邵彥明， 朱 瑩， 鄭 蕊， 王 鵬， 王海花， 費(fèi)貴強(qiáng)

(陜西科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院 陜西省輕化工助劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 西安 710021)

0 引言

多巴胺(DA)[1]是兒茶酚胺和苯乙胺家族的一種有機(jī)化學(xué)物質(zhì)，是動物大腦中重要的神經(jīng)遞質(zhì)之一，其主要負(fù)責(zé)動物體感覺、開心和興奮的信息傳遞.而在人體體液中，DA濃度失調(diào)會導(dǎo)致一系列疾病[2]，如：帕金森病、精神分裂癥等.因此，控制多巴胺的水平，對于生命體的健康極其重要.目前，檢測多巴胺的方法主要有高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]和毛細(xì)管電泳法[4]以及其他光譜、熒光等方法，但這些方法均存在用時較長、檢測過程復(fù)雜等缺陷.而電化學(xué)檢測[5]相對于上述傳統(tǒng)的檢測方法，具有快速便捷、靈敏度高的優(yōu)勢，在檢測多巴胺相關(guān)疾病方面展現(xiàn)出很大的潛力.

分子印跡技術(shù)(MIT)[6,7]是一種模擬抗原-抗體特異性結(jié)合過程的手段，模板分子與功能單體通過共價或非共價作用結(jié)合形成模板分子-單體復(fù)合物，最終通過交聯(lián)劑進(jìn)一步穩(wěn)定形成分子印跡聚合物(MIP)，脫除模板分子之后在聚合物基體中形成與模板分子形狀及作用力高度匹配的印跡空腔，印跡空腔的存在也賦予了MIP對模板分子高度的高親和力和良好的選擇性.將MIP的特異性識別作用與電化學(xué)檢測方便快捷的優(yōu)勢結(jié)合起來構(gòu)筑電化學(xué)傳感器，在環(huán)境污染物檢測、食品質(zhì)量監(jiān)測、藥物分析以及生命分析等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[8].將MIP修飾到電極上構(gòu)筑電化學(xué)傳感器[9,10]主要有兩種方式，其一是通過滴涂法將MIP修飾到電極表面，該方法存在聚合物層易脫落、檢測結(jié)果重現(xiàn)性不好等缺點(diǎn)；另外一種是通過電聚合的手段直接在電極表面制備分子印跡聚合物膜，這種方法具有可控性好、印跡位點(diǎn)分布均勻并且模板分子易于洗脫等優(yōu)勢.

然而，MIP層的導(dǎo)電性一般較差，致使傳感器在實(shí)際檢測中表現(xiàn)出較低的檢測靈敏度，而通過導(dǎo)電性能良好的納米材料對電極表面進(jìn)行修飾可以很好的解決由于聚合物導(dǎo)電性差而導(dǎo)致的傳感器靈敏度低的問題.近年來，許多納米材料[11](如，金屬納米粒子、碳納米管、石墨烯及其衍生物等)由于其良好的導(dǎo)電性、高的比表面積等性質(zhì)而被廣泛用作電極表面修飾材料來構(gòu)筑性能優(yōu)異的電化學(xué)傳感器.其中，還原氧化石墨烯[12,13]因其獨(dú)特的片層結(jié)構(gòu)、高的比表面積、良好導(dǎo)電性等優(yōu)勢，將其用作電極修飾材料可有效增加電子傳遞能力，從而提高電化學(xué)傳感器靈敏度，已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用.

本文中，利用良好導(dǎo)電性且高比表面積的還原氧化石墨烯修飾玻碳電極，隨后以吡咯為單體通過電聚合在其表面制備MIP層，構(gòu)筑了特異性檢測多巴胺的高靈敏度電化學(xué)傳感器.重點(diǎn)研究了傳感器的檢測性能、選擇性和穩(wěn)定性.結(jié)果表明，所構(gòu)筑的印跡電化學(xué)傳感器具有較寬的檢測范圍和較低的檢測限.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑

石墨粉和NaNO3購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DA和吡咯均購自安耐吉；0.1 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS)由Na2HPO4和NaH2PO4配制.溶液均采用去離子水配制，吡咯通過減壓蒸餾純化后后使用.

