楊 靜，王為然，王 萌，朱家輝，寧新民，阿里甫·艾爾西，閔 玲，孔 杰,3

(1.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，烏魯木齊 830091；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070； 3.國(guó)家棉花工程技術(shù)研究中心,烏魯木齊 830091)

0 引言

【研究意義】棉花基因工程育種中組織再生是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其包括愈傷組織誘導(dǎo)增殖、體細(xì)胞胚形成和植株再生3個(gè)重要階段[1]，而高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞對(duì)獲得胚性愈傷及再生植株非常重要。圍繞海島棉胚性愈傷組織培養(yǎng)體系開展研究，篩選出增殖能力好的海島棉材料，對(duì)新疆海島棉育種提供新策略具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】1971年Beasley利用陸地棉胚珠珠孔誘導(dǎo)出愈傷組織[2]；1983年Davidonis獲得第一株體細(xì)胞再生植株[3]；1996年利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，第一代轉(zhuǎn)基因的抗蟲和抗除草劑的棉花誕生[4]。而后隨著組織培養(yǎng)技術(shù)的不斷發(fā)展，近年來，棉花再生體系得到不斷的完善和提升。但相比油菜，玉米，大豆等作物，仍存在體細(xì)胞發(fā)生率低、培養(yǎng)周期長(zhǎng)，成苗率低，畸形胚高等[5]。獲得體細(xì)胞胚的野生棉種有：擬似棉[6]、克勞茨基棉[7]、戴維遜氏棉[8-9]、旱地棉、異常棉、瑟伯氏棉、雷蒙德氏棉、斯篤克氏棉、比克氏棉[9]、灰白棉、澳洲棉[10]、奈爾遜氏棉[11]、陸地棉[3]等部分棉花種。其中僅有克勞茨基棉、斯篤克氏棉、擬似棉、戴維遜氏棉、雷蒙德氏棉、奈爾遜氏棉、陸地棉[3]等中的少量品種，獲得正常的再生植株。在海島棉中，Sakhanokh實(shí)現(xiàn)了體細(xì)胞的再生培養(yǎng)，但試驗(yàn)品種單一，無法應(yīng)用推廣[10]。大多數(shù)研究是以海島棉的莖尖[12]，叢生芽[13]等部位進(jìn)行的組織培養(yǎng)，通過嫁接[14]的手段獲得再生植株，這種方法會(huì)存在嵌合體，需要對(duì)轉(zhuǎn)化苗多次篩選[14]，增加了后期驗(yàn)證的次數(shù)，也存在假陽(yáng)性，并不適用于后續(xù)研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】通過組織培養(yǎng)篩選出再生能力強(qiáng)的基因型品種，不斷拓寬棉花基因工程中轉(zhuǎn)化受體的范圍，是重要的研究方向。目前在棉花體細(xì)胞再生的研究中，對(duì)新疆海島棉再生體系研究很少，制約了基因工程技術(shù)改良新疆海島棉品種改良中的應(yīng)用。開展高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞培養(yǎng)，篩選再生能力強(qiáng)的基因型品種非常必要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以新疆海島棉為材料，研究不同基因型品種的再生能力及其對(duì)激素誘導(dǎo)的響應(yīng)，篩選出愈傷增殖好、且能夠轉(zhuǎn)化的海島棉材料，完善新疆海島棉再生體系，培育再生能力強(qiáng)的品種，為新疆海島棉基因工程育種提供支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取 105份國(guó)內(nèi)外海島棉材料，品種均進(jìn)行連續(xù)多年自交，遺傳穩(wěn)定。海島棉種子由新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供，Jin668作為陸地棉對(duì)照由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)棉花團(tuán)隊(duì)提供。試驗(yàn)在華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。表1

表1 海島棉試驗(yàn)材料Table 1 The experiment accessions of island cotton

1.2 方 法

1.2.1 新疆海島棉棉胚性愈傷組織誘導(dǎo)

