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中華眼鏡蛇毒對(duì)大鼠凝血功能的影響

2022-07-15 06:11:38許林魏穎徐書靜張啟云郭靜周舒婷孫黔云
關(guān)鍵詞:眼鏡蛇力圖凝血因子

許林,魏穎,徐書靜,張啟云,郭靜,3,周舒婷,孫黔云*

(1. 貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,貴陽(yáng) 550025;2. 貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴陽(yáng) 550014;3. 山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心,太原 030006)

蛇傷是危害勞動(dòng)者生命健康的全球公共衛(wèi)生問題,根據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道,每年毒蛇咬傷多達(dá)270 萬(wàn)人,其中眼鏡蛇傷較為普遍[1]。 在我國(guó),眼鏡蛇傷的發(fā)病率居蛇傷的第二位(16.68%),病死率為1.6%,其臨床表現(xiàn)主要有局部水腫,壞死,麻痹,運(yùn)動(dòng)障礙等[2-3]。 臨床眼鏡蛇傷患者中有的表現(xiàn)出凝血功能的異常[4],而有的患者沒有表現(xiàn)出凝血功能的異常[5],由于臨床蛇傷的復(fù)雜性,對(duì)于凝血功能的異常是否是眼鏡蛇傷的必然結(jié)果并沒有明確的結(jié)論,迄今關(guān)于眼鏡蛇毒對(duì)凝血功能的影響研究較少,且早期研究大多采用血漿測(cè)定凝血4 項(xiàng)[6-7],測(cè)定過程無(wú)血細(xì)胞參與,無(wú)法完全反映凝血變化過程,因此有必要進(jìn)一步開展眼鏡蛇毒對(duì)凝血功能的影響研究。 本研究基于全血凝血功能測(cè)定的方法,進(jìn)行眼鏡蛇毒對(duì)大鼠凝血功能的影響,以期為臨床救治及相關(guān)新藥研究提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

80 只 6 周齡 SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠,體重 180 ~200 g,購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2019-0008】。 SPF 級(jí)飼料購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司【京飼證(2019)06076】,飼養(yǎng)環(huán)境:相對(duì)濕度40% ~70%,溫度控制在22 ~25℃,飼養(yǎng)期間各組大鼠自由飲水,飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(黔)2018-0001】。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查通過(審批號(hào):No.2101082),動(dòng)物福利均符合相關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.1.2 主要試劑與儀器

中華眼鏡蛇毒(Naja atravenom)凍干粉(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室),蛋白分離介質(zhì) SP Sephadex C-25(GE Heathcare 公司,美國(guó)),血栓彈力圖試劑盒普通杯(北京樂普生物科技有限公司,中國(guó)),乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司,中國(guó)),vWF 以及P-selectin 試劑盒(武漢基因美科技有限公司,中國(guó));纖維蛋白原( fibrinogen,F(xiàn)IB)試劑盒(上海太陽(yáng)生物技術(shù)有限公司,中國(guó)),纖溶酶底物S2251、凝血因子Ⅹa 底物S2765、凝血酶底物S2238、組織型纖溶酶原激活劑底物S2288、血漿激肽酶底物底物S2302(上海船夫生物技術(shù)有限公司,中國(guó)),其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純,符合實(shí)驗(yàn)要求。

CFMS LEPU-8800 血栓彈力圖儀(北京樂普生物科技有限公司,中國(guó)),Spectra MAX-190 連續(xù)波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Molecular Devices 公司,美國(guó)),Milli Q 超純水系統(tǒng)(Millipore 公司,美國(guó)),5810R 冷凍離心機(jī)(Eppendorf 公司,德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 眼鏡蛇毒及其分離峰制備

稱取0.1 g 眼鏡蛇蛇毒凍干粉溶于1 mL PBS緩沖液,3000 rpm 離心10 min,取上清分裝凍存。

經(jīng)SP Sephadex C-25 柱分離眼鏡蛇毒,參照文獻(xiàn)[8]收集樣品,編號(hào)為FⅠ~ FⅦ。 測(cè)定OD 值后換算成蛋白含量,再使用含0.15 mol/L NaCl 的醋酸鈉緩沖液稀釋成所需要的濃度后分裝凍存。