1.1.2 主要儀器

通過X射線粉末衍射儀(XRD,Bruker D8 Advance)表征材料的結(jié)構(gòu)；透射電子顯微鏡(TEM,FEI Tecnai G2 F20 S-TWIN)用來測試樣品的形貌.pH計(上海雷磁，pHSJ-3F).電化學(xué)工作站(上海辰華，CHI600E)，采用三電極體系，玻碳電極(GCE)為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極.

1.2 材料制備

1.2.1 還原氧化石墨烯制備

將2 g NaNO3和96 mL濃H2SO4超聲分散均勻，加入2 g磷片石墨，在0 ℃下攪拌30 min，然后將12 g KMnO4分3次緩慢加入到上述溶液中，繼續(xù)攪拌1.5 h，接著在35 ℃下反應(yīng)2 h，再加入80 mL蒸餾水，待反應(yīng)體系溫度到達(dá)90 ℃后繼續(xù)反應(yīng)1 h，分別將20 mL 30%的H2O2與20 mL濃鹽酸稀釋到200 mL和92 mL蒸餾水中，并將稀釋后的雙氧水和鹽酸溶液均加入到上述反應(yīng)體系中，離心洗滌數(shù)次，待上清液為中性時，將固體放入培養(yǎng)皿中冷凍干燥得到GO.

將制備的氧化石墨烯置于管式爐中，N2氛圍下，300 ℃保溫30 min，即得rGO.

1.2.2 rGO@GCE制備

玻碳電極分別用0.05μm和0.1μm的Al2O3懸浮液拋光打磨，隨后用水和乙醇進(jìn)行超聲清洗5 min以去除殘留的Al2O3粉末，得到光滑锃亮的鏡面以待使用.

將4 mg上述制備的rGO分散到1 mL乙醇，經(jīng)超聲分散均勻后，滴涂10μL的rGO分散液至電極表面，并放置室溫自然晾干得到rGO修飾的玻碳電極rGO@GCE.

1.2.3 MIP@rGO@GCE制備

將rGO@GCE浸入到含有的10 mM吡咯和2 mM DA的PBS(0.1 M，pH=6.5)緩沖液中，通過循環(huán)伏安法(CV)在-0.2～1.2 V的電位區(qū)間，以0.1 V/S的掃描速率掃描10圈.將得到的電極放置到洗脫液中洗脫DA，得到MIP@rGO@GCE.

NIP@rGO@GCE的制備過程與MIP@rGO@GCE一致，只是在反應(yīng)體系中不加DA.

1.3 電化學(xué)方法

采用電化學(xué)阻抗法(EIS)測量電極的阻抗，EIS是在5 mM的[Fe(CN)6]3-/4-緩沖液中測量，振幅為5 mV.

循環(huán)伏安法(CV)曲線在5 mM的[Fe(CN)6]3-/4-緩沖液中進(jìn)行測量，掃描范圍是-0.3～0.8 V，掃描速率為0.5 V/S.

配制一系列不同濃度的DA溶液，以修飾過后的MIP@rGO@GCE為工作電極，鉑絲電極為對電極，飽和甘汞電極為參比電極，置于含有不同DA濃度的0.1 M的PBS緩沖液中，通過差分脈沖伏安法(DPV)進(jìn)行檢測，從而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，DPV掃描范圍為-0.6～0.6 V，脈沖寬度為 50 ms，脈沖幅度為 50 mV.

1.4 電化學(xué)傳感器的制備

圖1為MIP@rGO@GCE的制備流程圖.首先將合成的rGO滴涂到玻碳電極表面，得到rGO@GCE，接著將rGO@GCE浸入含有單體和模板分子的PBS緩沖溶液中，通過電聚合法在電極表面制備印跡聚合物膜，最后用洗脫液洗滌去除DA后，得到MIP@rGO@GCE.