種子處理：選取籽粒飽滿的無損種子，剝?nèi)シN殼。用75%NaAC(V/V)消毒3次，每次消毒8～10 min，無菌蒸餾水快速清洗3次，之后用無菌蒸餾水泡3次，直至種子充分吸脹，每次5～8 min。

無菌苗培養(yǎng)：將吸脹后的種子接種于1/2MS + 1.5%(W/V)葡萄糖的培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)36～48 h后，扶苗。隨后繼續(xù)避光培養(yǎng)生長(zhǎng)3～5 d，獲得黃化的無菌苗。

農(nóng)桿菌浸染：帶有紅色熒光蛋白的載體構(gòu)建及農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化參考金雙俠等[15-16]實(shí)驗(yàn)方法。將活化之后的農(nóng)桿菌離心收集菌株，懸浮于MGL活化培養(yǎng)基(胰蛋白胨5 g/L+NaCl 5 g/L +MgSO4·7H2O 0.1 g/L+KH2PO40.25 g/L+甘露醇5 g/L+甘氨酸1 g/L)中，并加入0.1%的As(乙酰丁香酮)，以300 r/min，28℃搖床活化30 min。將去除根部和子葉的無菌苗下胚軸，切成0.5～0.7 cm的小段作為外植體，置于活化好的農(nóng)桿菌菌液中攪勻，靜置8～10 min，倒掉菌液，濾紙吸干殘余菌液，置于超凈臺(tái)10min，吹干表面菌液。

共培養(yǎng)：將干燥好的下胚軸切段分散布于墊有濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1%(V/V)MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽+ 0.2%(W/V)L-Gly +0.1%(V/V)B5培養(yǎng)基維生素+ 0.60 mg/L 2, 4-D + 0.1 mg/L KT + 3%(W/V)葡萄糖 + 0.26%(W/V)phytagel]中，保證每段下胚軸均接觸到濾紙，隨后置于21℃培養(yǎng)箱避光培養(yǎng)36～48 h。

愈傷組織誘導(dǎo)；將浸染共培養(yǎng)后的下胚軸切段接種于2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基[MS培養(yǎng)基+1%(V/V)MS培養(yǎng)基無機(jī)鹽+ 0.2%(W/V)L-Gly +0.1%(V/V)B5培養(yǎng)基維生素+ 0.60 mg/L 2, 4-D + 0.08 mg/L KT + 3%(W/V)葡萄糖 + 0.26%(W/V)phytagel+0.05 mg/mL卡那霉素]上,愈傷組織的誘導(dǎo)及增殖在溫度(28±2)℃，光照強(qiáng)度1 600 lx，置于光照培養(yǎng)室，每天光照14 h進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 誘導(dǎo)再生變化

表型：當(dāng)下胚軸兩端有膨大之后,愈傷組織開始增殖時(shí)，進(jìn)行拍照。

重量：當(dāng)下胚軸兩端有膨大突起的細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)，定期稱量其重量。

1.2.3 紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)化

對(duì)生長(zhǎng)良好的下胚軸進(jìn)行紅色熒光蛋白細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并觀察。將下胚軸從培養(yǎng)基中取出，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。對(duì)兩端膨大組織細(xì)胞，取少許加水后的細(xì)胞懸浮液置于載玻片上形成薄層，置于熒光顯微鏡下檢測(cè)，發(fā)紅色熒光的為轉(zhuǎn)入紅色熒光蛋白的細(xì)胞，若不發(fā)熒光則為未轉(zhuǎn)入成功。

