王曉慶，支 慧，胡浩然，周 玨，田大皓，江玉華，盧林明

(皖南醫(yī)學(xué)院病理解剖學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

蛇毒做為一種生物毒素[1]，是由多種天然毒性蛋白構(gòu)成的混合物，含有多種蛋白質(zhì)以及一些小分子物質(zhì)。研究證實(shí)不同種類的蛇毒腺分泌的毒液含有的化合物的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)均不相同，且對(duì)其他生物呈現(xiàn)的毒性也不相同[2]。隨著生物化學(xué)、藥理學(xué)、分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展蛇毒的臨床應(yīng)用研究得到了長足的發(fā)展。國內(nèi)外的蛇毒研究所均證實(shí)蛇毒組分具有溶栓作用、促凝作用、鎮(zhèn)痛作用、降壓作用以及抗腫瘤作用[3-5]。

AHVAC-Ⅰ是通過陰陽離子交換柱和凝膠G50分子篩技術(shù)從皖南蝮蛇蛇毒粗毒中提取的一種成分。前期研究發(fā)現(xiàn)AHVAC-Ⅰ抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖，如胃癌細(xì)胞SGC7901[6]。隨著AHVAC-I抗腫瘤作用的廣泛研究和應(yīng)用，為將其推上臨床，其成分的安全性必須得到實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

中位致死劑量(LD50)測(cè)定被廣泛認(rèn)定是評(píng)估蛇毒組分的急性致死毒性的主要方法[7]。除了要確定蛇毒引起的動(dòng)物致死的LD50值，我們認(rèn)為全面的急性毒性研究還應(yīng)當(dāng)包括局部組織的病理變化(如出血、壞死)以及臟器功能的損傷亦十分重要。鑒于LD50受到蛇毒組分的毒源、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的類型以及毒液的給藥途徑的影響[8-9]，本文將從小鼠LD50值、給藥后小鼠主要臟器結(jié)構(gòu)與功能的改變等方面，對(duì)AHVAC-I腹腔注射給藥后小鼠的急性毒性進(jìn)行較為深入的研究，初步了解其毒性劑量和有效劑量之間的差別，確定其毒性靶器官，為后續(xù)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)昆明種小鼠，4～6周齡，體重18～22 g，雌雄各半，由皖南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)生活環(huán)境溫度控制在20 ℃左右，濕度(50±10)% 環(huán)境下飼養(yǎng)1周，使其適應(yīng)新環(huán)境，足量飲食，飽水。

1.1.2 藥品 AHVAC-Ⅰ為皖南醫(yī)學(xué)院蛇毒研究所提純制備的凍干粉，臨用前雙蒸水溶解成適用濃度。谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)試劑盒、肌酐(CR)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.1.3 儀器 電子天平 (JJ224BC，常熟市雙杰)，切片機(jī)(RM2245，LEICA)，酶標(biāo)儀(KHB，上?？迫A)，顯微鏡(BA600-4，Motic)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 AHVAC-Ⅰ溶液配制 取1 mg AHVAC-Ⅰ凍干粉，臨用前1 mL雙蒸水溶解，制成1 mg/mL的AHVAC-Ⅰ母液。

1.2.2 毒性實(shí)驗(yàn)劑量分組 腹腔注射給藥，采用半數(shù)致死劑量法[10]。先預(yù)實(shí)驗(yàn)，再正式實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 預(yù)實(shí)驗(yàn) 將觀察1周的健康清潔級(jí)小鼠隨機(jī)分成3組，每組6只，雌雄各半，用遞次稀釋3倍的

AHVAC-Ⅰ溶液按體重進(jìn)行腹腔注射給藥，注射量均為0.2 mL，連續(xù)觀察7 d。以小鼠全部死亡以及小鼠全部存活的劑量，計(jì)算出AHVAC-Ⅰ腹腔注射最大最小致死量(LD0)以及最小最大致死量(LD100)分別為1.00 mg/kg，4.25 mg/kg，組間距r=0.7，n=5。

1.2.4 正式實(shí)驗(yàn) 120只健康小鼠隨機(jī)分成6組(每組20只，雌雄各半)，分別為空白對(duì)照組和5個(gè)AHVAC-Ⅰ劑量組。按照最高劑量與最低劑量的公比系數(shù)(q=0.70)設(shè)計(jì)中間劑量，劑量分別設(shè)置為1.00 mg/kg、1.44 mg/kg、2.06 mg/kg、2.96 mg/kg、4.25 mg/kg，分別命名為AHVAC-I A～E組，另設(shè)生理鹽水為空白對(duì)照組。