1.2.2 動(dòng)物樣本采集

(1)體外實(shí)驗(yàn):10 只SPF 級(jí)雄性SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后禁食12 h,腹腔注射10 mg/mL 戊巴比妥鈉麻醉,經(jīng)腹主動(dòng)脈取血,枸櫞酸鈉抗凝管中混勻,每?jī)芍换旌虾蠊仓苽?0 mL 全血,一共5 批全血供實(shí)驗(yàn)使用。 取眼鏡蛇蛇毒、FⅠ~FⅦ分離峰不同濃度50 μL 加入至1 mL 大鼠全血中,以 PBS 為對(duì)照,混勻,37℃孵育 30 min,取 340 μL 血樣測(cè)定血栓彈力圖,其余血樣3000 rpm 離心10 min,取上清分裝凍存。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置眼鏡蛇蛇毒高、中、低劑量組為125、12.5、1.25 μg/mL;FⅠ ~ FⅦ為 25 μg/mL;FI 高、中、低劑量組為 25、2.5、0.8 μg/mL;FⅥ高、中、低劑量組為 50、25、12.5 μg/mL。 上述濃度均為終濃度。

(2)體內(nèi)實(shí)驗(yàn):70 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d,隨機(jī)分為肌肉注射組、尾靜脈注射組和PBS 對(duì)照組,每組6 ~9 只不等,分別將眼鏡蛇毒0.5 mg/kg一次性尾靜脈注射和1 mg/kg 一次性肌肉注射至大鼠體內(nèi),于注射后 0.5、1、2、6 h 取血,將血樣混勻后取340 μL 血樣進(jìn)行血栓彈力圖測(cè)定,其余血樣3000 rpm 離心10 min,取上清分裝凍存。

1.2.3 血栓彈力圖(TEG)測(cè)定

血栓彈力圖普通杯測(cè)試試劑盒恢復(fù)至室溫,血栓彈力圖儀升溫至37℃,取全血血樣1 mL 與試劑1混合,顛倒 4 ~ 5 次后靜置 4 min,取 340 μL 血樣加入普通杯杯槽中,加入20 μL 試劑2,測(cè)定血栓彈力圖。

1.2.4 LDH 活性測(cè)定

取體內(nèi)或體外制備的大鼠血漿按照酶活測(cè)定方法測(cè)定LDH 活性。

按式(1)計(jì)算LDH 活性(U/L):

1.2.5 血漿血紅蛋白含量測(cè)定

取體內(nèi)或體外制備的血漿用PBS 稀釋10 倍后取200 μL 加入96 孔板,于412 nm 處測(cè)定吸光度,以A412nm值表示血紅蛋白含量。

1.2.6 酶切發(fā)色底物活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[9],取體內(nèi)或體外制備的血漿采用單一時(shí)間點(diǎn)法和酶動(dòng)力學(xué)方法測(cè)定酶切纖溶酶底物S2251、凝血因子Ⅹa 底物S2765、凝血酶底物S2238、組織型纖溶酶原激活劑底物S2288、血漿激肽酶底物 S2302 活 性, 以 1 mg/mL 原 矛 頭 蝮 蛇 毒(Protobothrops mucrosquamatusvenom,PMV)為陽(yáng)性對(duì)照,PBS 為陰性對(duì)照,取血漿 20 μL 或 40 μL、相關(guān)底物 40 μL 或 20 μL、PBS 40 μL,總體系為 100 μL,混勻后37℃恒溫避光孵育,設(shè)置孵育時(shí)間4 或6 h、間隔檢測(cè)時(shí)間15 或30 min 測(cè)定A405nm。

1.2.7 FIB、P-selectin、vWF 含量

取制備的血漿采用 ELISA 法測(cè)定 P-selectin、vWF 含量,采用凝固法測(cè)定FIB 含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 眼鏡蛇毒分離峰的制備

眼鏡蛇毒經(jīng)SP Sephadex C-25 分離后獲得7 個(gè)主要分離峰(圖1)。 命名為FⅠ~FⅦ。

圖1 眼鏡蛇毒SP-Sephadex C-25 層析圖Figure 1 Ion-exchange chromatography of Naja atra venom on a SP-Sephadex C-25 column

