黃曉莉，孫麗洲

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院產科，江蘇 南京 210029；2淮安市婦幼保健院醫(yī)學遺傳與產前篩查科，江蘇 淮安 223002

性染色體疾病是指由X或Y染色體發(fā)生數目或結構異常導致的疾病，主要包括性染色體非整倍體（sex chromosome aneuploidy，SCA）和拷貝數變異（copy number variation，CNV），可導致胎兒性分化異常及生殖系統(tǒng)發(fā)育不全，不屬于嚴重致死、致殘的疾病，大部分患者表型正常，少數患者表現(xiàn)為發(fā)育落后、身材矮小、輕度智力低下、神經功能障礙和其他臟器功能障礙［1］。人類常見的性染色體疾病主要包括45，X、47，XXX、47，XXY 和47，XYY，產前發(fā)生率1/435左右，活產兒中的發(fā)病率約1/400～1/200，是唐氏綜合征發(fā)病率的2倍［2-4］。由于胎兒性染色體疾病很難通過超聲檢查發(fā)現(xiàn)，常規(guī)孕期生化指標的血清學篩查也不適用于胎兒性染色體疾病的篩查，目前，羊水穿刺等介入性產前診斷方法是診斷胎兒性染色體疾病的有效手段。但是因為介入性產前診斷方法有導致感染、流產等并發(fā)癥的風險，不少孕婦不愿意或者不敢接受羊水穿刺，使得患有性染色體疾病的胎兒很難被及時發(fā)現(xiàn)，導致漏診或延遲診斷，患兒要到青春期之后通過染色體核型分析才能發(fā)現(xiàn)，有的甚至到生育年齡才在不孕不育門診發(fā)現(xiàn)。通過產前篩查發(fā)現(xiàn)性染色體疾病高風險人群并及時進行產前診斷，可實現(xiàn)性染色體疾病早診早治，避免嚴重性染色體畸變的患兒出生，減少出生缺陷；對于表型相對較輕的性染色體疾病患兒如特納綜合征（45，X）等通過早期激素治療、物理治療和個性化教育等，可以對其行為和神經發(fā)育產生積極影響，改善患兒生存質量［5］。無創(chuàng)產前檢測（non-invasive prenatal testing，NIPT）技術是利用母體外周血液中少量的胎兒游離DNA，采用高通量測序的方法并進行生物信息軟件分析處理，獲得胎兒患有染色體畸變的風險概率，具有無創(chuàng)、安全、快速、準確性高等優(yōu)點，作為一種新的產前檢測技術，已廣泛應用于臨床，與血清學篩查、超聲檢查等共同構成產前篩查體系，推動了我國出生缺陷預防工作質量的大幅提升［6］。已有研究顯示在NIPT 應用到胎兒性染色體疾病的篩查之后，大幅提高了胎兒性染色體疾病的產前檢出效率，使性染色體異常胎兒的產前診斷比例上升3倍［7］。能夠通過NIPT 篩查出的性染色體異常主要為45，X、47，XXX、47，XXY和47，XYY［8］。

1 對象和方法

1.1 對象

回顧分析2018年2月—2021年1月在淮安市婦幼保健院接受NIPT 檢測的孕婦共19 327 例作為研究對象，要求均為單胎自然妊娠，孕婦1年內未接受過輸血、移植手術或細胞治療，夫妻雙方均沒有明確已知的染色體數目或結構異常。孕婦年齡18～47歲，平均（28.15±2.02）歲，孕周12～31+5周，平均（18.24±2.17）周。本研究經醫(yī)院倫理委員會批準，所有參與本研究的孕婦均簽署產前診斷知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 NIPT檢測

無菌條件下抽取孕婦外周血10 mL，送遺傳實驗室進行測序，所用儀器為北京博奧生物集團有限公司BioelectronSeq 4000新一代高通量測序儀，磁珠法DNA 提取試劑盒來自廣東博奧木華基因科技有限公司。通過生物信息軟件分析測序結果，獲得樣品染色體所占比例Z值信息，以|Z|=3 為風險截斷值，|Z|＜3為染色體非整倍體低風險，|Z|≥3為染色體非整倍體高風險。為NIPT 結果提示高風險的孕婦安排專業(yè)產前遺傳咨詢，提供侵入性產前診斷作為下一步確診建議。

