錫林高娃，梅振宇，任洪寶，菅瑞珍

（1.內(nèi)蒙古民族大學生命科學與食品學院，內(nèi)蒙古 通遼 028043；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)乳源性致病菌防控工程技術研究中心，內(nèi)蒙古 通遼 028043；3.內(nèi)蒙古民族大學乳源性致病菌研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028043；4.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

我國乳腺炎病牛分布廣泛，患病?；鶖?shù)大，患病機制復雜且難以根治，每年都會造成重大的經(jīng)濟損失[1]。研究表明，無乳鏈球菌是導致奶牛患乳腺炎的病菌之一，人飲用被污染的牛奶會患病，造成潛在危險[2]?，F(xiàn)階段在生產(chǎn)過程中對牛乳腺炎治療經(jīng)常使用大劑量聯(lián)合抗生素，無乳鏈球菌在多種抗生素的選擇性壓力下發(fā)生變異，產(chǎn)生多種突變[3-4]。

噬菌體是一類能夠感染細菌的病毒。噬菌體專營寄生，通過宿主菌才能完成生命周期，在其內(nèi)復制繁殖。裂解性噬菌體通過殺滅宿主釋放子代，生命周期短，生長速度快，短時間可以暴發(fā)性繁殖出大量子代，可以有效殺滅宿主細菌[5]。

本文以由臨床患病奶牛奶樣中分離的多重耐藥性無乳鏈球菌為宿主菌，篩選1株可以有效抑制無乳鏈球菌生長繁殖的噬菌體，為使用噬菌體療法治療因多重耐藥性無乳鏈球菌引發(fā)的牛乳腺炎提供理論依據(jù)，治療因多重耐藥性無乳鏈球菌引發(fā)的牛乳腺炎提供新的方法，對保障乳原料安全具有研究價值，對公共安全具有極大意義。

1 材料

1.1 菌株

本試驗所用的多重耐藥性無乳鏈球菌，分離于臨床患乳腺炎且癥狀明顯的奶牛牛乳，由內(nèi)蒙古乳源性致病菌防控工程技術研究中心分離保存。

1.2 噬菌體樣品的采集

試驗所用樣品采集于內(nèi)蒙古通遼市郊區(qū)某養(yǎng)牛場，采集奶牛生活區(qū)的污水、糞水，采用5點取樣法取樣，2 h內(nèi)送往實驗室進行處理。

2 方法

2.1 樣品處理

將采集的污水及糞水樣用無菌水稀釋到100 mL，加入 CaCl2使終濃度達到 1 mmoL/L，混勻，靜置12 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用0.45 μm的濾器過濾，涂布于無菌LB平板上，隔夜培養(yǎng)驗證有無雜菌存在，收集過濾液。

2.2 活化無乳鏈球菌及對其耐藥性進行檢測

多重耐藥無乳鏈球菌的活化及耐藥性分析。將凍存于-80℃的無乳鏈球菌解凍，吸取10μL菌液添加到滅菌的含5%血清的LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，180 r/min 37℃恒溫振蕩培養(yǎng)10 h，利用平板劃線法培養(yǎng)12 h。挑取單菌落，重復3次，純化得到多重耐藥性無乳鏈球菌。以紙片擴散藥敏試驗的方法進行耐藥性試驗，結(jié)果可參照美國臨床實驗室標準委員會（NCCLS）的規(guī)定[5-6]。

2.3 無乳鏈球菌噬菌體的分離及富集

在多重耐藥性無乳鏈球菌菌液中分別加入1 mL過濾滅菌后的污水樣、糞水樣過濾液，靜置15min，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h。取菌液，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.45μm濾膜過濾除菌保留除菌液，保存記錄為噬菌體原液。

通過點樣試驗[7]驗證噬菌體，觀察結(jié)果計算噬菌斑直徑平均值并記錄。

用3次富集的方法[8]提高噬菌體濃度，保存標注備用。

2.4 噬菌體的純化

挑選邊緣光滑、顏色透明、較大的單株噬菌斑，用移液槍槍頭挑取，混入無乳鏈球菌菌液，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng) 6 h，經(jīng) 10 000 r/min離心10 min。取上清液，經(jīng)0.45μm濾膜過濾除菌，再次使用雙層平板法[7]純化，多次重復以上步驟純化，保存噬菌體液。