2.2 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 血栓彈力圖結(jié)果

表1 顯示,與空白組相比,F(xiàn)Ⅰ、FⅥ、FⅦ分離峰能顯著延長(zhǎng)R 值(P<0.05),提示凝血因子性低凝。 FⅣ、FⅤ、FⅥ分離峰顯著減小 Angle 值(P<0.05),表明纖維蛋白原功能性低凝。 FⅢ、FⅣ、FⅤ、FⅥ、FⅦ分離峰 CI 值顯著減小(P< 0.05),提示血液處于低凝狀態(tài)。

表1 FⅠ~FⅦ血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 1 Results of TEG of FⅠ~FⅦ(, n = 3)

表1 FⅠ~FⅦ血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 1 Results of TEG of FⅠ~FⅦ(, n = 3)

注:與空白組相比,*P < 0.05,**P < 0.01。 (下表同)Note. Compared with control group,*P < 0.05,**P < 0.01. (The same in the following tables)

組別Groups凝血因子激活時(shí)間(min)R(min)血塊形成速率(min)K(min)血凝速率(°)Angle(°)最大振幅(mm)MA(mm)綜合凝血指數(shù)CI對(duì)照 Control 1.73 ± 0.06 0.80 ± 0.00 79.47 ± 0.80 75.10 ± 3.05 6.00 ± 0.36 FⅠ 30.13 ± 2.15** - - - -FⅡ 2.03 ± 0.21 1.07 ± 0.38 75.93 ± 5.57 70.03 ± 3.99 4.80 ± 1.04 FⅢ 2.27 ± 0.50 1.10 ± 0.30 75.03 ± 3.75 70.40 ± 3.70 4.60 ± 0.70*FⅣ 3.57 ± 1.10 1.30 ± 0.36 71.63 ± 4.44* 69.27 ± 4.20 3.27 ± 0.78**FⅤ 3.23 ± 0.81 1.10 ± 0.17 73.90 ± 1.95** 69.97 ± 2.97 3.83 ± 0.55**FⅥ 3.57 ± 0.68* 1.63 ± 0.42 65.40 ± 4.03** 67.17 ± 2.06* 2.47 ± 0.95**FⅦ 2.67 ± 0.42* 0.87 ± 0.12 76.57 ± 3.27 73.03 ± 2.68 4.83 ± 0.32*

表2 可知,與空白組相比 FⅠ(25、2.5 μg/mL)及 FⅥ(50 μg/mL)均延長(zhǎng) R 值(P< 0.01)。 除 FⅠ(25 μg/mL),F(xiàn)Ⅰ、FⅥ其余各濃度均增大 K 值(P<0.05),減小 Angle 值(P< 0.05),提示纖維蛋白原功能性低凝。 FⅥ(50、25 μg/mL)減小 MA(P<0.05),提示血小板性低凝。 FⅠ、FⅥ各濃度均降低CI 值(P< 0.05)。

表2 FⅠ和FⅥ血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 2 Results of TEG of FⅠand FⅥ(, n = 3)

表2 FⅠ和FⅥ血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 2 Results of TEG of FⅠand FⅥ(, n = 3)

組別Groups凝血因子激活時(shí)間(min)R(min)血塊形成速率(min)K(min)血凝速率(°)Angle(°)最大振幅(mm)MA(mm)綜合凝血指數(shù)CI對(duì)照 Control 1.73 ± 0.06 0.80 ± 0.00 79.47 ± 0.8 75.10 ± 3.05 6.00 ± 0.36 FⅠ25.0 30.13 ± 2.15** - - - -2.5 2.80 ± 0.26** 1.73 ± 0.21* 66.67 ± 2.74** 64.77 ± 6.38 2.70 ± 0.95**0.8 3.20 ± 0.95 1.43 ± 0.21* 70.43 ± 2.19** 68.77 ± 2.11* 3.33 ± 0.50**FⅥ50.0 3.07 ± 0.15** 1.70 ± 0.10** 66.67 ± 2.20** 60.43 ± 6.16* 2.03 ± 0.91**25.0 3.07 ± 0.64 1.37 ± 0.12* 68.60 ± 3.39** 67.10 ± 2.17* 3.10 ± 0.26**12.5 2.27 ± 0.32 1.37 ± 0.15* 70.90 ± 1.08** 67.53 ± 8.51 3.83 ± 0.92*