1.2.2 羊膜腔穿刺、染色體核型分析和CMA檢測

通過超聲確定胎盤胎兒位置，避開胎盤胎兒的位置，消毒鋪巾后進針，抽取40 mL 羊水。其中一份20 mL 羊水樣本按照操作標準步驟進行G 顯帶染色體核型分析，含羊水細胞培養(yǎng)、中期染色體核型制備及核型分析。另一份20 mL 羊水樣本按照試劑盒的操作說明進行基因組DNA 提取，質檢合格后再用Affymetrix 的CytoScan 750K 芯片胎兒染色體單核苷酸微陣列技術進行羊水染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）。

1.2.3 隨訪

對所有接受NIPT 檢測的孕婦進行電話隨訪。隨訪內容包括孕期后續(xù)檢查情況、妊娠結局和新生兒出生情況（含外貌、結構、生殖系統(tǒng)、神經系統(tǒng)和運動情況等）。

1.3 統(tǒng)計學方法

應用SPSS24.0統(tǒng)計軟件對所有數據進行分析，計數資料以例數和百分率表示，組間比較使用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NIPT檢出性染色體異常情況

19 327 例孕婦中，共檢出性染色體異常高風險孕婦92 例，總檢出率0.48%。按照NIPT 檢測結果將所有孕婦分為45，X（含嵌合體）、47，XXX、47，XXY、47，XYY 和性染色體微缺失微重復共5 組進行分析。其中45，X（含嵌合體）組共檢出50 例，檢出率0.26%；47，XXX 組共檢出11 例，檢出率0.06%；47，XXY 共檢出10 例，檢出率0.05%；47，XYY 組共檢出8 例，檢出率0.04%；性染色體微缺失微重復組共檢出13 例，檢出率0.07%（表1）。

表1 NIPT性染色體異常檢出情況及產前診斷結果

2.2 羊膜腔穿刺產前診斷結果

NIPT 提示性染色體異常高風險的92 例孕婦中，接受羊膜腔穿刺進一步產前診斷的孕婦共81 例，穿刺率為88.04%；與產前診斷結果相符并確診性染色體異常病例共38 例，陽性預測值（positive predictive value，PPV）為46.91%，陰性預測值為100.00%，假陽性率為0.22%，靈敏度為100.00%，特異度為99.78%。其中45，X（含嵌合體）13 例、47，XXX 5 例、47，XXY 8 例、47，XYY 6 例、性染色體微缺失微重復6 例。NIPT 檢測技術對于45，X（含嵌合體）、47，XXX、47，XXY、47，XYY、性染色體微缺失微重復不同分組孕婦的性染色體異常的PPV 分別為30.95%、50.00%、80.00%、75.00%、54.55%，按照PPV值從高到低排列依次是47，XXY組＞47，XYY組＞性染色體微缺失微重復組＞47，XXX 組＞45，X（含嵌合體）組。染色體核型分析和CMA 檢測確診性染色體異常的比例分別為38.27%和44.44%，兩種檢測方法在檢出率方面差異最大的為性染色體微缺失微重復組，核型分析為18.18%，CMA 為54.55%；其次是在45，X（含嵌合體）組，核型分析為23.68%，CMA 為28.95%；在47，XXX、47，XXY、47，XYY 3 組中，兩種產前診斷方法的檢出率差異無統(tǒng)計學意義。

1 例NIPT 提示為45，X 與46，XY 嵌合的病例，染色體核型分析提示為45，X［22］/46，XY［78］，CMA未提示異常，孕婦拒絕其他檢測方法進一步確認（圖1）。1例NIPT提示為45，X的病例，染色體核型分析和CMA 均未提示異常，羊水熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization，F(xiàn)ISH）檢測的結果為nucish（DXZ1）×3［10］/（DXZ1）×2［90］，即47，XXX 與46，XX 的嵌合體（圖2）。1 例NIPT 提示為47，XYY的病例，核型分析結果為46，XY，CMA結果提示X染色體存在739.7 kb重復。1例NIPT提示為X 染色體存在57 Mb 重復的病例，核型分析結果為46，XY，CMA 結果提示3 號染色體存在3.7 Mb 重復。另有4 例NIPT 提示為45，X 的病例，核型分析未見異常，CMA提示分別為1、8、9、10號常染色體的微缺失微重復（表2）。

