張濤，謝紅兵，高安舉，楊清成

腦出血指腦血管破裂，引起血腫在腦組織中形成，而導致的腦組織非創(chuàng)傷性損傷[1]。腦出血具有較高的發(fā)病率及死亡率[2]。消除腦出血后血腫造成的周圍神經(jīng)損傷，是目前研究的熱點之一[3]。奧拉西坦(ORC)為4羥基2酮1吡咯烷乙酰胺類藥物，有研究[4]證實，其具有改善腦血管微循環(huán)障礙、促進神經(jīng)細胞可塑性修復(fù)、改善高血壓腦出血患者大腦認知功能和生活自理能力等作用。近來臨床報道[5]發(fā)現(xiàn)ORC也可緩解腦出血患者組織血腫、改善腦出血認識功能損傷。但其發(fā)揮腦保護的具體分子生物學途徑還不清楚。大量文獻[6-7]報道，組織中DNA損傷后，可促進環(huán)磷酸鳥苷-腺苷合成酶(cGAS)激活，并通過活化干擾素基因刺激因子(STING)表達，來調(diào)控炎性因子表達及趨化，從而介導免疫、炎性及凋亡反應(yīng)。另外，已有研究[8]證實，cGAS/STING通路可參與缺血性腦損傷神經(jīng)元炎性、氧化應(yīng)激、凋亡等生物學過程，來影響腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)進程。預(yù)示cGAS/STING也可能參與腦出血后血腫周圍組織神經(jīng)元損傷過程。本研究建立大鼠腦出血模型，從cGAS/STING通路方面探究并驗證ORC發(fā)揮腦出血后血腫周圍組織神經(jīng)元恢復(fù)的可能機制，以期為腦出血后神經(jīng)功能恢復(fù)的治療提供可靠的實驗資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物及細胞來源 SPF級SD大鼠90只，健康雄性，7～8周齡，200～220 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2020-0004。本實驗由本院動物使用倫理委員會(IACUC)批準(批號IACUC-105092)，符合3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 ORC(貨號：H78980，上海吉至生化科技有限公司)；cGAS抑制劑(RU.521)(貨號：HY-114180，購自MCE公司)、2.5-己酮可可堿(Vadimezan，DMXAA，STING激活劑)(貨號：HY-10964，購自MCE公司)；原位缺口末端標記法(TUNEL)染色、特恩布爾(TURNBULL)鐵染色試劑盒(貨號：ty-16893，yzy-gm4049，購自天津舍為斯生物技術(shù)有限公司、焦作云之羽生物科技有限公司)；兔抗大鼠cGAS多克隆抗體(貨號：QG12097，上海圻明生物科技有限公司)；STING(貨號：227704)、TNF-α(ab109322)、IL-12(ab106270)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase3)(貨號：ab184787)、B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)(貨號：ab194583)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(Tf)(貨號：ab181137)、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體(Tf R)(貨號：ab80194)、水通道蛋白4(APQ4)(貨號：ab259821)等兔抗大鼠多克隆抗體均購自美國abcam公司。TEM透射電鏡購自南京博恩生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立及分組給藥 參照文獻[9]麻醉大鼠，在腦立體定向儀下，于尾狀核部位用二次注血退針法，注入自體血80 μl，建立腦出血模型，術(shù)后6 h，大鼠成活，Berderson神經(jīng)功能缺損評分>1，視為造模成功。共造模成功75只，隨機分為模型組、ORC組(50 mg/kg)、RU.521組(cGAS抑制劑，50 mg/kg)、DMXAA組(STING激活劑，25 mg/kg)、ORC+DMXAA組，每組15只。另取15只大鼠，只于尾狀核部位刺針，不注入血液，作為假手術(shù)組。各組均于術(shù)后6 h開始給藥，ORC參照文獻[10]設(shè)置劑量并經(jīng)腹腔注射給藥；RU.521組及DMXAA組參照文獻[11-12]設(shè)置劑量，并經(jīng)尾靜脈注射給藥；模型組及假手術(shù)組經(jīng)腹腔注射給予等量生理鹽水，各組均連續(xù)給藥3 d，1次/d。給藥期間觀察大鼠死亡及活動狀況。

1.2.2 大鼠神經(jīng)功能缺損評分 參照文獻[13]用Berderson神經(jīng)功能缺損評分法對大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀進行評分。具體評分標準:提尾懸空1 m，觀察3～5 min。0分：雙前肢不完全伸展；1分：一側(cè)肢體長時間彎曲；2分：大鼠放于墊子上，抓住尾巴向不同方向拖拽滑動，癱瘓側(cè)抵抗力下降；3分：在2分基礎(chǔ)上伴自主轉(zhuǎn)圈行為。