表3 顯示,眼鏡蛇毒(125、12.5 μg /mL)延長(zhǎng) R值(P< 0.01)。 3 個(gè)濃度均降低 Angle 值(P<0.01),降低 CI 值(P< 0.01),且濃度越大,CI 值越小。

表3 眼鏡蛇毒不同濃度血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 3 Results of TEG with different concentrations of Naja atra venom(, n = 3)

表3 眼鏡蛇毒不同濃度血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果(, n = 3)Table 3 Results of TEG with different concentrations of Naja atra venom(, n = 3)

組別Groups凝血因子激活時(shí)間(min)R(min)血塊形成速率(min)K(min)血凝速率(°)Angle(°)最大振幅(mm)MA(mm)綜合凝血指數(shù)CI對(duì)照 Control 1.73 ± 0.06 0.80 ± 0.00 79.47 ± 0.80 75.10 ± 3.05 6.00 ± 0.36眼鏡蛇毒Naja atra venom 125.00 6.23 ± 0.06** 2.40 ± 0.44* 59.87 ± 5.20* 63.03 ± 5.45* 0.23 ± 0.40**12.50 3.63 ± 0.29** 1.60 ± 0.60 65.23 ± 2.98** 71.40 ± 3.91 2.93 ± 0.72**1.25 2.80 ± 0.00 1.13 ± 0.06** 74.30 ± 0.72** 69.50 ± 0.85* 4.10 ± 0.10**

圖2 可知眼鏡蛇毒 12.5 μg/mL、FⅠ 2.5 μg/mL、FⅥ25 μg/mL 濃度下血栓彈力圖與對(duì)照組相比均產(chǎn)生明顯變化。

圖2 體外孵育后大鼠全血血栓彈力圖變化Note. A. Control. B. Naja atra venom 12.5 μg/mL. C. FⅠ 2.5 μg/mL. D. FⅥ 25 μg/mL.Figure 2 Changes of whole blood TEG in rats after in vitro incubation

2.2.2 LDH 結(jié)果

圖3 顯示,與空白組相比,眼鏡蛇蛇毒(125、12.5 μg/mL)、FⅠ (25、2.5 μg/mL)、FⅣ及 FⅦ分離峰孵育后血漿顯著增高LDH 活力(P<0.05)。

圖3 體外孵育后大鼠血液中LDH 變化(, n = 3)Note. A. Naja atra venom in different concentrations. B. FⅠ~FⅦ. C. FⅠ in different concentrations. D. FⅥ in different concentrations.Compared with control,*P < 0.05,**P < 0.01. (The same in the following figures).Figure 3 Changes of LDH in the blood of rats after in vitro incubation(, n = 3)

2.2.3 血紅蛋白含量

圖4 可知眼鏡蛇蛇毒(125、12.5、1.25 μg/mL)、FⅠ(25、2.5、0.8 μg/mL)、FⅡ、FⅣ、FⅥ(50、25、12.5 μg/mL)及FⅦ分離峰血紅蛋白含量顯著升高(P< 0.05)。

圖4 體外孵育后大鼠血液中血紅蛋白含量變化Note. A. Naja atra venom in different concentrations. B. FⅠ~FⅦ. C. FⅠ in different concentrations. F. FⅥ in different concentrations.Figure 4 Changes of hemoglobin content in rat blood after in vitro incubation

2.2.4 酶切發(fā)色底物活性測(cè)定結(jié)果

由圖 5A、5B、5C、5D 可知與空白組相比眼鏡蛇毒(125、12.5、1.25 μg/mL)及 FⅥ分離峰(50、25 μg/mL)均下調(diào)酶切凝血酶 S2238 底物活力(P<0.05)。