2.5 噬菌體生長特性試驗

2.5.1 噬菌體一步生長曲線的測定。200μL噬菌體液與預先準備的1 mL多重耐藥性無乳鏈球菌菌液混合，混入20 mL含5%血清的LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 h。每10 min取500μL菌液經(jīng)10 000 r/min離心10 min，0.45μm濾膜過濾上清液除菌。梯度稀釋除菌上清液6次，取第6次稀釋液200μL與1 mL菌液混合，靜置15 min，混入20 mL、37℃含5%血清的半固體LB培養(yǎng)基（瓊脂濃度0.5%），倒在提前制備的薄LB平板上，靜置10 min，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察噬菌斑個數(shù)，計數(shù)后計算滴度[9-10]。

2.5.2 噬菌體的抑菌試驗。取1 mL純化得到的噬菌體，梯度稀釋5次，分別與20 mL預先培養(yǎng)的無乳鏈球菌菌液混合，按照梯度順序記錄為5個試驗組，對照組只含有20 mL無乳鏈球菌菌液。6組樣品37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔20 min取1 mL用紫外分光儀在600 nm波長下測量OD值，測試6次，共2 h，計算每組平均值并記錄。

2.5.3 噬菌體熱穩(wěn)定性試驗。取噬菌體液等體積分裝若干管后，分別在水浴鍋內(nèi)20℃、30℃、40℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃處理 60 min。 經(jīng)10 000 r/min離心10 min，0.45μm濾膜過濾上清液除菌。梯度稀釋除菌上清液6次后采用雙層平板法統(tǒng)計噬菌斑滴度，計算噬菌體存活率（存活率=試驗組噬菌體暴發(fā)末期滴度/標準組噬菌體暴發(fā)末期滴度×100%），每組取平均數(shù)，記錄結(jié)果。

2.5.4 噬菌體紫外光照射試驗。將噬菌體液等體積分裝若干管，經(jīng)紫外光處理120 min，每隔15 min取出1組經(jīng)10 000 r/min離心10 min，0.45μm濾膜過濾上清液除菌。梯度稀釋除菌上清液6次，采用雙層平板法統(tǒng)計噬菌斑，計算存活率，每組取平均數(shù)，記錄結(jié)果。

2.5.5 噬菌體pH穩(wěn)定性試驗。將噬菌體液等體積分裝若干管，用酸堿滴定法測定試驗組pH值，設置pH值等于 3、4、5、6、7、8、9、10 的試驗組共 8 組， 對照組正常pH值。9組共同37℃水浴1 h，經(jīng)10 000 r/min離心10 min，0.45μm濾膜過濾。梯度稀釋除菌上清液6次后，采用雙層平板法統(tǒng)計噬菌斑，計算存活率，每組取平均數(shù)，記錄結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 活化無乳鏈球菌及對其耐藥性檢測

3.1.1 無乳鏈球菌染色鏡檢。活化的細菌經(jīng)革蘭氏染色為藍紫色、圓形，呈鏈球狀，大小均一，未發(fā)現(xiàn)雜菌，符合博杰手冊無乳鏈球菌特征（結(jié)果見圖1）。

圖1 無乳鏈球菌革蘭氏染色鏡檢圖（1 000x）

3.1.2 多重耐藥性無乳鏈球菌藥物敏感性試驗。藥敏試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在實驗室分離到的無乳鏈球菌對其中的4種抗生素（慶大霉素、氨芐西林、阿莫西林、盤尼西林）耐藥，對其他4種中度（鏈霉素、氯霉素、諾氟沙星、氧氟沙星）耐藥。

3.2 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體篩選及點樣試驗

3.2.1 多重耐藥性噬菌體點樣試驗。多重耐藥性無乳鏈球菌在雙層平板中的上層半固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，觀察到上層半固體培養(yǎng)基顏色均勻地變深，在點樣位置有顏色透明、邊緣光滑的噬菌斑（結(jié)果見圖2）。

圖2 噬菌體初步點樣結(jié)果

3.2.2 多重耐藥性噬菌體純化試驗。經(jīng)多次篩選，篩選出裂解性較強、噬菌斑多的一株單克隆噬菌體，噬菌體滴度為5.8×108PFU/mL，噬菌斑直徑為1.3 mm，噬菌體邊緣光滑、透明。圖3為經(jīng)5次梯度稀釋形成的擁有密集噬菌體斑的雙層平板。