1.2.3 大鼠腦含水量的檢測 隨機取6只大鼠，麻醉、斷頭處死，冰上開顱取腦，去除嗅球、小腦及延髓，吸凈組織表面血液。稱取濕重后，于60 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后稱取干重。根據(jù)公式：含水量=(濕重-干重)×100%，計算腦含水量。

1.2.4 大鼠血腫周圍組織電鏡檢測 取剩余大鼠，麻醉后斷頭取腦，取距血腫中心區(qū)外緣1 mm處，剪取0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm組織塊并分成三部分，一部分置于-80 ℃冰箱保存，一部分迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h，另一部分送電鏡室處理后鏡檢。

1.2.5 大鼠血腫周圍組織TUNEL染色、TURNBULL鐵染色檢測 取1.2.3項下，4%多聚甲醛中固定24 h的組織，透明、浸蠟、包埋后，切成5 μm切片，取部分切片，脫蠟、水化后，按TUNEL染色、TURNBULL鐵染色說明書的方法染色、封片后，在光鏡下觀察組織神經(jīng)元凋亡及組織鐵沉積的狀況。TUNEL染色切片用Image-pro plus軟件系統(tǒng)檢測陽性染色為棕黃色的凋亡細胞數(shù)目，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。鐵染色切片，取5個不重疊區(qū)高倍(×400)視野，用IMAGE 6.0圖像分析系統(tǒng)分析鐵沉積的平均光密度值。

1.2.6 免疫組織化學法測血腫周圍組織cGAS陽性表達 取1.2.4中剩余石蠟切片，脫蠟、水化及抗原修復(fù)后，加入一抗(cGAS，1∶200)4 ℃孵育過夜，加入山羊抗兔二抗(1∶800)室溫孵育1.5 h，蘇木精復(fù)染、封片后，光鏡下觀察拍照，用Image Pro-Plus 6.0軟件分析測量單位面積內(nèi)陽性染色的平均光密度值。

1.2.7 Western blotting法檢測血腫周圍組織STING、TNF-α、IL-12、caspase3、Bcl-2、Tf、Tf R、APQ4的表達 取1.2.3項下-80 ℃凍存的血腫周圍組織，4 ℃解凍后，冰上勻漿、裂解及軸提蛋白、二喹啉甲酸(BCA)法測蛋白濃度后，取100 μg蛋白樣品，行電泳及轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，加入一抗STING、TNF-α、IL-12、caspase3、Bcl-2抗體(1∶1 500)，內(nèi)參β-actin(1∶2 000)，4 ℃濕盒孵育過夜，辣根過氧化物酶二抗(1∶2 000)室溫孵育1.5 h，增強化學發(fā)光法顯影，化學發(fā)光成像儀分析系統(tǒng)曝光拍照，以Image J系統(tǒng)檢測蛋白相對表達水平。

2 結(jié) 果

2.1 ORC對腦出血大鼠一般行為狀況、神經(jīng)功能缺損的影響 假手術(shù)組大鼠無死亡，飲食及活動正常，神經(jīng)功能缺損行為評分0分。與假手術(shù)組相比，模型組及ORC+DMXAA組大鼠均有2只死亡，飲食活動減少，且出現(xiàn)無自主意識、偏癱及側(cè)旋轉(zhuǎn)等神經(jīng)功能缺損行為，神經(jīng)功能缺損行為評分[(2.16±0.23)分、(2.01±0.24)分]明顯升高(均P<0.05)；ORC組及RU.521組大鼠無死亡，飲食活動有所增加，神經(jīng)功能缺損評分明顯降低[(1.08±0.12)分、(1.06±0.13)分](均P<0.05)；DMXAA組大鼠有4只死亡，飲食活動量進一步減少，神經(jīng)功能缺損評分明顯升高[(2.99±0.20)分](P<0.05)。

2.2 ORC對腦出血大鼠血腫周圍組織cGAS/STING通路蛋白表達的影響 見圖1、表1。免疫組化顯示，cGAS在血腫周圍組織神經(jīng)元細胞胞漿中呈弱陽性表達。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫周圍組織cGAS陽性表達、STING蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。ORC組及RU.521組大鼠血腫周圍組織cGAS陽性表達、STING蛋白表達均明顯降低(均P<0.05)；DMXAA組大鼠血腫周圍組織cGAS陽性表達、STING蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。與ORC組相比，ORC+DMXAA組大鼠血腫周圍組織cGAS陽性表達、STING蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。