圖1 MIP@rGO@GCE的制備流程圖

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)構(gòu)表征

通過XRD對GO和rGO的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，其結(jié)果如圖2所示.在2θ=11.0 °的特征衍射峰表明GO被成功制備[14].GO是熱不穩(wěn)定的，其表面富含大量的含氧基團(tuán)，經(jīng)過高溫?zé)徇€原后，其表面含氧基團(tuán)化學(xué)鍵被破環(huán)，使大量的小分子(H2O)和CO2逸出[15].2θ=11.0 °處GO的特征衍射峰消失，出現(xiàn)了rGO(002)的較寬的特征衍射峰，這是由于rGO大多以單層或是少層的形式存在[16].從圖2中插圖可以看出，GO經(jīng)過還原后顏色由棕黃色變?yōu)楹谏?，這些都表明了rGO被成功制備.

圖2 GO和rGO的XRD圖 (插圖為GO和rGO的數(shù)碼照片)

2.2 rGO形貌和導(dǎo)電性能表征

通過TEM表征rGO的微觀形貌，其結(jié)果如圖3所示.結(jié)果表明,所制備的rGO為超薄片層且含有大量的褶皺.使用rGO修飾電極可以顯著提高電極表面積，促進(jìn)電子傳遞.

圖3 rGO的TEM照片

用萬用表測試了氧化石墨烯還原前后電導(dǎo)率的變化情況.GO在還原前，由于其表面存在大量的含氧官能團(tuán)，這導(dǎo)致GO導(dǎo)電性較差，其電阻大于5 MΩ；經(jīng)過高溫?zé)徇€原后的rGO，其電阻大大降低，在1.2～1.5 KΩ之間.同時，由圖4可知，裸電極的電阻為490 Ω，修飾rGO后，rGO@GCE的能奎斯特環(huán)大大減小，電阻為95 Ω.這表明合成的rGO具有良好的導(dǎo)電性能[17].

圖4 GCE和rGO@GCE的EIS圖

2.3 電化學(xué)性能表征

2.3.1 MIP@rGO@GCE的電化學(xué)性能

圖5(a)為MIP制備過程的的CV曲線，從圖中可以看出，在0.2 V存在一個很明顯不可逆的氧化峰[18]，隨著掃描圈數(shù)增加，DA的氧化峰電流信號也隨之減小，并逐漸趨于穩(wěn)定狀態(tài)，這是因?yàn)殡娋酆虾?，DA分子會隨著聚吡咯分子一同接近電極表面，形成了一層致密的分子印跡薄膜.

圖5(b)為NIP制備過程的CV曲線圖.圖中并沒有出現(xiàn)DA的氧化峰電流，相同的是，隨著掃描圈數(shù)增加，吡咯電流信號減小并趨于平緩，這是由于聚吡咯薄膜的電化學(xué)性質(zhì)強(qiáng)烈依賴于其氧化還原狀態(tài)，通過CV電聚合吡咯時，終止電位對其導(dǎo)電性有很大影響，吡咯在高電位0.80 V產(chǎn)生過氧化后，會使聚吡咯膜的導(dǎo)電性能下降[19].

圖6為不同修飾電極在0.1 M[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的CV曲線.從圖6可以看出，裸電極的電流響應(yīng)值為73.5μA，當(dāng)在電極表面修飾rGO后，在相同的測試條件下，響應(yīng)電流值增加到164μA，這是由于rGO優(yōu)異的導(dǎo)電性和較大的比表面積，促進(jìn)了電子的快速傳遞所導(dǎo)致的.當(dāng)在修飾電極表面電聚合MIP層后，電流響應(yīng)值發(fā)生下降，降低到77μA，這可歸因于電極表面形成的MIP導(dǎo)電性較差阻礙了電子傳遞.隨后通過洗脫液洗滌去除DA后，電流值增大到137.2μA，這是因?yàn)槿コ０搴?，電極表面會形成印跡空穴，從而促進(jìn)更多鐵氰化鉀分子接近電極表面.NIP@rGO@GCE的響應(yīng)電流值為49μA，在所有的響應(yīng)電流值中最低，這是因?yàn)槠浔砻娲嬖谝粚訉?dǎo)電性較差的印跡膜，沒有任何的印跡空穴存在，且探針分子沒有能接近電極表面的可接近通道[20].

