朱佳琪，陳芳清，黃永文，熊丹偉，劉楊赟

（1.三峽大學(xué)湖北省三峽地區(qū)生態(tài)保護與治理國際聯(lián)合研究中心，湖北 宜昌 443002；

2.湖北正江環(huán)保科技有限公司，湖北 宜昌 443002）

秸稈厭氧發(fā)酵技術(shù)既能生產(chǎn)清潔生物能源，又能減少碳排放，是實現(xiàn)農(nóng)作物秸稈資源化利用的有效途徑之一［1］。秸稈厭氧發(fā)酵可分為秸稈單一底物厭氧發(fā)酵和秸稈與有機廢棄物混合厭氧發(fā)酵。由于發(fā)酵基質(zhì)碳含量高、氮含量相對低而出現(xiàn)的碳氮比失衡情況，秸稈單一底物厭氧發(fā)酵存在發(fā)酵進程緩慢、發(fā)酵效率低下等問題［2］。秸稈與其他有機廢棄物混合厭氧發(fā)酵能克服這一缺陷，平衡發(fā)酵基質(zhì)營養(yǎng)，促進微生物群落的生長與發(fā)育，達到加快厭氧發(fā)酵的進程、提高產(chǎn)氣效率的目的［3，4］。秸稈厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷通常利用沼氣池和發(fā)酵罐進行，這類方式存在運輸量大、殘渣處理困難的問題［5］。日本名城大學(xué)田村廣人教授研發(fā)出了在水稻田直接利用水稻秸稈進行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)生物甲烷的技術(shù)（Methane gas as renewable energy at rice fields tian，GET）［6］。該技術(shù)的原理是利用特制的覆蓋膜系統(tǒng)和水淹條件營造厭氧環(huán)境，將發(fā)酵基質(zhì)和土壤混合后進行厭氧發(fā)酵，再通過集氣裝置收集生物甲烷并加以利用。因此，該技術(shù)除了能有效解決上述問題外，還能降低生產(chǎn)成本、改善土壤肥力。但是，由于該技術(shù)只使用秸稈作為發(fā)酵基質(zhì)，發(fā)酵進程和產(chǎn)率一定程度上受到了限制。在此基礎(chǔ)上，研發(fā)了水稻秸稈與農(nóng)家有機肥田間混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的技術(shù)（Biological methane production from the mixed fermentation with rice straw and farm manure at field，BMP）［7］，通過改善發(fā)酵基質(zhì)的碳氮比和發(fā)酵系統(tǒng)微生物的組成，有效地提高了生物甲烷的產(chǎn)率。

秸稈田間厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷由于利用水稻田農(nóng)閑季節(jié)進行，厭氧發(fā)酵進程的啟動時間、產(chǎn)氣量、底物降解效率和發(fā)酵周期常因溫度較低而受到一定影響。加入以活性炭為代表的碳基導(dǎo)電材料作為添加劑被認為是一種能促進厭氧發(fā)酵進程的有效辦法［8，9］?；钚蕴康忍蓟鶎?dǎo)電材料能聚集微生物，維持有利于微生物生長的環(huán)境，同時又能促進微生物種間電子直接轉(zhuǎn)移，促進厭氧發(fā)酵進程和生物甲烷產(chǎn)量的提高［10-14］。上述相關(guān)研究結(jié)果均是在單一發(fā)酵基質(zhì)上獲得的，由于秸稈與農(nóng)家肥田間混合厭氧發(fā)酵的基質(zhì)與環(huán)境明顯不同，該結(jié)果是否適用不得而知。本研究以秸稈與農(nóng)家有機肥田間混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的技術(shù)原理為依據(jù)，構(gòu)建了試驗用厭氧發(fā)酵裝置，以水稻秸稈和豬糞為混合發(fā)酵基質(zhì)，以水稻田土壤為發(fā)酵的微生物來源，通過加入不同含量的活性炭，測定各處理發(fā)酵系統(tǒng)的產(chǎn)氣量、揮發(fā)性脂肪酸、pH、秸稈降解率等指標(biāo)的變化，揭示了活性炭對水稻秸稈與豬糞混合厭氧發(fā)酵進程和產(chǎn)生物甲烷的作用及其相關(guān)機制，為改善水稻秸稈與豬糞田間混合厭氧發(fā)酵生產(chǎn)甲烷技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻秸稈和土壤取自宜昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院枝江試驗站的水稻田，豬糞取自周邊養(yǎng)豬場。將水稻秸稈剪成3～5 cm，所采取的秸稈、豬糞和土壤取樣風(fēng)干備用。水稻秸稈、豬糞的主要特性見表1。