圖1 大鼠血腫周圍組織cGAS圖(免疫組化染色，×200)。cGASY 陽性表達呈黃棕色，假手術(shù)組黃色染色最淺，模型組黃棕色染色加深，DMXAA組染色最深，ORC與RU.521組染色變淺，ORC+DMXAA組染色較ORC組加深

表1 大鼠血腫周圍組織cGAS陽性表達、STING蛋白表達的比較(x±s)組別只數(shù)cGAS(平均光密度/mm2)STING/β-actin假手術(shù)組90.21±0.031.03±0.09模型組71.56±0.13*1.97±0.19*ORC組91.03±0.10△1.50±0.15△RU.521組91.17±0.11△1.54±0.15△DMXAA組52.92±0.20△▲2.57±0.21△▲ORC+DMXAA組71.57±0.14▲1.98±0.19▲ 注:與假手術(shù)比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與ORC組比較▲P<0.05

2.3 ORC對腦出血大鼠血腫周圍組織水腫的影響見表2、表3。與假手術(shù)組比，模型組大鼠腦含水量、血腫周圍組織APQ4蛋白均明顯升高(均P<0.05)。與模型組相比，ORC組及RU.521組大鼠腦含水量、血腫周圍組織APQ4均明顯降低(均P<0.05)；DMXAA組大鼠腦含水量、血腫周圍組織APQ4均明顯升高(均P<0.05)。與ORC組相比，ORC+DMXAA組大鼠腦含水量、血腫周圍組織APQ4表達均明顯升高(均P<0.05)。

表2 大鼠腦含水量的比較(x±s)組別只數(shù)腦含水量(%)假手術(shù)組678.05±0.26模型組682.57±0.35*ORC組680.93±0.29△RU.521組680.97±0.28△DMXAA組684.56±0.35△▲ORC+DMXAA組682.34±0.24▲ 注:與假手術(shù)比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與ORC組比較▲P<0.05

表3 大鼠血腫周圍組織APQ4蛋白表達比較(x±s)組別只數(shù)APQ4/β-actin假手術(shù)組91.17±0.07模型組72.02±0.20*ORC組91.59±0.15△RU.521組91.62±0.16△DMXAA組52.83±0.20△▲ORC+DMXAA組72.05±0.21▲ 注:與假手術(shù)比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與ORC組比較▲P<0.05

2.4 ORC對腦出血大鼠血腫周圍組織鐵沉積的影響 見圖2、表4。組織鐵染色檢測結(jié)果顯示，假手術(shù)組大鼠血腫周圍組織幾乎未見鐵沉積，模型組大鼠可見血腫周圍組織棕褐色鐵沉積加深。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫周圍組織鐵沉積平均光密度值、Tf、Tf R蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。ORC組及RU.521組大鼠血腫周圍組織鐵沉積平均光密度值、鐵調(diào)控相關(guān)蛋白-Tf、Tf R蛋白表達均明顯降低(均P<0.05)；DMXAA組大鼠血腫周圍組織鐵沉積平均光密度值、鐵調(diào)控相關(guān)蛋白-Tf、Tf R蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。與ORC組相比，ORC+DMXAA組大鼠血腫周圍組織鐵沉積平均光密度值、鐵調(diào)控相關(guān)蛋白-Tf、Tf R蛋白表達均明顯升高(均P<0.05)。

圖2 大鼠血腫周圍組織鐵染色圖(TURNBULL鐵染色，×10)

表4 大鼠血腫周圍組織鐵沉積及Tf、Tf R蛋白表達比較(x±s)組別只數(shù)鐵沉積(平均光密度/mm2)Tf/β-actinTf R/β-actin假手術(shù)組90.21±0.011.10±0.101.08±0.08模型組71.66±0.16*1.94±0.19*2.04±0.22*ORC組91.09±0.09△1.51±0.15△1.61±0.16△RU.521組91.10±0.10△1.54±0.14△1.64±0.15△DMXAA組51.96±0.18△▲2.58±0.21△▲2.78±0.21△▲ORC+DMXAA組71.67±0.17▲1.99±0.19▲2.07±0.22▲ 注:與假手術(shù)組比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與ORC組比較▲P<0.05