如果說隱喻是利用事物之間的相似性促動(dòng)范疇的擴(kuò)展，那么轉(zhuǎn)喻就是利用事物的相關(guān)性促動(dòng)的擴(kuò)展。有些范疇化既包含著隱喻又包含著轉(zhuǎn)喻，兩者共同作用。圖式是人們?cè)谡J(rèn)識(shí)客觀世界的過程中基于身體經(jīng)驗(yàn)而形成的固定的認(rèn)知結(jié)構(gòu)模式，如路徑圖式、終點(diǎn)圖式，圖式與圖式之間存在著轉(zhuǎn)換關(guān)系，由于這種轉(zhuǎn)換關(guān)系促動(dòng)的多義現(xiàn)象就是圖式轉(zhuǎn)換因素。規(guī)約意象是人腦中反映的客觀事物和情景的形象和印記，它在量詞范疇擴(kuò)展方面發(fā)揮了極其重要的作用，文中也詳細(xì)的以日語(yǔ)中的量詞“本”為例解釋了圖式轉(zhuǎn)換和規(guī)約意象的作用。

1.2.4 細(xì)胞形態(tài)

將正常增殖的下胚軸愈傷組織取出，對(duì)其進(jìn)行分離，用1%的甲苯胺藍(lán)染色30 s，置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 利用2，4-D培養(yǎng)基對(duì)海島棉愈傷組織誘導(dǎo)

研究表明，滅菌吸脹后的種子，在無菌苗培養(yǎng)基中經(jīng)過5～7 d的培養(yǎng)后，海島棉無菌苗下胚軸長(zhǎng)勢(shì)較強(qiáng)，粗壯，對(duì)照陸地棉Jin668的無菌苗下胚軸較為纖細(xì)。將無菌苗下胚軸切段作為外植體，浸染農(nóng)桿菌后，置于2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基上愈傷誘導(dǎo)、增殖。培養(yǎng)28 d后，海島棉下胚軸兩端開始膨大生長(zhǎng)，切口處的愈傷組織細(xì)胞增多，且不同品種間表現(xiàn)出質(zhì)地、顏色及形態(tài)上的差異。對(duì)照J(rèn)in668的下胚軸表面光滑，兩端切口處慢慢變?yōu)樽厣蚝谏D1

注：A.陸地棉Jin668無菌苗(CK)；B.Jin668下胚軸；C.海島棉無菌苗；D～F.923、971、962下胚軸。Bars 值均為1 cm

2.2 海島棉愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)后的表型

研究表明，利用農(nóng)桿菌浸染的海島棉下胚軸置于2，4-D培養(yǎng)基中培養(yǎng)4個(gè)月后，愈傷組織的質(zhì)地、顏色、增殖體積呈現(xiàn)明顯差異。

第一種為不能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的材料，表現(xiàn)為3種形態(tài)。一是能產(chǎn)生愈傷組織，增殖較慢，顏色為棕褐色，下胚軸兩端呈硬質(zhì)化，該類型愈傷組織最后逐漸死亡，代表性材料有923等39份；二是愈傷組織呈米色或無色，部分呈褐色，質(zhì)地松軟呈稀泥狀，增殖較慢，且后期無增殖跡象，代表性材料有1 007等42份；三是下胚軸兩端呈蓬松狀，長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)得到米黃色絮狀，后期基本不再增殖，并逐漸死亡，代表性材料有972等15份。

第二種是能誘導(dǎo)出胚性愈傷組織的材料。愈傷組織呈黃綠色或棕紅色，質(zhì)地疏松，且下胚軸兩端不斷膨大增殖明顯，代表材料為986等共9份材料；對(duì)照J(rèn)in668也呈現(xiàn)出這種表型，而未浸染的Jin668愈傷則發(fā)生褐化，變黑，最后死亡，基本未發(fā)生增殖。圖2

注：A.未浸染農(nóng)桿菌的陸地棉Jin668(CK)的愈傷組織；B～C，E～F.培養(yǎng)4個(gè)月后的愈傷組織；D.Jin668浸染農(nóng)桿菌后培養(yǎng)4個(gè)月的愈傷組織。Bars值均為1 cm