表1 水稻秸稈和豬糞的主要理化特性

1.2 厭氧發(fā)酵試驗

試驗在實驗室內(nèi)進行，試驗用的發(fā)酵裝置包括用于填充土壤、秸稈和豬糞的厭氧發(fā)酵瓶（2 L）和應(yīng)用排水法收集氣體的集氣瓶（550 mL）。厭氧發(fā)酵瓶的頂部設(shè)有取樣口和與集氣瓶連接的出口，厭氧發(fā)酵瓶和集氣瓶用橡膠導(dǎo)氣管連接。試驗以活性炭為添加劑，共設(shè)置6個處理，活性炭的添加量分別是為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的1%、2%、3%、6%、8%和0%，各記為C1、C2、C3、C4、C5和CK（對照）。每個試驗裝置為1個試驗單元，每個處理水平各包含3個重復(fù)。

在試驗開始前，每個發(fā)酵裝置以TS重量為基準(zhǔn)，各加入120 g風(fēng)干后的發(fā)酵基質(zhì)（豬糞和秸稈各60 g）和80 g水稻田土壤（接種物），混合后按上述添加劑處理水平分別稱取一定量的添加劑溶于1 L去離子水中，經(jīng)攪拌搖勻后加入到發(fā)酵基質(zhì)中。最后密封發(fā)酵裝置，在中溫（35±1）℃下進行為期90 d的混合厭氧發(fā)酵試驗。

1.3 相關(guān)參數(shù)的測定

試驗前發(fā)酵基質(zhì)特性的測定。水稻秸稈和豬糞的總固體（TS）質(zhì)量分數(shù)測定采用烘箱干燥（105±5）℃恒重法測定。發(fā)酵基質(zhì)的揮發(fā)性固體（VS）質(zhì)量分數(shù)的測定采用馬弗爐下灼燒（550±20）℃恒重法測定?？傆袡C質(zhì)（TOC）采用重鉻酸鉀容量法測定。

產(chǎn)氣量和甲烷含量的測定。每5 d采用排水法和氣相色譜儀分別測定。

揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）和pH的測定。每5 d吸取少量發(fā)酵液利用比色法測定其揮發(fā)性脂肪酸含量，同時用pH計測定pH。

秸稈含量的測定。試驗前后分別從各處理取水稻秸稈樣品，采用72%濃硫酸水解法、2 mol/L鹽酸水解法和濃硫酸法測定纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量［15］。

1.4 數(shù)據(jù)處理

分別統(tǒng)計各處理在不同時間的甲烷產(chǎn)量、揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）含量以及pH，分析各處理水平產(chǎn)氣的動態(tài)變化。以活性炭添加量為變量，累積產(chǎn)甲烷量、秸稈木質(zhì)纖維素含量和降解率為因變量，采用SPSS 19.0軟件進行單因子方差分析，分析不同添加量的活性炭對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力和秸稈降解的影響，當(dāng)單因子作用達到顯著水平時（P＜0.05），采用S-N-K法進行多重比較，分析各處理之間的差異水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷產(chǎn)量、p H和揮發(fā)性脂肪酸的時間動態(tài)

厭氧發(fā)酵系統(tǒng)的甲烷產(chǎn)量、pH和揮發(fā)性脂肪酸含量隨發(fā)酵進程呈不同的動態(tài)變化格局（圖1）。各活性炭處理的甲烷產(chǎn)量大體呈“雙峰”變化趨勢（圖1a）。在發(fā)酵15 d后，各處理的產(chǎn)氣量開始迅速增加，其中C1、C2和C3處理的產(chǎn)甲烷速率較CK處理快，各活性炭處理（C1、C2、C3、C4和C5）在第15～20天的甲烷產(chǎn)量為300.21、300.13、282.49、216.55和153.33 mL，分別比CK處理（227.61 mL）提高了31.90%、31.86%、24.11%、-4.86%和-32.63%。隨后各處理在第35～40天到達第一個產(chǎn)甲烷高峰，各活性炭處理（C1、C2、C3、C4和C5）的第一個產(chǎn)甲烷峰值為478.97、497.92、549.47、405.35和427.26 mL，分別比CK處理（396.15 mL）提高了20.91%、25.69%、38.70%、2.32%和7.85%。發(fā)酵前45 d，各處理的累積甲烷產(chǎn)量均達到各自總累積甲烷產(chǎn)量的79%以上。第1次甲烷產(chǎn)量達到峰值后，各處理甲烷產(chǎn)量迅速下降，在第50天達到低點。隨后，添加活性炭的處理甲烷產(chǎn)量再次上升，均在第60天達到第2個峰值，以C2處理的第2個峰值最高（267.57 mL），但對照組沒有形成第2個產(chǎn)氣高峰。