由圖5E、5F 可知空白組相比眼鏡蛇毒(125、12.5、1.25 μg/mL)酶切纖溶酶 S2251 底物活性隨濃度增加而減小(P< 0.05)。 圖 5G、5H、5I、5J、5K、5L 可知 FⅠ、FⅡ、FⅢ、FⅥ(50、25 μg/mL)、FⅦ分離峰酶切纖溶酶底物 S2251 活性均顯著上調(diào)(P<0.05)。

圖5 體外孵育后血漿酶切S2238 和S2251 底物酶動(dòng)力學(xué)曲線及酶活力變化(, n = 3)Note. A, B. Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2238 of Naja atra venom in different concentrations. C, D.Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2238 of FⅥ in different concentrations. E, F. Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2251 of Naja atra venom in different concentrations. G, H. Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2251 of FⅠ in different concentrations. I, J. Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2251 of FⅥ in different concentrations. K, L. Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2251 of FⅠ~ FⅦ.Figure 5 Changes of enzyme kinetic curves and enzymatic activities of cleaving S2238 and S2251 in plasma after incubation in vitro(, n = 3)

2.3 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 血栓彈力圖結(jié)果

表4 可知,肌肉注射組 0.5、2、6 h 內(nèi) K 值顯著增大(P< 0.05),Angle 及 CI 值 6 h 內(nèi)顯著減小(P< 0.01),1 ~ 6 h MA 值顯著減小(P< 0.01),且該注射方式6 h 出現(xiàn)一定程度的纖溶亢進(jìn),與空白組相比具有顯著性差異(P<0.01),提示低凝出血風(fēng)險(xiǎn)增大。 由表5 可知,靜脈注射眼鏡蛇毒1 h 內(nèi)K值顯著增大(P< 0.05),Angle、MA、CI 顯著減小(P<0.01),1 h 達(dá)最小值,提示低凝出血風(fēng)險(xiǎn)增大。由圖6 可知肌肉注射和尾靜脈注射組血栓彈力圖與空白組相比均有明顯變化。

圖6 注射眼鏡蛇毒后大鼠血栓彈力圖變化Note. A. Intramuscular injection control. B. Intravenous injection 2 h. C. Intramuscular injection control. D. Intravenous injection 1 h.Figure 6 Changes of TEG after injection of Naja atra venom in rats

表4 肌肉注射組不同時(shí)間點(diǎn)血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果()Table 4 Results of TEG at different time points in intramuscular injection group()

表4 肌肉注射組不同時(shí)間點(diǎn)血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果()Table 4 Results of TEG at different time points in intramuscular injection group()

Groups n 凝血因子激活時(shí)間(min)R(min)組別 血塊形成速率(min)K(min)血凝速率(°)Angle(°)最大振幅(mm)MA(mm)綜合凝血指數(shù)CI纖溶速率(%)LY30(%)對(duì)照 Control 6 1.78 ± 0.57 0.80 ± 0.00 81.87 ± 1.96 75.42 ± 1.84 6.17 ± 0.56 0.00 ± 0.00 0.5 h 7 2.96 ± 1.05* 1.04 ± 0.21* 75.09 ± 3.74** 70.76 ± 4.97 4.23 ± 1.27** 0.00 ± 0.00 1 h 7 2.44 ± 0.96 1.03 ± 0.25 75.77 ± 4.11** 69.71 ± 3.33** 4.15 ± 1.07** 0.00 ± 0.00 2 h 9 2.43 ± 0.66 1.14 ± 0.36* 74.47 ± 5.28** 67.78 ± 5.44** 4.13 ± 1.46** 0.00 ± 0.00 6 h 6 2.50 ± 0.43* 0.95 ± 0.14* 76.78 ± 1.75** 69.68 ± 4.00** 4.58 ± 0.46** 8.65 ± 8.01**

表5 尾靜脈注射組不同時(shí)間點(diǎn)血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果()Table 5 Results of TEG at different time points in intravenous injection group()

表5 尾靜脈注射組不同時(shí)間點(diǎn)血栓彈力圖測(cè)定結(jié)果()Table 5 Results of TEG at different time points in intravenous injection group()