表2 NIPT和產前診斷結果均提示異常但不一致的病例情況

圖1 病例1胎兒的羊水染色體核型45，X［22］/46，XY［78］

圖2 病例2胎兒的羊水熒光原位雜交結果nucish（DXZ1）×3［10］/（DXZ1）×2［90］

NIPT 對于性染色體非整倍體（含嵌合體）和微缺失微重復的PPV分別為44.29%和54.55%，兩組間的檢出率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；NIPT 對于染色體數目增多和染色體數目減少（含嵌合體）的PPV分別為67.86%和30.95%，兩組間的檢出率差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，表3）。

表3 不同分類的性染色體異常檢出率比較

2.3 隨訪結果

NIPT 提示性染色體高風險并接受羊膜腔穿刺

（n）的81例孕婦全部完成電話隨訪，隨訪率100%，接受隨訪時新生兒為5～13 個月齡，NIPT 提示性染色體高風險但拒絕接受羊膜腔穿刺的孕婦以及NIPT 提示性染色體低風險的孕婦，隨訪效果不滿意，部分孕婦因NIPT 結果異常直接引產。確診為性染色體異常的孕婦均選擇了終止妊娠。另有NIPT 提示為性染色體異常但檢測結果為其他染色體異常的5例孕婦，也選擇了終止妊娠。隨訪過程中未發(fā)現(xiàn)性染色體檢測假陰性相關病例。

3 討論

NIPT 技術應用到胎兒性染色體疾病的篩查之前，患有性染色體疾病的胎兒通常因為血清學篩查高風險或超聲檢查異常行產前診斷時被“意外”發(fā)現(xiàn)，部分表型正常的性染色體疾病患兒可能到青春期因為出現(xiàn)第二性征發(fā)育不良、原發(fā)性閉經、身材矮小等相關癥狀，但是這個時候可能已經錯過性激素、生長激素等治療的最佳時機。

3.1 NIPT應用于性染色體疾病篩查的PPV

PPV指的是經過篩查提示為陽性的人群中真實患病人數的比例［9］，反映的是某項篩查方法的診斷效力，PPV的數值越高，表明此項篩查方法的準確度越高。以往對于NIPT 用于胎兒性染色體非整倍體篩查的報道較多，對于胎兒性染色體微缺失微重復篩查的報道相對較少，且不同類型研究所報道的胎兒SCA 的發(fā)生率有差異，PPV 波動范圍較大［10-15］。鄭蕓蕓等［10］發(fā)現(xiàn)NIPT 在45，X、47，XXY、47，XXX及47，XYY的PPV分別為44.44%、100.00%、58.33%及50.00%，其總體PPV 為54.55%。Zhang 等［11］發(fā)現(xiàn)可以通過大規(guī)模平行基因組測序的方法利用NIPT分析胎兒游離DNA（cffDNA）進行胎兒性染色體非整倍體產前篩查，篩查總陽性率為0.55%（57/10 275），總的PPV 為54.54%，其中45，X 的PPV 為29.41%；47，XXX 和47，XYY 的PPV 均為100%；47，XXY 的PPV 為77.8%。Petersen 等［12］經過對712 例樣本的研究發(fā)現(xiàn)，NIPT 對于47，XXY、47，XXX 及45，X的PPV分別為87%、50%及26%。陸欣然［13］認為NIPT 對于4 種胎兒SCA 篩查的PPV 分別為45，X（12.50%）、47，XXX（51.72%）、47，XXY（66.67%）和47，XYY（83.33%）。Liang 等［14］報道NIPT 對胎兒SCA的總體PPV為55.34%，其中45，X、47，XYY、47，XXY 和47，XXX 的PPV 分別為26.09%、68.75%、85.00%和85.00%。馬燕瓊［15］研究NIPT在我國寧夏地區(qū)臨床篩查胎兒SCA的情況，結果表明NIPT對于篩查胎兒SCA 的檢出率為0.42%；PPV 為56.2%；對于45，X、47，XXX、47，XXY 及47，XYY 的PPV 分別為36.8%、80.0%、83.3%及100.0%。本研究中，經NIPT 提示性染色體異常高風險的孕婦共92 例，檢出率為0.48%，高于馬燕瓊［15］的研究結果（0.42%），低于Zhang 等［11］的研究結果（0.55%）。本研究的總體PPV 為46.91%，低于以上研究結果。對于45，X（含嵌合體）的PPV 為30.95%，與Zhang 等［11］的結果一致；47，XXX的PPV為50.00%，與鄭蕓蕓［10］、Petersen［12］和陸欣然［13］等的結果一致；47，XXY 的PPV為80.00%，與Zhang［11］和馬燕瓊［15］的結果一致；47，XYY 的PPV 為75.00%，與Zhang 等［11］的研究結果一致；性染色體微缺失微重復的PPV 為54.55%，需要更多的研究進行對照討論。不同研究結果之間的差異，可能與實驗所用實驗設備、分析平臺不同以及Z值、濃度值設定不同有關，而且各種研究樣本量的多少和分組方式的細節(jié)差異也會對實驗結果產生一定程度的影響。