圖3 噬菌體雙層平板試驗結(jié)果

3.3 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體生長特性試驗

3.3.1 噬菌體一步生長曲線。由于數(shù)值過大，圖表數(shù)據(jù)經(jīng)計算采用滴度值的Lg數(shù)值。第一階段10～30 min，是噬菌體的潛伏期，噬菌體結(jié)合多重耐藥性無乳鏈球菌，菌液中游離噬菌體減少，體現(xiàn)為10～30 min噬菌體滴度降低，在30 min降至最低點。第二階段30～80 min，是噬菌體的暴發(fā)期，表現(xiàn)為 30～80 min 噬菌體滴度呈快速增長，使噬菌體經(jīng)潛伏期在多重耐藥性無乳鏈球菌內(nèi)繁殖，裂解釋放新的噬菌體；新噬菌體再次侵染細菌，形成鏈式反應，噬菌體快速繁殖呈指數(shù)增長。第三階段80～120 min，噬菌體數(shù)達到最高，增長速度放緩，到達穩(wěn)定期，表現(xiàn)為80～120 min噬菌體滴度穩(wěn)定，是在經(jīng)歷快速增長后，菌液中的多重耐藥性無乳鏈球菌大部分被裂解，噬菌體獨自無法完成整個生命周期，增長速度放緩。經(jīng)試驗確定，噬菌體潛伏期約為30 min，暴發(fā)期約為60 min（結(jié)果見圖4）。

圖4 噬菌體一步生長曲線

3.3.2 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體抑菌試驗。在噬菌體對多重耐藥性無乳鏈球菌抑制試驗中，加入噬菌體液對多重耐藥性噬菌體有明顯的抑制作用，抑制效果與稀釋倍數(shù)呈負相關，隨著稀釋倍數(shù)增加，對多重耐藥性無乳鏈球菌的抑制效果降低。噬菌體梯度稀釋前3次的樣本基本可以在120 min內(nèi)使樣品內(nèi)無乳鏈球菌完全裂解（結(jié)果見圖5）。

圖5 噬菌體抑菌試驗

3.3.3 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體對溫度的敏感性試驗。噬菌體可在20～40℃條件下感染細菌并增殖，50℃熱處理30 min，噬菌體存活率降至78%，60℃處理30 min后，噬菌體存活率降至27%，大幅度降低。經(jīng)70℃處理30 min后，存活率降至5%，80℃處理30 min后完全失活（結(jié)果見圖6）。

圖6 溫度對噬菌體生長的影響

3.3.4 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體對紫外光敏感性試驗。試驗結(jié)果表明，隨著時間的延續(xù)，噬菌體生存率不斷降低，在處理1 0 m i n時降至4 0%，在處理2 0 m i n時降至1 2%，在處理3 0 m i n后，存活率降至零（結(jié)果見圖7）。

圖7 紫外光照射對噬菌體生長的影響

3.3.5 多重耐藥性無乳鏈球菌噬菌體對酸堿度的敏感性試驗。試驗結(jié)果表明，通過調(diào)節(jié)pH值，噬菌體在pH值為5～8時，存活率無明顯變化。當pH值降至5以下或升到8以上，噬菌體活性降低（結(jié)果見圖8）。

圖8 pH值對噬菌體生長的影響

4 討論

利用噬菌體預防與治療微生物感染早在20世紀初期就被提出。近些年耐藥性菌株不斷出現(xiàn)，而噬菌體治療細菌感染不易產(chǎn)生抗藥性，使得噬菌體療法的優(yōu)勢得以體現(xiàn)。目前國內(nèi)外學者開始利用耐藥性微生物進行篩選，尋找裂解譜寬、對耐藥性微生物抑制效果好的噬菌體。通過臨床動物試驗，對噬菌體療法的安全性和抑菌性進行評估，進而開發(fā)新的抑菌生物制劑[12-13]。

本試驗經(jīng)過初步驗證（革蘭氏染色試驗、生化管檢驗、藥敏片試驗），確定試驗菌種為一株多重耐藥性無乳鏈球菌，經(jīng)過分離提純得到的裂解性噬菌體，裂解性較強、噬菌斑多，有著暴發(fā)速度快，對溫度、酸堿度抗性高等優(yōu)點。但是潛伏期較長、容易被紫外線殺滅?？傮w上來說對多重耐藥性無乳鏈球菌的抑菌效果較好。在將來的研究中，有希望成為針對多重耐藥性無乳鏈球菌進行治療與預防的新型生物制劑。