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間海島棉材料誘導(dǎo)增殖變化

圖3 海島棉材料下胚軸增殖變化Fig.3 Variation of hypocotyledonary axis proliferation different accessions of island cotton

2.4 海島棉材料愈傷增殖質(zhì)量變化

研究表明，隨著培養(yǎng)時(shí)間變化，不同海島棉材料增殖速率和質(zhì)量呈現(xiàn)出差異性。不同品種間愈傷組織大致呈現(xiàn)出淺黃、綠色、棕色、淺紅色4種顏色，質(zhì)地主要分為疏松、僵硬、硬、較軟及稀泥狀等類型，愈傷細(xì)胞的形態(tài)多為長(zhǎng)柱形和近球形。愈傷呈現(xiàn)出的顏色、質(zhì)地、細(xì)胞形態(tài)等指標(biāo)篩選出962、964、986、1010、1011、1025、1052、1086、1103共9份愈傷增殖較好的材料。表2，圖4

表2 不同誘導(dǎo)時(shí)間下胚軸愈傷組織質(zhì)量(部分)Table 2 Callus quality of hypocotyl at different induction time

注：A～H分別為962，964，1010，1011，1025，1052，1086和1103培養(yǎng)4個(gè)月后的愈傷組織。Bars值均為1 cm

2.5 海島棉農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化后細(xì)胞特征

研究表明，以964為代表的2份材料轉(zhuǎn)化效果好，經(jīng)誘導(dǎo)之后下胚軸增殖較快愈傷顏色呈黃綠或米黃色，質(zhì)地松散，且轉(zhuǎn)化成功的紅色熒光的細(xì)胞多而聚集；以1010為代表的3份材料轉(zhuǎn)化效果一般，雖然下胚軸長(zhǎng)勢(shì)良好，但紅色熒光蛋白細(xì)胞，熒光信號(hào)較弱。且細(xì)胞呈圓球形、橢球形，細(xì)胞較為分散；以1103為代表的2份材料轉(zhuǎn)化效果差，主要表現(xiàn)為愈傷呈棕紅色、淡綠色，部分則無色，能夠轉(zhuǎn)化的細(xì)胞較少，熒光信號(hào)較弱。細(xì)胞多呈圓柱形或橢球形，較為聚集；以1052為代表的2份材料，轉(zhuǎn)化效率極低，愈傷呈棕色或無色，質(zhì)地軟，如稀泥的，紅色熒光蛋白的細(xì)胞極少，多呈圓柱形、橢球形及部分不規(guī)則細(xì)胞，且較為分散。圖5，圖6

注：A～D.Jin668、964、1086和1052培育4個(gè)月后的愈傷組織；E～H.Jin668、964、1086和1052培育4個(gè)月愈傷組織中的紅色熒光蛋白;I～L.Jin668、964、1086和1052培育4個(gè)月后愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色).A,B,C,D的bars值為1cm，E、F、G、H、I、J、K、L為100 μm

注：A,D.海島棉1010和1103培育4個(gè)月后的愈傷組織；B,E.1010和1103培育4個(gè)月后愈傷組織中的紅色熒光蛋白;C,F：1010和1103培育4個(gè)月后愈傷組織的細(xì)胞形態(tài)(甲苯胺藍(lán)染色).A和D的bars值為1 cm，B、C、E、F為100 μm

在2，4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下，篩選出964和1086兩份海島棉材料能夠獲得較高質(zhì)量的愈傷組織和轉(zhuǎn)化效果。

3 討 論

3.1 海島棉愈傷組織細(xì)胞對(duì)2,4-D培養(yǎng)基的誘導(dǎo)響應(yīng)