3.2 NIPT對于不同性染色體疾病的PPV比較

馬燕瓊［15］研究發(fā)現(xiàn)NIPT 技術對性染色體數目偏少疾病的PPV 為36.8%，對性染色體數目偏多疾病的PPV 為84.6%。Zhang 等［11］的研究顯示，NIPT對性染色體數目偏少疾病的PPV為29.41%，對性染色體數目偏多疾病的PPV 較高。Cheung 等［16］通過對307例孕婦進行研究后認為該技術對性染色體數目偏少疾病即45，X的PPV為38%，對47，XYY、47，XXY 和47，XXX 的PPV 為83%。陸欣然［13］研究發(fā)現(xiàn)NIPT 對性染色體單體的PPV 為12.50%，對性染色體三體的PPV 為63.75%（51/80），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。本研究中NIPT對于染色體數目增多和染色體數目減少（含嵌合體）的PPV 分別為67.86%和30.95%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），與以上研究結果一致。分析NIPT 對于SCA 數目增多較減少的PPV高，可能與以下幾個因素有關［10，15，17］：①X和Y染色體上存在58個同源基因，其中29個位于性染色體的末端，而目前NIPT 只能測到36 個位點，存在X 和Y 染色體末端排序定位錯誤的可能；②胎盤組織中存在X 染色體非隨機失活的現(xiàn)象，而且來自父親的X 染色體在胎盤組織中失活傾向更高；③X 染色體上的GC 堿基含量低，導致X 染色體的擴增可變性增加；④女性白細胞中與年齡相關的X 染色體丟失，隨著年齡的增加，女性染色體核型由XX 轉變?yōu)閄0/XX 嵌合，降低了NIPT 篩查胎兒45，X的準確性。

3.3 NIPT 對于性染色體微缺失微重復及嵌合體的篩查價值

2016年美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學院提出［18］，NIPT 可用于篩查胎兒SCA 和染色體微缺失微重復綜合征。也有相關研究支持NIPT 技術除了適用于染色體數目異常，還可以用于染色體微缺失及微重復的檢測［19-20］。Dugoff 等［21］也認為，無創(chuàng)產前檢測可作為一種額外的輔助篩查方式對染色體微缺失微重復綜合征進行篩查。李雅紅等［22］在5例性染色體異常核型的研究中發(fā)現(xiàn)1例46，XX，del（Xq23-25）的性染色體微缺失患者，也能證明NIPT對于性染色體微缺失的檢出有一定臨床價值。本研究中，NIPT對于性染色體微缺失微重復的PPV為54.55%，高于SCA（含嵌合體）的PPV（44.29%），但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），也反映出NIPT 對于性染色體微缺失微重復篩查的應用價值。

另外，NIPT對性染色體嵌合體異常也有篩查價值。NIPT 測序結束后會再對樣本的游離DNA 片段進行逐一比對并拼補到染色體上相應的區(qū)域，實現(xiàn)對胎兒染色體數目和完整性的評估［11］。本研究中NIPT 提示嵌合體的病例分別經羊水染色體核型分析和FISH 檢測確診，證實了NIPT 對于嵌合體的篩查價值。