圖1 添加活性炭對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)甲烷產(chǎn)量、p H和揮發(fā)性脂肪酸的影響

各處理的pH呈“單谷”變化趨勢（圖1b）。隨著發(fā)酵時間的延長，各處理pH先下降，至第15天達到最低點，其后迅速上升，CK組pH在第35天達到最高點（7.32），活性炭添加劑組均在第40天達到最高點，隨后各處理pH在7.18～7.29波動。各處理pH最低點變化為5.78～5.90；最高點為7.32～7.39。

各處理的VFAs濃度均呈“單峰”變化趨勢（圖1c）。各活性炭處理VFAs含量峰值隨活性炭添加量的增加呈下降趨勢，各活性炭處理以C1處理峰值最高（2 977.29 mg/L），其余活性炭處理VFAs濃度峰值均低于CK處理（2 865.21 mg/L），并且CK處理到達峰值的時間明顯晚于各活性炭處理。15 d后，各處理VFAs濃度總體呈下降趨勢，并在45 d后保持在較低水平（299.17～657.04 mg/L）波動。

2.2 活性炭對甲烷產(chǎn)量的影響

活性炭的加入對混合厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量有顯著影響（P＜0.05）（表2）。累積產(chǎn)甲烷量隨活性炭添加量的增加呈先上升后下降的趨勢。C2和C3處理對水稻秸稈與豬糞混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力具有顯著促進作用（P＜0.05），與CK處理相比，C2和C3處理累積產(chǎn)甲烷量分別提高了29.29%和28.04%。C1、C4和C5處理對累積產(chǎn)甲烷量無顯著影響（P＞0.05），累積產(chǎn)甲烷量相比CK處理分別提高了9.52%、9.02%和-0.06%。

表2 各處理的累積產(chǎn)甲烷量和TS、VS產(chǎn)甲烷量

2.3 活性炭對秸稈木質(zhì)纖維素降解的作用

活性炭對總木質(zhì)纖維素、纖維素和半纖維素的降解有顯著影響，但對木質(zhì)素降解的影響不顯著（表3）?；钚蕴康募尤肽茱@著提高秸稈中總木質(zhì)纖維素的降解率（P＜0.05），C1、C2、C3、C4和C5處理的總木質(zhì)纖維素降解率分別為（22.20±6.11）%、（26.38±2.46）%、（29.57±2.59）%、（24.35±5.04）%和（22.75±4.21）%，與對照組相比，分別上升了69.47%、101.47%、125.73%、85.88%和73.66%。各活性炭添加劑組的纖維素降解率與對照組相比均有顯著性上升（P＜0.05），半纖維素降解率僅在C2和C3處理中存在顯著性上升（P＜0.05）。各處理以C3處理的降解效果最好，總木質(zhì)纖維素降解率為（29.57±2.59）%，纖維素、半纖維素、木質(zhì)素的降解率分別為（45.35±4.42）%、（34.09±5.39）%、（-20.98±5.46）%。