1.3 小鼠行為觀察實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，給藥后30 min內(nèi)，連續(xù)觀察；藥后 30 min～2 h，每15 min觀察1次；藥后2 h～4 h每30 min觀察1次；藥后4 h～8 h，每1 h觀察1次；藥后8 h～24 h，每4 h觀察1次；給藥后第2天起，每d觀察1次。按一般觀察項(xiàng)目指征指導(dǎo)原則觀察小鼠，包括動(dòng)物外觀、活動(dòng)狀態(tài)、精神狀態(tài)，有無鼻、口、眼異常分泌物以及死亡情況，連續(xù)觀察7 d。

1.4 小鼠血清生化檢測(cè)7 d后將剩余存活小鼠，用毛細(xì)管從小鼠眼球每只采血1.5 mL，采用試劑盒(mlbio)，ELISA法檢測(cè)血清學(xué)谷丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酐(CR)、尿素氮(BUN)水平。

1.5 病理形態(tài)學(xué)觀察取小鼠心、肝、肺、腎、腦等主要臟器，在0.9%生理鹽水洗滌，在濾紙上脫水，4%甲醛固定，脫水包埋，病理切片，HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較用單因素方差分析方法，兩組間均屬比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠行為學(xué)觀察AHVAC-I各劑量組小鼠出現(xiàn)不同程度的中毒反應(yīng)，如走路不穩(wěn)、行動(dòng)遲緩，被毛蓬亂且出現(xiàn)豎毛、精神萎靡、嗜睡乏力、畏寒怕冷，且中毒反應(yīng)隨劑量加大而加重。其中4.25 mg/kg、2.96 mg/kg和2.06 mg/kg三個(gè)劑量組小鼠在腹腔注射蛇毒后出現(xiàn)肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)失衡、抽搐后死亡。存活的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在7 d觀察期內(nèi)其精神、活動(dòng)、食欲、睡眠逐漸恢復(fù)正常。

2.2 急性毒性實(shí)驗(yàn)量效關(guān)系結(jié)果及LD50的計(jì)算結(jié)果

表1 蛇毒 AHVAC-I腹腔注射對(duì)小鼠的急性毒性情況性

通過預(yù)實(shí)驗(yàn)和正式實(shí)驗(yàn)，小尾腹腔給藥的LD100、LD50及LD0值見表1，LD50取值按95%的可信限為標(biāo)準(zhǔn)。小鼠腹腔注射AHVAC-Ⅰ后的48 h內(nèi)累積死亡曲線見圖1。

圖1 小鼠尾腹腔注射AHVAC-I 后的48 h內(nèi)累積死亡曲線

2.3 血清生化指標(biāo)檢查結(jié)果根據(jù)LD50值，1.00 mg/kg與1.44 mg/kg蛇毒組例入低劑量組，2.06 mg/kg蛇毒組為中劑量組，2.96 mg/kg蛇毒組例入高劑量組。與對(duì)照組小鼠相比，低劑量組小鼠的肝功能指標(biāo)(ALT、AST)和腎功能指標(biāo)(CR、BUN)水平均無改變，中、高劑量組小鼠的ALT、AST、CR、BUN均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(見表2)。

表2 AHVAC-I對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.4 病理觀察大體標(biāo)本見肝臟、腎臟、心臟、腦大小無明顯變化。鏡檢發(fā)現(xiàn)對(duì)照組肝、腎、心、腦、肺組織均未見異常表現(xiàn)(圖4～圖5中A)。實(shí)驗(yàn)組里低劑量組小鼠的肝組織無病理改變(圖2B)，但中劑量組肝組織可見部分肝細(xì)胞輕度水腫，胞體增大，胞漿透亮(圖2C)，高劑量組肝組織可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死，肝細(xì)胞水腫，雙核增多(圖2D)。

低劑量組小鼠的腎組織無病理改變(見圖3B)，但中劑量組腎組織可見部分腎小球水腫，囊腔變小，腎小管輕度水腫(見圖3C)，高劑量組腎組織可見腎小球水腫囊腔變小甚至消失，周圍腎小管輕度水腫(見圖3D)。其他臟器心臟(見圖4) 、肺臟(見圖5) 、腦組織(見圖6)與對(duì)照組相比未見明顯異常。

圖5 小鼠腹腔注射AHVAC-I后肺組織切片(×200)