2.5 ORC對腦出血大鼠血腫周圍組織結(jié)構(gòu)損傷及凋亡的影響 見圖3。電鏡染色顯示，模型組大鼠神經(jīng)元水腫、核仁消失、細胞器減少、線粒體嵴及膜融合且模糊不清。TUNEL染色可見凋亡神經(jīng)元染色加深。與假手術(shù)組[(3.05±0.16)%]相比，模型組[(29.57±1.05)%]神經(jīng)元細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，大鼠血腫周圍組織神經(jīng)元水腫嚴重。ORC組[(16.93±0.59)%]及RU.521組[(16.97±0.48)%]凋亡率明顯降低(P<0.05)，大鼠血腫周圍組織水腫緩解；DMXAA組[(35.56±0.95)%]凋亡率進一步明顯升高(P<0.05)，大鼠血腫周圍組織水腫加重。與ORC組相比，ORC+DMXAA組[(28.94±0.99)%]凋亡率明顯升高(P<0.05)，大鼠血腫周圍組織水腫加重。

圖3 大鼠血腫周圍組織電鏡(×30 000)及TUNEL染色(×400)檢測圖

2.6 ORC對腦出血大鼠血腫周圍組織STING通路相關(guān)蛋白TNF-α、IL-12、caspase3、Bcl-2表達的影響見圖4、表5。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠血腫周圍組織TNF-α、IL-12、caspase3蛋白表達明顯升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。ORC組及RU.521組TNF-α、IL-12、caspase3蛋白表達明顯降低(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯升高(P<0.05)；DMXAA組大鼠TNF-α、IL-12、caspase3蛋白表達明顯升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與ORC組相比，ORC+DMXAA組大鼠TNF-α、IL-12、caspase3蛋白表達明顯升高(均P<0.05)，Bcl-2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。

圖4 大鼠血腫周圍組織TNF-α、IL-12、caspase3、Bcl-2蛋白表達免疫印跡圖組

表5 大鼠血腫周圍組織TNF-α、IL-12、caspase3、Bcl-2蛋白表達比較(x±s)組別只數(shù)TNF-α/β-actinIL-12/β-actincaspase3/β-actinBcl-2/β-actin假手術(shù)組91.08±0.091.07±0.071.01±0.071.04±0.08模型組71.83±0.18*1.94±0.19*1.77±0.19*0.44±0.04*ORC組91.49±0.12△1.58±0.21△1.41±0.11△0.71±0.07△RU.521組91.51±0.15△1.64±0.12△1.44±0.14△0.70±0.07△DMXAA組52.45±0.21△▲2.58±0.26△▲2.38±0.15△▲0.18±0.01△▲ORC+DMXAA組71.87±0.20▲1.99±0.19▲1.76±0.16▲0.49±0.04▲ 注:與假手術(shù)相比較*P<0.05;與模型組比較△P<0.05;與ORC組比較▲P<0.05

3 討 論

腦出血為急性腦血管疾病中最嚴重的一種，也是導致中老年死亡的主要疾病之一。目前研究[14]發(fā)現(xiàn)，血腫周圍水腫與腦出血患者生存及預(yù)后關(guān)系密切。大量文獻[15]研究證實，腦出血患者超急性期，血漿蛋白可引起腦組織水腫的形成，另外血腫的破壞作用可引起周圍組織血流量及代謝水平降低，導致血腫周圍組織神經(jīng)細胞缺失、變性及死亡，而加重腦損傷。Yogendrakumar等[16]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，血腫周圍水腫2 h后開始增多，在3～4 d時可達到高峰，7 d時仍然存在。郭純等[9]發(fā)現(xiàn)，腦出血后3 d，血腫可導致紅細胞破壞裂解，而釋放大量血紅素，血紅素催化分解生成鐵離子在腦組織中大量沉積，可加重腦組織損傷及神經(jīng)細胞壞死，且腦出血后，鐵離子沉積隨著時間的延長而升高。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠腦組織可見棕褐色鐵沉積顯著增加，水腫周圍組織神經(jīng)元水腫、變形及凋亡明顯，大鼠腦含水量增加，且出現(xiàn)死亡、無自主意識、偏癱及側(cè)旋轉(zhuǎn)等神經(jīng)功能缺損行為，表示造模成功。

