理重復3次，采用十字交叉法測量菌落直徑，每天觀察菌落變化[5]，培養(yǎng)5 d計算菌落平均生長速率（式1）。

1.2.8 菌絲致死溫度 將直徑為0.8 cm的病原菌菌餅轉入裝有2.5 mL無菌水的試管中，將各試管分別放入40、45、50、55、60、65、70、75、80和85 ℃水浴鍋中，水浴10 min，然后將處理后的菌餅接種到PDA平板中央培養(yǎng)。25℃培養(yǎng)48 h后觀察菌絲生長情況，確定致死溫度[5]。試驗設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 北蒼術根腐病病害癥狀

病株地上部葉片初期從葉緣處褪綠變黃并逐漸向內擴展，后期葉片失水、卷縮、干枯、易碎，發(fā)病嚴重時全株枯死。病株地下部發(fā)病不均勻，根系尖端和中上部均可發(fā)病，發(fā)病初期根系病部顏色呈褐色，變軟；后期逐漸變?yōu)楹诤稚?，萎蔫縊縮，隨著水分流失根系逐漸干縮、變硬、易折斷，病健交接處明顯，嚴重時地下部根系全部變褐腐爛(圖1）。

圖1 北蒼術根腐病癥狀Fig.1 Symptoms of Atractylodes chinensi root rot

2.2 病原菌形態(tài)學特征

經(jīng)分離純化獲得純培養(yǎng)菌株，將其命名為CZG-1。在PDA培養(yǎng)基上25℃恒溫培養(yǎng)4 d的菌落直徑為6.4 cm，菌落外圍呈白色，中部為粉紫色，菌落背面有不明顯同心圓環(huán)；菌絲似絨毛狀，氣生菌絲生長旺盛，菌絲有隔膜且分支方式表現(xiàn)為側生分支；分生孢子均無色，大型分生孢子漸尖型鐮刀狀，有1～5個分隔；小型分生孢子呈卵形，在瓶梗頂端聚成球狀，有1～2個分隔，大型分生孢子大小約為(3.3～4.7)×(22.5～62.5)μm;小型分生孢子大小約為(3.2～4.7)×(14.5～19.6)μm，厚垣孢子圓形且無色(圖 2)。

圖2 北蒼術根腐病病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of root rot pathogens of Atractylodes chinensi

2.3 病原菌分子生物學鑒定結果

經(jīng)PCR擴增，北蒼術根腐病菌株ITS序列大小為545 bp，將該序列在基因數(shù)據(jù)庫中比對，選擇同源性高的菌株序列建構系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。結果表明，CZG-1菌株與序列號為MK849925的尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的菌株同源性高達100%。

圖3 CZG1菌株ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of CZG1 strain based on ITS sequence

2.4 致病性分析

將菌株接種于健康北蒼術幼苗根系后觀察發(fā)現(xiàn),接種后1～2 d未表現(xiàn)癥狀；3 d后根系上生有少量白色菌絲并伴有褐色暈染；4 d后白色菌絲增多，病斑逐漸擴大，發(fā)病處顏色呈棕色；5 d后病斑直徑達1 cm左右；6 d后病部呈褐色，根尖處開始萎蔫干縮；7 d后菌絲量減少，病部顏色呈深褐色；8 d后病部和健康部位交接處明顯；10 d后病部深褐色，根尖、須根大部分已變褐、失水、干枯(圖 4)。

圖4 北蒼術根腐病室內接種發(fā)病癥狀Fig 4 Symptoms of Atractylodes chinensi Root Rot by indoor inoculation

將接種成功的植株根部再次進行病菌分離純化，均可獲得與接種菌株一致的病菌，證明為該病害的致病菌。

2.5 致病菌生物學特性分析

2.5.1 溫度對菌絲生長的影響 溫度對北蒼術根腐病菌的生長影響顯著，由圖5可知，該病菌在5～35℃條件下均能生長，最佳的生長溫度范圍在20～30℃，其中在25℃條件下菌落生長最好，培養(yǎng)5 d菌落直徑可達到7.80 cm；溫度低于5℃或高于35℃時菌落生長十分緩慢，略有菌絲產生。