表3 各處理對秸稈降解的影響 （單位：%）

3 討論

3.1 活性炭對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷進程的影響

活性炭等碳基導(dǎo)電材料的添加是提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力的一種重要手段?；钚蕴康奶砑邮紫葧捬醢l(fā)酵進程產(chǎn)生影響。厭氧發(fā)酵一般分為3個階段，水解階段、酸化階段和產(chǎn)甲烷階段［16］。在水解階段，厭氧菌將復(fù)雜的有機物分解成分子量較小的氨基酸、可溶性單糖、甘油與脂肪酸，此時厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷效率低，VFAs含量開始升高，同時pH開始下降。酸化階段，在產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸菌的作用下，第一階段的中間產(chǎn)物如醇類和脂肪酸轉(zhuǎn)化為乙酸、氫和二氧化碳等，此時VFAs含量上升至峰值，pH繼續(xù)下降，同時甲烷產(chǎn)量開始上升。在產(chǎn)甲烷階段，產(chǎn)甲烷菌將乙酸等簡單有機物分解成甲烷和二氧化碳，二氧化碳在氫氣的作用下還原成甲烷，此時的厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷效率高，且VFAs含量由于產(chǎn)甲烷菌的利用而逐漸下降，pH開始上升。VFAs是秸稈厭氧發(fā)酵過程中反映微生物代謝的一個重要中間產(chǎn)物，其濃度變化、積累情況，均可體現(xiàn)水解、產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸、產(chǎn)甲烷各階段的底物轉(zhuǎn)化速率情況［17］。pH的變化對產(chǎn)酸菌與產(chǎn)甲烷菌影響較大，產(chǎn)酸菌適應(yīng)的pH為5～8，而產(chǎn)甲烷菌適應(yīng)的pH范圍較窄，為6.8～7.4。本研究中，在發(fā)酵前15 d，VFAs含量上升至峰值，同時甲烷產(chǎn)量處于較低水平，表明此時厭氧發(fā)酵系統(tǒng)處于水解和酸化階段。15 d后，甲烷產(chǎn)量大幅上升，VFAs含量呈下降趨勢，表明此時厭氧發(fā)酵系統(tǒng)處于高效產(chǎn)甲烷階段。同時，整個厭氧發(fā)酵過程的pH均保持在產(chǎn)甲烷菌適宜的范圍內(nèi)。各處理各時期甲烷產(chǎn)量、VFAs含量變化與3階段理論基本一致，其不同主要在于各處理甲烷產(chǎn)量和VFAs含量峰值的大小和出現(xiàn)時間。甲烷產(chǎn)量方面，各活性炭處理峰值大小均高于CK處理，VFAs含量方面，峰值出現(xiàn)的時間均早于CK處理。

活性炭由許多呈石墨型的層狀結(jié)構(gòu)微晶不規(guī)則地集合而成，具有多孔、比表面積大的結(jié)構(gòu)，能夠吸附發(fā)酵液中微生物的有害抑制物（如NH3、氫氧化銨、硫化物等），加快產(chǎn)甲烷菌對乙酸等的轉(zhuǎn)化，同時為微生物的富集創(chuàng)造了環(huán)境，促進微生物種間直接電子轉(zhuǎn)移，提高厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷能力［18-21］?；钚蕴磕艽龠M互營VFAs氧化細菌（Gelria和Syntrophomonas）以及與種間直接電子傳遞相關(guān)的微生物（Geobacter和Methanosarcina）的富集，達到加速底物分解、提高產(chǎn)甲烷能力的目的［22］。因此，活性炭的加入對水稻秸稈與豬糞混合厭氧發(fā)酵進程的作用主要體現(xiàn)在提高微生物活性以加快厭氧發(fā)酵進程和提高反應(yīng)程度［23］。但不同添加量的活性炭對厭氧發(fā)酵進程的促進作用有差異。Yan等［24］研究了活性炭對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷的作用，發(fā)現(xiàn)活性炭添加量在0.125～2.000 g/L，產(chǎn)甲烷速率與活性炭添加量呈正相關(guān)。本研究中，活性炭對厭氧發(fā)酵的促進作用隨添加量的增加呈先上升后下降的趨勢，以C3處理促進作用最佳。發(fā)酵初期C1、C2和C3處理的VFAs含量上升速率、產(chǎn)甲烷速率均比CK處理高，VFAs含量開始下降的時間較CK處理提前，產(chǎn)甲烷峰值大小均高于CK處理?？梢钥闯觯趨捬醢l(fā)酵系統(tǒng)中加入適量活性炭能加速微生物對底物的利用，加快厭氧發(fā)酵進程和提高反應(yīng)程度。