APQ4可介導水分子跨膜轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)腦組織水液代謝，其水平異?？煞从衬X水腫的形成與吸收狀況[17]；Tf可把鐵結(jié)合到Tf R，來促使腦細胞攝取鐵。Chen等[18]發(fā)現(xiàn)，腦出血后Tf R表達異常增加，可促進Tf進入到腦實質(zhì)細胞中，從而促進鐵轉(zhuǎn)運進入腦組織中來損傷神經(jīng)細胞。本研究也在模型組大鼠腦組織中檢測到APQ4及Tf、Tf R蛋白表達升高，神經(jīng)元凋亡率升高，進一步表明造模成功。ORC為促智類藥，臨床報道[19]發(fā)現(xiàn)其對改善高血壓類腦出血患者神經(jīng)功能損傷有較好的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，給予ORC干預(yù)治療后，大鼠死亡及偏癱、側(cè)旋轉(zhuǎn)等神經(jīng)功能缺損行為減少，腦水腫、腦血腫周圍組織神經(jīng)元變性、死亡及凋亡明顯緩解，APQ4及Tf、Tf R蛋白表達明顯降低，鐵染色分布也明顯減少，提示ORC對腦出血后血腫周圍組織神經(jīng)元損傷有緩解作用，其可能為治療腦出血后神經(jīng)功能缺損的潛在藥物，但其具體機制還需進一步探究。

近來研究[14]發(fā)現(xiàn)，腦出血后血液中的血漿蛋白、血紅素、凝血酶等成分均可引起血腫周圍組織發(fā)生炎性及氧化應(yīng)激反應(yīng)，而造成神經(jīng)細胞毒性損傷。Rasmussen等[15]發(fā)現(xiàn)凝血酶能釋放TNF-α、IL-12及IL-6等炎性因子來促進炎癥反應(yīng)，引起腦出血后血腫周圍水腫形成，加重腦損傷。本研究也在模型大鼠血腫周圍組織中檢測到TNF-α、IL-12蛋白表達的升高，提示炎癥反應(yīng)也可能是引起腦出血后血腫周圍組織損傷的重要機制。cGAS/STING是介導炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激反應(yīng)，并參與神經(jīng)元細胞凋亡的重要通路[20]。研究[7]證實，組織損傷、炎癥應(yīng)激反應(yīng)、病毒感染等均可刺激胞質(zhì)中的cGAS與dsDNA結(jié)合而活化，活化的cGAS可促進胞質(zhì)中的STING與胞質(zhì)中的DNA結(jié)合形成二聚體并轉(zhuǎn)移至核周區(qū)域發(fā)生活化，從而調(diào)控TNF-α、IL-12等炎癥因子的表達，參與免疫炎性反應(yīng)、炎癥與非炎癥性疾病過程。另外cGAS/STING也與細胞凋亡關(guān)系密切。Wu等[21]發(fā)現(xiàn)，凋亡相關(guān)蛋白Bcl2樣蛋白4可誘導線粒體DNA滲漏到細胞質(zhì)中，激活cGAS/STING通路，引起器官組織炎癥反應(yīng)及衰竭、死亡。Kwon等[22]發(fā)現(xiàn)，抑制cGAS/STING介導的炎癥反應(yīng)，可清除谷氨酸毒性并防止神經(jīng)膠質(zhì)細胞的凋亡和線粒體損傷，并有望成為帕金森病和Alzheimer’s病的關(guān)鍵治療機制。本研究發(fā)現(xiàn)，cGAS在模型大鼠血腫周圍組織神經(jīng)元細胞胞漿中呈強陽性表達，用RU.521阻斷cGAS在胞漿中表達后，STING及炎癥因子TNF-α、IL-12表達降低，血腫周圍組織沉積、水腫、神經(jīng)元損傷及凋亡均明顯緩解，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀也明顯得到改善，反之，用DMXAA進一步激活STING表達后，cGAS及TNF-α、IL-12表達升高，大鼠死亡、鐵沉積及神經(jīng)功能損傷進一步加重。提示cGAS/STING通路活化可能參與腦出血大鼠血腫周圍神經(jīng)元炎癥反應(yīng)及凋亡過程。ORC組大鼠血腫周圍組織中cGAS/STING通路、炎癥反應(yīng)、凋亡、鐵沉積等均處于抑制狀態(tài)，神經(jīng)功能缺損也明顯改善，提示ORC可能通過抑制cGAS/STING通路活化，緩解腦出血大鼠血腫周圍神經(jīng)元炎癥損傷，繼而緩解神經(jīng)功能缺損。而STING激活劑DMXAA可逆轉(zhuǎn)ORC上述作用。

綜上所述，ORC可能通過抑制cGAS/STING通路活化，緩解腦出血大鼠血腫周圍神經(jīng)元炎癥損傷及凋亡，減輕神經(jīng)功能缺損。但cGAS/STING通路下游調(diào)控機制復(fù)雜，涉及多個靶蛋白多條途徑共同調(diào)節(jié)，腦出血后血腫周圍組織損傷機制也相當復(fù)雜，還涉及血-腦屏障的破壞。ORC發(fā)揮腦出血后神經(jīng)功能改善的其他機制，還有待后續(xù)繼續(xù)深入研究。