圖5 溫度對菌落生長的影響Fig.5 Effect of temperature on colony growth

2.5.2 不同碳源對菌絲生長的影響 北蒼術根腐病菌在8種不同碳源培養(yǎng)基上均可生長（表1、圖6），病原菌培養(yǎng)前3 d，在以肌醇為基礎碳源的培養(yǎng)基上生長最好，菌落直徑達4.20 cm，3 d后在葡萄糖和蔗糖為基礎碳源的培養(yǎng)基上生長較好，培養(yǎng)5 d后菌落直徑分別為6.75和6.70 cm。北蒼術根腐病菌對可溶性淀粉的利用率最低，培養(yǎng)5 d后菌落擴展直徑為5.38 cm,平均生長速率僅為1.076 cm·d-1，且菌絲生長稀疏。

表1 碳源對菌落直徑生長的影響Table 1 Influence of carbon source on the growth of colony diameter

圖6 不同碳源對菌落生長的影響Fig.6 Effect of different carbon sources on colony growth

2.5.3 不同氮源對菌絲生長的影響 由表2、圖7可知，北蒼術根腐病菌在8種不同氮源的培養(yǎng)基上均可生長，菌落生長前2 d，在查氏培養(yǎng)基和牛肉膏培養(yǎng)基上生長較好，培養(yǎng)3 d后在以酵母浸粉為基礎氮源的培養(yǎng)基上生長最好，培養(yǎng)5 d菌落直徑達7.17 cm,菌落平均生長速率為1.434 cm·d-1;對于硫酸銨和氯化銨的利用率較低,培養(yǎng)5 d菌落直徑為3.68和3.53 cm。病原菌在以硝酸鈉、牛肉膏、硝酸鉀以及蛋白胨為基礎氮源的培養(yǎng)基上生長差異不顯著，利用率僅次于酵母浸粉。

圖7 不同氮源對菌落生長的影響Fig.7 Effect of different nitrogen sources on colony growth

表2 氮源對菌落直徑生長的影響Table 2 Influence of nitrogen source on the growth of colony diameter

2.5.4 致死溫度分析 由圖8可知，40～70℃處理的菌絲均可繼續(xù)生長，75～85℃處理過的菌絲則停止生長。因此可確定北蒼術根腐病菌菌絲的致死溫度為75℃。

圖8 北蒼術根腐病菌致死溫度Fig.8 Lethal temperature of Atractylodes chinensi root rot pathogen

3 討論

本研究采用形態(tài)學以及分子生物學相結合的鑒定方法證實了引起秦皇島地區(qū)北蒼術根腐病的致病菌為半知菌亞門、鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)，該研究結果與王鐵霖等[16]報道的湖北地區(qū)茅蒼術根腐致病菌一致，由此可推斷出尖孢鐮刀菌是引起不同地區(qū)、不同品種的蒼術根腐病的重要致病菌。

尖孢鐮刀菌寄主范圍廣泛，可危害多種作物，通常造成寄主植物發(fā)生根腐病或枯萎病[20],寄主不同，尖孢鐮刀菌的生長特性也略有差異。該病原菌在25℃下生長良好，不同氮源中，對酵母浸粉利用最高；碳源中對葡萄糖和蔗糖利用率較高。文增葉等[21]、尹樂斌等[22]研究認為尖孢鐮刀菌最適生長溫度為30℃；曹興等[3]從百合鱗莖發(fā)病部位分離出的尖孢鐮刀菌對乳糖的利用率最高，與本研究中尖孢鐮刀菌對葡萄糖和蔗糖的利用率較高略有差異；耿麗華等[23]認為尖孢鐮刀菌致死溫度為68℃；尹樂斌等[22]認為尖孢鐮刀菌致死溫度為66℃，與本試驗中致死溫度75℃不同。以上結論說明不同尖孢鐮刀菌因生長環(huán)境條件差異，其生長特性也略有不同。

北蒼術為秦皇島地區(qū)道地藥材，對推動當?shù)亟?jīng)濟發(fā)展具有重要作用，本研究明確了引起本地區(qū)北蒼術根腐病的病原菌為尖孢鐮刀菌，對生產上有效防控該病害具有指導性意義，但對于該病菌的生理小種、發(fā)生流行規(guī)律、有效防控技術等還亟待進一步研究，為生產提供進一步的科學指導提供理論支持。