Groups n 凝血因子激活時(shí)間(min)R(min)組別 血塊形成速率(min)K(min)血凝速率(°)Angle(°)最大振幅(mm)MA(mm)綜合凝血指數(shù)CI對(duì)照 Control 6 2.27 ± 0.49 0.85 ± 0.12 79.82 ± 2.65 74.48 ± 2.07 5.58 ± 0.74 0.5 h 8 3.16 ± 1.13 1.28 ± 0.43* 72.18 ± 5.91* 66.93 ± 3.80** 3.50 ± 1.46**1 h 8 3.36 ± 1.06* 1.29 ± 0.44* 71.94 ± 5.89** 65.71 ± 4.69** 3.06 ± 1.68**2 h 7 3.24 ± 1.29 0.99 ± 0.38 75.60 ± 5.20 70.73 ± 5.07 4.11 ± 1.90 6 h 6 2.55 ± 0.34 0.87 ± 0.16 78.50 ± 2.89 69.95 ± 4.65 4.73 ± 0.68

2.3.2 LDH 結(jié)果

由圖7 可知與空白組對(duì)比,兩種注射方式6 h內(nèi)LDH 活力顯著增高(P<0.05)。

圖7 大鼠注射眼鏡蛇毒后不同時(shí)間點(diǎn)LDH 變化Figure 7 Changes of LDH at different time points after injection of Naja atra venom in rats

2.3.3 血漿血紅蛋白含量

由圖8 可知,與空白組相比,肌肉注射組1、6 h 時(shí)血紅蛋白含量顯著增高(P<0. 05),靜脈注射組2 h 內(nèi)血紅蛋白含量顯著增高(P<0. 01)。

圖8 大鼠注射眼鏡蛇毒后不同時(shí)間點(diǎn)血紅蛋白含量變化Figure 8 Changes of hemoglobin content at different time points after injection of Naja atra venom in rats

2.3.4 FIB 測(cè)定結(jié)果

由圖9 知尾靜脈注射組 FIB 含量在1 h 和6 h時(shí)與空白組相比存在顯著性差異(P<0.05),肌肉注射組各時(shí)間點(diǎn)FIB 含量均有一定降低,但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

2.3.5 酶切發(fā)色底物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖10A,10B 可知尾靜脈注射組在2 h 內(nèi)酶切凝血酶底物S2238 活性與空白組相比產(chǎn)生顯著性差異(P< 0.05)。 由圖 10C,10D 可知肌肉注射組 6 h內(nèi)酶切凝血因子Ⅹa 底物S2765 活性與空白組比較具有顯著性差異(P<0.01)。 酶切纖溶酶底物S2251、血漿激肽酶底物S2302 及組織型纖溶酶原激活劑底物S2288 活性與空白組相比無(wú)顯著性差異(數(shù)據(jù)未列出)。

圖10 注射眼鏡蛇毒后大鼠血漿酶切S2238 和S2765 底物動(dòng)力學(xué)曲線及酶活力變化Note. A,C. Changes of the enzyme kinetics curves of cleaving S2238 and S2765. B,D. Changes of enzymatic activities of cleaving S2238 and S2765.Figure 10 Changes of enzyme kinetics curves and enzymatic activities of cleaving S2238 and S2765 after injection of Naja atra venom in plasma of rats

2.3.6 P-selectin 測(cè)定結(jié)果

由圖11 可知,肌肉注射眼鏡蛇毒 0.5 h 時(shí)P-selectin 含量顯著增高(P< 0.01)。 靜脈注射0.5 h時(shí)P-selectin 有上調(diào)但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

圖11 肌肉注射眼鏡蛇毒后大鼠血液中P-selectin 變化Figure 11 Changes of P-selectin in rats blood after injection of Naja atra venom

2.3.7 vWF 測(cè)定結(jié)果

由圖12 可見,尾靜脈注射眼鏡蛇毒后6 h 內(nèi)vWF 含量顯著增高(P< 0.05),1 h 時(shí)變化最為明顯。 肌肉注射組有一定升高但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(數(shù)據(jù)未列出)。

圖12 注射眼鏡蛇毒后大鼠血液中vWF 變化Figure 12 Changes of vWF in rats blood after injecting Naja atra venom