3.4 不同產前診斷方法對于NIPT檢測結果的診斷價值

傳統(tǒng)的G顯帶染色體核型分析可檢出染色體非整倍體和大片段的染色體結構異常，在產前遺傳學檢查領域一直是首選的基礎方法，但是核型分析分辨率低，只能檢出染色體數量和大片段的結構異常。而染色體核型正常的病例中仍存在拷貝數變異的可能性，僅進行常規(guī)核型分析存在漏診一些致病性CNV 的風險。CMA 技術為新型的分子遺傳學檢測技術，能夠在全基因水平上進行掃描，分辨率高，通過CMA檢測可以發(fā)現(xiàn)≥100 kb且缺失、重復和≥10 Mb的基因組純合區(qū)域（regions of homozygosity，ROH），還可檢出染色體不平衡的拷貝數變異或易感性位點變異，被推薦作為某些癥狀明確患者的一級診斷工具，對于傳統(tǒng)的核型分析來說是有效的補充。常規(guī)核型分析檢查未發(fā)現(xiàn)異常時，CMA 可額外再檢出有臨床意義的基因組變異，具有重要的產前診斷價值，有利于新生兒預后評估。近年來，有許多NIPT 檢測染色體微缺失微重復綜合征（microdeletion and microduplication syndrome，MMS）的報道［23-24］，且在某些MMS的染色體拷貝數變異的檢測結果方面表現(xiàn)良好。但是當NIPT 檢測發(fā)現(xiàn)一些臨床意義不明確的染色體MMS時，結果判讀和臨床處理有可能會面臨較大的風險，所以國際產前診斷協(xié)會建議無創(chuàng)產前檢測應局限于臨床意義重大的疾病或明確定義的嚴重疾?。?5］。本研究中，經染色體核型分析和CMA 檢測確診性染色體異常的比例分別為38.27%和44.44%，兩種檢測方法在檢出率方面差別最大的是性染色體微缺失微重復組，核型分析為18.18%，CMA 為54.55%；在47，XXX、47，XXY、47，XYY 3 組中，兩種產前診斷方法的檢出率沒有差別；其次是在45，X（含嵌合體）組，核型分析為23.81%，而CMA為26.19%。

然而，CMA在檢測平衡重組的易位、倒位，單基因疾病、多基因疾病及染色體嵌合體方面，存在一定的局限性［26-27］。而且并不是所有的微缺失或者微重復變異都與疾病相關，有些CNV 是非致病性的，當然也有部分CNV 的臨床意義是無法得知的［26］。對于臨床意義不明的CNV胎兒，給予醫(yī)學建議具有挑戰(zhàn)性和風險，可能還需要增加更為精密精準的額外檢測［27］，孕期需要對病例進行更加密切的檢測和隨訪。本研究中就發(fā)生了2 例CMA 在檢測嵌合體時出現(xiàn)假陰性病例，1例NIPT提示為45，X與46，XY嵌合的病例，經染色體核型分析確診，而CMA 未提示異常；另1 例NIPT 提示為45，X 的病例，經羊水FISH檢測確診為47，XXX 與46，XX的嵌合體，而染色體核型分析和CMA均未提示異常。