圖6 小鼠腹腔注射AHVAC-I后腦組織切片(×200)

3 討論

分離純化單一蛇毒組分為將蛇毒開拓其成為有用的新型生物工具提供了可能性。然而，將蛇毒成分廣泛利用的前提條件之一是須充分考慮到其生物毒性，因此全面的評(píng)估有活性的蛇毒組分的毒性是研究發(fā)過程中不可或缺的一環(huán)。AHVAC-Ⅰ作為蛇毒的成分，雖然已被多項(xiàng)研究證實(shí)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，然而AHVAC-Ⅰ的體內(nèi)毒性研究尚未展開。因此，開展AHVAC-I的急性毒性實(shí)驗(yàn)，對(duì)于推廣AHVAC-I在抑制腫瘤方面應(yīng)用十分必要。

中位致死劑量(LD50)測(cè)試被認(rèn)為是評(píng)估蛇毒AHV-PI的急性毒性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[7]。為了確定AHVAC-I腹腔給藥小鼠的LD50，我們使用“Bliss方法”計(jì)算。本次研究的結(jié)果表明小鼠腹腔注射AHVAC-I的LD50值為2.585 mg/kg，95%可信限為2.233～3.069 mg/kg。對(duì)各組小鼠的行為學(xué)觀察結(jié)果表明，小鼠腹腔注射AHVAC-I導(dǎo)致的急性毒性表現(xiàn)主要為走路不穩(wěn)、蜷縮、昏厥性抽搐死亡；通過計(jì)算得出這一結(jié)果表明，AHVAC-I的是有毒性的，但是相較于藍(lán)海等提出的LD50為2 mg/kg[11]的蝮蛇蛇毒，做為蝮蛇組分之一的AHVAC-I的毒性要小于傳統(tǒng)的蝮蛇蛇毒。

給藥 7 d后，自實(shí)驗(yàn)小鼠眼球采血1.5 mL，生化指標(biāo)表明中劑量(2.06 mg/kg)組和高劑量組(2.96 mg/kg)小鼠體內(nèi)反映肝腎功能的ALT、AST、CR和BUN水平顯著高于對(duì)照組，但低劑量(1.00 mg/kg，1.44 mg/kg)組小鼠的肝腎功能指標(biāo)與對(duì)照組相比無差異?？梢姡蛣┝扛骨蛔⑸銩HVAC-I沒有造成小鼠肝、腎功能的損傷，但伴隨著劑量的增加，小鼠肝、腎功能受到損傷。由此，我們認(rèn)為低劑量的AHVAC-I腹腔注射的安全性是可以得到保證的。

進(jìn)一步的病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)低劑量(1.00 mg/kg，1.44 mg/kg)組小鼠的肝、腎、心、肺、腦組織均未有病理改變，但中(2.06 mg/kg)、高(2.96 mg/kg)劑量組小鼠的各重要組織臟器有出現(xiàn)病理改變。其中中劑量組小鼠的病理改變主要表現(xiàn)為肝、腎組織細(xì)胞的變性，但高劑量組小鼠的肝組織病理損傷嚴(yán)重，可見壞死。這表明中毒劑量的AHVAC-I的靶器官主要為肝臟，肝細(xì)胞成片的壞死可能是其引發(fā)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡的主要原因。這一結(jié)果與蝮蛇毒可導(dǎo)致肝、腎損傷的早前研究結(jié)果相吻合[12-15]。由于相較于中高劑量AHVAC-I對(duì)肝腎的損傷，低劑量的AHVAC-I對(duì)于小鼠的組織臟器無明顯損傷，我們認(rèn)為低劑量的AHVAC-I的安全性是較高的。

AHVAC-I的主要功能是抑制腫瘤細(xì)胞的生長，課題組先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明1.00 mg/kg劑量的AHVAC-I即可有效地對(duì)荷瘤鼠SCG-7901胃癌發(fā)揮抑瘤作用[6]。本次急性中毒實(shí)驗(yàn)的結(jié)果更是進(jìn)一步表明雖然AHVAC-I是有毒性作用的，但在有效抑癌劑量腹腔給藥的過程中對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無中毒表現(xiàn)，且各主要臟器無病理改變和功能損傷。

綜上所述，在藥效學(xué)的劑量下有效抑瘤濃度的AHVAC-I不會(huì)引發(fā)機(jī)體中毒反應(yīng)，這為臨床用藥安全提供了保障。