植物組織再生中愈傷組織的誘導(dǎo)增殖、體細(xì)胞胚的形成和植株再生3個(gè)階段尤為重要[1]，而高質(zhì)量的愈傷細(xì)胞是獲得胚性愈傷及再生植株的前提。通過向培養(yǎng)基中添加適宜濃度的2,4-D，能夠使細(xì)胞快速分化，過高或過低則會(huì)使細(xì)胞無法增殖或者死亡。研究利用改良后的2,4-D培養(yǎng)基進(jìn)行海島棉愈傷組織誘導(dǎo)和紅色熒光蛋白的轉(zhuǎn)化。在相同培養(yǎng)時(shí)間，海島棉比陸地棉Jin668的愈傷組織增殖更快。但不同海島棉品種愈傷組織對(duì)2,4-D濃度的響應(yīng)程度差異很大，這可能由于品種基因型的不同對(duì)2,4-D要求有差異，也與新疆海島棉某些關(guān)鍵的特異基因在其特定組織中的表達(dá)量不同有關(guān)[17]。棉花作為一種較難獲得體細(xì)胞培養(yǎng)的作物，體胚發(fā)生能力受基因型影響較大[18-19]。

3.2 影響棉花愈傷組織表型和增殖速度的因素

研究中，不同海島棉材料愈傷組織表型各有差異，其中淡黃色疏松的愈傷組織明顯比棕色或者褐色的材料增殖快，這與前人的研究結(jié)論一致[18]；并且增殖較快的品種，其熒光蛋白的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高。而部分品種出現(xiàn)了褐化的現(xiàn)象，可能與受外植體本身遺傳物質(zhì)、生理狀態(tài)及培養(yǎng)條件有關(guān)。因?yàn)椴牧现性|(zhì)體酶的活性和棉酚的含量都會(huì)影響愈傷組織的表型，褐化會(huì)導(dǎo)致SOD酶、 IAA氧化酶和CAT酶活性的降低，以及蛋白合成的減少[20]，從而減緩或阻礙愈傷組織發(fā)育速度，最終導(dǎo)致無法形成體細(xì)胞胚。導(dǎo)致棉花愈傷組織生長(zhǎng)緩慢、褐化的主要誘因與培養(yǎng)基氮源配比也有關(guān)[21]。品種的基因型、培養(yǎng)基配比、激素條件等，都會(huì)影響海島棉愈傷組織的增殖。

3.3 海島棉愈傷組織增殖過程培養(yǎng)時(shí)間

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)會(huì)引起再生植株發(fā)生畸變[22]。在研究中，利用OD值為0.6的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紅色熒光蛋白浸染海島棉下胚軸，浸染8～10 min，于2，4-D培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～7個(gè)月后，發(fā)現(xiàn)愈傷組織的誘導(dǎo)增殖過程，與培養(yǎng)時(shí)間并不呈正相關(guān)；超過4個(gè)月，部分材料的愈傷組織增殖緩慢，甚至停滯或者死亡，可能與選取的培養(yǎng)組織，菌液濃度及浸染時(shí)間有一定關(guān)系[23]，同時(shí)還受到材料自身愈傷細(xì)胞的活性的影響。這些影響過程，還需要后期進(jìn)一步進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

海島棉下胚軸經(jīng)改進(jìn)后的組織轉(zhuǎn)化體系培養(yǎng)28 d后，下胚軸兩端呈現(xiàn)不同的質(zhì)地，顏色和狀態(tài)；改良后的2,4-D誘導(dǎo)培養(yǎng)基可有效用于海島棉下胚軸愈傷組織再生。培養(yǎng)4個(gè)月是愈傷組織快速增殖的最佳時(shí)期，此時(shí)有60.86%的海島棉材料愈傷增重可達(dá)到0.201～0.5 g。當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，愈傷組織增殖緩慢；隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，愈傷會(huì)呈現(xiàn)不同的顏色和質(zhì)地。愈傷增殖較快的材料其紅色熒光蛋白轉(zhuǎn)化率也比較高。根據(jù)培養(yǎng)時(shí)間，增殖速率和轉(zhuǎn)化效率，篩選出9份愈傷增殖較快的海島棉材料。