3.5 妊娠結局情況

美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學院在2016 年聲明，NIPT陽性結果不應該作為孕婦及家屬放棄妊娠的標準，需要經過侵入性產前診斷進行證實［18］。在臨床工作中，承擔遺傳咨詢工作的醫(yī)師應該盡可能客觀詳實地向孕婦及家屬解釋NIPT 對于篩查胎兒性染色體疾病的準確性和局限性，切不可盲目夸大NIPT的診斷價值，并且要為孕婦及家屬提供胎兒性染色體異常預后相關的醫(yī)學建議。NIPT 檢測性染色體疾病發(fā)生假陽性和假陰性的原因主要有：①限制性胎盤嵌合，胎兒游離DNA主要來自滋養(yǎng)細胞的胎盤凋亡細胞，發(fā)生胎兒和胎盤的DNA不一致的概率約為1%～2%，而且性染色體異常的胎兒相對更容易因自救機制出現(xiàn)胎盤嵌合情況［23］；②母體染色體異常干擾，母體循環(huán)中細胞cffDNA 含量少，當孕婦本人存在染色體異常、性染色體嵌合或者孕婦癌癥等都會導致受檢血漿非整倍體cffDNA含量改變，干擾分析結果；③NIPT 技術本身的局限性，X 染色體含有較多的GC 堿基，X和Y染色體高度同源且不易分辨，Y染色體存在與其他染色體有較多片段的相似；④胎兒染色體嵌合等都有可能導致測序偏移，發(fā)生假陽性或者假陰性［28］。熊詩詣等［29］對14例假陽性病例進行孕婦染色體核型分析和CMA 檢測后，證實其中2 例孕婦自身就是低比例的性染色體嵌合（45，X/46，XX）；另在確診為性染色體非整倍體的病例中發(fā)現(xiàn)1例遺傳自孕婦的胎兒性染色體微重復。SCA不屬于嚴重的致死、致殘性疾病，孕婦對于妊娠的選擇主要決定于疾病類型，另外還會受醫(yī)生遺傳咨詢方式、家庭經濟水平、文化背景、受教育程度、孕婦對疾病的認識等多種因素的影響［29］。一項Meta 分析認為影響人群決定性染色體異常胎兒妊娠結局的因素有性染色體異常的類型、孕周、孕婦及家屬年齡、提供咨詢的醫(yī)務人員類型、已育子女的數量及生育需求度［30］。本研究中經羊膜腔穿刺確診為性染色體異常的孕婦均選擇了終止妊娠，與本地區(qū)相對不發(fā)達的經濟文化水平以及孕婦對于染色體疾病的認識不足有關；未發(fā)現(xiàn)假陰性病例與低風險孕婦電話隨訪效果不滿意，部分孕婦后續(xù)產檢轉到其他醫(yī)院，出現(xiàn)假陰性不能及時獲得信息有關。

綜上所述，NIPT可用于胎兒性染色體疾病的產前篩查，尤其是對于性染色體非整倍體、微缺失微重復的篩查，具有較高的準確度。通過NIPT初步篩查之后可以在減少非必要侵入性產前診斷操作的同時，及早有效識別性染色體疾病胎兒，有利于對性染色體疾病胎兒的生長發(fā)育進行嚴密觀察，為父母提供足夠的時間以做好接受性染色體疾病胎兒的心理準備及經濟準備，也為早期醫(yī)學干預和產后管理提供了機會，能大大改善性染色體疾病患者的生活質量。同時也要看到NIPT 檢測會增加臨床咨詢的復雜性及終止妊娠率，當通過產前篩查或診斷發(fā)現(xiàn)性染色體異常胎兒時，使孕婦對于妊娠的選擇處于兩難境地，更對臨床醫(yī)生遺傳咨詢的水平提出了更高的要求。目前在NIPT 對于性染色體疾病的篩查效力以及NIPT 能否對性染色體異常進行常規(guī)報告方面，還存在爭議。孕婦接受NIPT 檢測前，臨床醫(yī)生應充分告知該項技術的優(yōu)勢及局限性，當NIPT檢測提示胎兒性染色體高風險時，需要與孕婦做好溝通，安排進一步的侵入性操作，直接獲取胎兒樣本進行產前診斷；當NIPT檢測未提示性染色體異常時，孕期及產后隨訪也非常重要，切不可盲目沖動地進行妊娠結局選擇。

本研究通過對大樣本NIPT 檢測人群的研究，獲得了較為可靠的胎兒性染色體疾病篩查數據，為臨床遺傳咨詢及處理提供了重要的參考，為衛(wèi)生部門制定產前篩查政策提供了醫(yī)學依據。本研究的局限性在于，因為孕婦及家屬配合度的原因，沒有完成對所有接受NIPT 的病例尤其是低風險病例出生后的隨訪，也沒有能夠實現(xiàn)對所有NIPT篩查假陽性病例的胎盤檢測，由于性染色體疾病表型的特殊性，還需要進一步增加研究樣本量和隨訪時間。