圖5 電聚合CV曲線

圖6 GCE、rGO@GCE、MIP@rGO@GCE、去除 模板分子后MIP@rGO@GCE和NIP@rGO@ GCE在0.1 M[Fe(CN)6]3-/4-中的CV曲線

2.3.2 pH優(yōu)化

利用DPV考察了溶液pH值對于峰電流的影響，其結(jié)果如圖7所示.圖7(a)為DA量一定時不同pH值下的DPV曲線，從結(jié)果可以看出，隨著溶液pH的增大，DA的響應(yīng)電流值呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢.從圖7(b)所示的pH與峰電流關(guān)系曲線可以明顯看出，峰電流在pH=7時達(dá)到最大值，這可能是由于在堿性溶液中多巴胺不能被質(zhì)子化，過度的酸性或堿性溶液可能會使分子印跡聚合物片段化而導(dǎo)致的[21].因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取pH=7的PBS作為檢測底液.圖7a插圖為峰電位值和pH值的線性關(guān)系，隨著pH增加，峰電位值負(fù)移，其線性回歸方程為：Ep(V)=-0.060 6pH+0.607 6(R2=0.98)，這表明質(zhì)子參與了DA的氧化還原反應(yīng)[22].其氧化還原機(jī)理如圖8所示.

圖7 不同pH對DA的DPV響應(yīng)曲線和 響應(yīng)關(guān)系圖

圖8 DA的氧化還原機(jī)理圖

2.4 多巴胺的電化學(xué)檢測

利用DPV法研究了所制的傳感器檢測多巴胺的性能，在含有不同濃度DA(30～110μM)的PBS緩沖液中，以MIP@rGO@GCE為工作電極，得到如圖9所示的DPV曲線圖.結(jié)果表明，隨著DA濃度逐漸增加，其響應(yīng)峰電流值也隨之增加，說明所制得的傳感器可以用來定量檢測多巴胺.如圖10，DA的峰電流與DA濃度值在30～110μM范圍之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：

I(μA)=0.370 54CDA(μM)+112.87，R2=0.992，檢測限為1.56μM，((S/N)=3)[23].

很顯然，MIP@rGO@GCE對于檢測DA表現(xiàn)出較好的電化學(xué)性能.表1總結(jié)了關(guān)于電化學(xué)傳感器檢測多巴胺的報道.結(jié)果表明，以rGO修飾電極，并通過吡咯單體電聚合手段制備的電化學(xué)傳感器在多巴胺檢測中表現(xiàn)出較好的檢測性能.

圖9 不同DA濃度下的DPV曲線和線性關(guān)系圖

表1 不同DA檢測方法比較

2.5 傳感器的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性

用DPV考察了該傳感器的選擇性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性.圖10為傳感器的選擇性圖，用50μM DA和含有其濃度5倍的干擾物質(zhì)(250μM尿素、250μM抗壞血酸)的DA溶液，其電流響應(yīng)值結(jié)果沒有較大的變化，可以得知干擾物的存在不會對檢測DA產(chǎn)生影響，該傳感器具有較好的選擇性.而NIP@rGO@GCE用于檢測時，其電流響應(yīng)很低，這是由于其表面沒有印跡孔穴的存在.

圖10 MIP@rGO@GCE的選擇性

圖11為用相同手法制得的MIP@rGO@GCE用于檢測50μM DA的響應(yīng)電流圖.由圖11可以看到，三次不同電極的差距不大，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2%.將MIP@rGO@GCE在冰箱儲存7天，用于50μM Da溶液中進(jìn)行檢測，峰電流保留到原來的94.6%，該傳感器具有較好的重現(xiàn)性.

圖11 MIP@rGO@GCE的重現(xiàn)性

3 結(jié)論

本文通過熱還原制備的具有良好導(dǎo)電性及高比表面積的rGO修飾玻碳電極，隨后在修飾電極上以吡咯為單體通過電聚合法制備MIP層來構(gòu)筑電化學(xué)傳感器，用以檢測DA.結(jié)果表明：該傳感器在7天內(nèi)表現(xiàn)出好的穩(wěn)定性，并且具有較寬的檢測范圍和較低的靈敏度，在干擾物質(zhì)的存在下依舊保持較高的選擇性，在檢測DA方面具有較好的應(yīng)用前景.