3 討論

臨床上眼鏡蛇傷病人情況復(fù)雜,部分眼鏡蛇傷病例中凝血功能障礙不明顯[10],但少部分急危重癥眼鏡蛇傷病人伴有凝血功能的異常,主要表現(xiàn)為活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)延長(zhǎng)、凝血酶原時(shí)間(PT)延長(zhǎng)、凝血酶時(shí)間(TT)延長(zhǎng)、纖維蛋白原(FIB)下降[11-12],眼鏡蛇傷是否與凝血功能障礙有必然聯(lián)系,尚未能完全確定。 目前眼鏡蛇傷相關(guān)研究多聚焦在其神經(jīng)毒、細(xì)胞毒等毒素方面的影響[13-14]。 關(guān)于眼鏡蛇毒對(duì)凝血功能影響的基礎(chǔ)研究不多,從 1973 年到 2021 年,在 CNKI、維普網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)、PubMed 數(shù)據(jù)庫(kù)上可查詢到文獻(xiàn)較少,且早期研究多采用血漿測(cè)定凝血四項(xiàng),常規(guī)凝血四項(xiàng)主要采用抗凝血漿檢測(cè) APTT、PT、TT、FIB,血漿中不含血細(xì)胞,只檢測(cè)血漿本身凝血功能,故不能完全反應(yīng)凝血變化的病理生理過程。 因此有必要從基礎(chǔ)研究的角度進(jìn)一步認(rèn)識(shí)和闡明眼鏡蛇毒對(duì)凝血功能的影響情況。 針對(duì)凝血四項(xiàng)的不足,血栓彈力圖可用全血監(jiān)測(cè)血液凝固動(dòng)態(tài)全過程,能比較好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)凝血檢測(cè)中無(wú)血細(xì)胞參與的不足,更接近臨床實(shí)際凝血變化。 基于此,本研究利用血栓彈力圖研究和評(píng)價(jià)眼鏡蛇毒對(duì)大鼠凝血功能的影響,以便進(jìn)一步認(rèn)識(shí)眼鏡蛇傷中凝血功能的影響,為臨床救治和新藥研究提供科學(xué)參考。

研究表明眼鏡蛇毒屬于混合型毒素,既有血液毒,又有神經(jīng)毒,其主要功能組分有神經(jīng)毒素、細(xì)胞毒素、金屬蛋白酶、眼鏡蛇毒因子、氧化酶類、水解酶類等成分[15]。 為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)眼鏡蛇毒不同組分對(duì)凝血功能的影響,本研究體外實(shí)驗(yàn)中采用能較好地將眼鏡蛇毒組分分開的SP-Sephadex C-25 凝膠進(jìn)行分離,得到7 個(gè)分離峰,其中FⅠ峰含有磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、眼鏡蛇毒因子、蛇毒金屬蛋白酶[16-17],F(xiàn)Ⅱ中主要含有乙酰膽堿酯酶,F(xiàn)Ⅲ中主要含有磷酸二酯酶[17],F(xiàn)Ⅳ、FⅤ峰中富含半胱氨酸蛋白、蛇毒金屬蛋白酶及神經(jīng)生長(zhǎng)因子[16],F(xiàn)Ⅵ中主要含有神經(jīng)毒素[17],F(xiàn)Ⅶ中主要含有細(xì)胞毒素[17]。 血栓彈力圖實(shí)驗(yàn)及相關(guān)活性結(jié)果表明FⅠ峰孵育后全血R 值顯著延長(zhǎng),血液未凝固,說明血液凝血功能異常,這可能由于FⅠ峰中磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶、蛇毒金屬蛋白酶抑制血小板聚集所引起[18-19],同時(shí)血漿中血紅蛋白含量顯著上升,LDH 活力升高,表明細(xì)胞膜完整性遭到破壞,這可能由眼鏡蛇毒因子激活補(bǔ)體生成攻膜復(fù)合物、磷脂酶A2 酶切卵磷脂產(chǎn)生溶血卵磷脂等引起[20-21]。 FⅣ峰綜合凝血指數(shù)CI 顯著降低,血紅蛋白含量升高,提示該峰中的金屬蛋白酶可通過抑制血小板等表現(xiàn)出抗凝作用,除此之外可能存在細(xì)胞毒素,造成血紅蛋白的升高。 FⅤ、FⅥ峰血栓彈力圖結(jié)果顯示凝血因子減少,纖維蛋白原減少,血小板功能減弱,可能是FⅤ峰中某些金屬蛋白酶切割直接凝血因子,水解纖維蛋白原,抑制血小板聚集所導(dǎo)致[22]。 此外FⅥ、FⅦ峰孵育后血漿血紅蛋白含量升高,說明FⅥ、FⅦ組分含有細(xì)胞毒素可破壞細(xì)胞,溶解紅細(xì)胞造成血紅蛋白含量升高[17]。 酶切發(fā)色底物結(jié)果表明,隨眼鏡蛇毒濃度增大,孵育處理后血漿切割凝血酶底物、纖溶酶底物活性顯著下調(diào),這與血栓彈力圖中表現(xiàn)出凝血因子減少這一變化保持一致。

體內(nèi)血栓彈力圖實(shí)驗(yàn)表明眼鏡蛇毒具有顯著的抗凝作用,0.5 mg/kg 濃度下尾靜脈注射組大鼠及1 mg/kg 濃度下肌肉注射組大鼠均表現(xiàn)出凝血因子、纖維蛋白原減少,血小板功能的減弱,1 h 內(nèi)尾靜脈注射組大鼠抗凝效果略優(yōu)于肌肉注射組。 大鼠注射眼鏡蛇毒后凝血因子的減少可能是凝血系統(tǒng)激活導(dǎo)致凝血因子的消耗。 文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)大鼠注射眼鏡蛇毒后能夠延長(zhǎng)APTT、PT,該結(jié)果也提示凝血因子存在減少或缺乏[6]。 通過測(cè)定纖維蛋白原的含量發(fā)現(xiàn),尾靜脈注射后大鼠血漿各時(shí)間點(diǎn)纖維蛋白原均有一定的下降,這可能是體內(nèi)凝血系統(tǒng)被激活導(dǎo)致纖維蛋白原消耗也可能是纖維蛋白原被酶切水解所致。 同時(shí)體內(nèi)注射眼鏡蛇毒后P-selectin、vWF 含量、血紅蛋白含量及LDH 活力均有不同程度的增加。 P-selectin 是內(nèi)皮細(xì)胞和血小板含有的黏附分子,vWF 是內(nèi)皮細(xì)胞含有的分子,二者均可作為血小板活化和內(nèi)皮細(xì)胞損傷的標(biāo)志物[23-25]。P-selectin、vWF 含量上調(diào)提示眼鏡蛇毒在體內(nèi)引起內(nèi)皮細(xì)胞、血小板激活與消耗,從而在血栓彈力圖中表現(xiàn)為MA 值降低,血小板功能的減弱。 同時(shí)血漿血紅蛋白含量及LDH 活力增高提示細(xì)胞損傷,其原因?yàn)檠坨R蛇毒中細(xì)胞毒素,磷脂酶A2 等造成細(xì)胞膜的破壞,進(jìn)一步造成繼發(fā)性凝血功能紊亂。 酶切發(fā)色底物活性測(cè)定結(jié)果表明兩種注射方式酶切凝血酶、凝血因子Ⅹa 底物活性均有一定上調(diào),提示眼鏡蛇毒注射到大鼠體內(nèi)后激活了凝血系統(tǒng),導(dǎo)致凝血因子被消耗,從而表現(xiàn)出凝血因子的減少。

本研究基于大鼠全血凝血功能評(píng)價(jià),結(jié)合血管內(nèi)皮損傷等指標(biāo),通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)展示了眼鏡蛇毒對(duì)大鼠凝血功能的影響,其作用與激活凝血系統(tǒng)導(dǎo)致凝血因子消耗、纖維蛋白原減少、血小板消耗等有關(guān)。 上述結(jié)果能夠進(jìn)一步認(rèn)識(shí)眼鏡蛇毒對(duì)凝血功能毒性機(jī)理,本研究有助于為臨床蛇傷防治策略及新藥研究提供參考。

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