3.2 活性炭對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷能力的影響

活性炭等碳基導(dǎo)電材料的添加一般能促進厭氧發(fā)酵甲烷產(chǎn)量，但活性炭的添加量也有適宜范圍，活性炭添加量太低和太高，促進效果均不顯著，過高濃度的活性炭會降低厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)生物甲烷的能力。秦向東等［25］研究了活性炭對雜交狼尾草厭氧發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)活性炭添加量僅在1.6 g/L時甲烷產(chǎn)量略有升高（1.34%），當(dāng)添加量為2.0～8.0 g/L時，厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)氣量隨著活性炭添加量的增加而減少。Pallavi等［26］研究發(fā)現(xiàn)，在高溫條件下小麥殼與污泥混合厭氧發(fā)酵，總產(chǎn)氣量隨著顆?；钚蕴繚舛鹊脑黾佣档停?dāng)添加量高于30 g/L時，其總產(chǎn)氣量低于對照組。本研究中活性炭的添加量分別為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的1%、2%、3%、6%和8%。結(jié)果表明，當(dāng)活性炭添加量為發(fā)酵基質(zhì)質(zhì)量的2%時產(chǎn)甲烷促進效果最好。然而，隨著添加量的增加，其促進效果呈減弱的趨勢。其原因可能與活性炭添加對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響有關(guān)。在一定添加量范圍內(nèi)，活性炭可以為微生物群落提供適宜的微生態(tài)環(huán)境，促進厭氧發(fā)酵微生物系統(tǒng)的形成與活動［27］。但是，當(dāng)活性炭添加量增加到一定程度時，由于厭氧發(fā)酵系統(tǒng)中可利用的營養(yǎng)物質(zhì)有限，微生物數(shù)量的急劇增加并不會引起生物甲烷產(chǎn)量同步增長，反而會因微生物間的競爭作用一定程度影響到生物甲烷產(chǎn)量［28］。

3.3 活性炭對厭氧發(fā)酵系統(tǒng)秸稈降解的影響

水稻秸稈中木質(zhì)纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成，厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生物甲烷來自于水稻秸稈木質(zhì)纖維素中碳的分解與轉(zhuǎn)化［29］。伴隨著厭氧發(fā)酵進程，秸稈的纖維素和半纖維素含量大幅降低，而木質(zhì)素因降解困難，其在木質(zhì)纖維素含量中所占比例反而略有升高［30］。甘榮等［31］研究了活性炭在中高溫條件下對玉米秸稈厭氧發(fā)酵的影響，發(fā)現(xiàn)添加5 g/L活性炭使秸稈纖維素、半纖維素降解率分別提高了63%和56%。本研究中，活性炭的添加能顯著促進秸稈中總木質(zhì)纖維素的降解，其中對秸稈中纖維素降解率有顯著影響，對半纖維素降解率的影響僅在C2和C3處理能達到顯著性，而對木質(zhì)素降解率無顯著性影響。活性炭的添加對木質(zhì)纖維素降解的促進作用，可能是由于活性炭吸附菌群后，改變了菌群數(shù)量和種類，富集強化了水解菌和產(chǎn)甲烷菌，從而提高秸稈降解率。

厭氧發(fā)酵中木質(zhì)纖維素的降解程度與厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷能力有直接的關(guān)系，本研究以豬糞和秸稈為發(fā)酵基質(zhì)，通過添加活性炭來促進秸稈的降解和提高生物甲烷的產(chǎn)量。試驗中秸稈木質(zhì)纖維素的降解和厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷性能的變化是趨同的。各處理秸稈總木質(zhì)纖維素降解率越高，其累積甲烷產(chǎn)量也就越高。各處理中以C2和C3處理總木質(zhì)纖維素降解率最高，分別為26.38%和29.57%，比對照提高了101.47%和125.73%，其累積甲烷產(chǎn)量也因此分別比對照組提高了29.29%和28.04%。該結(jié)果與已有的相關(guān)研究結(jié)果一致［32］。

本研究在實驗室水平測試了活性炭對豬糞和秸稈混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的作用。在田間試驗與生產(chǎn)中，考慮到應(yīng)用成本，可利用生物炭來取代進行。生物炭一般是由植物根莖、木屑、秸稈等加工而成的一種多孔炭，常被用做常規(guī)炭質(zhì)材料（如活性炭、碳納米管和氧化石墨烯）的替代品［33］。其平均全碳含量達到64%，平均比表面積為124.83 m2/g。因此生物炭作為外源添加物對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷能力同樣具有促進作用［34，35］。今后將進一步研究生物炭作為添加劑用于田間厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷的可行性，以促進水稻秸稈與農(nóng)家有機肥混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)生物甲烷技術(shù)的推廣與應(yīng)用。

4 結(jié)論

活性炭的添加能調(diào)控厭氧發(fā)酵進程。添加量在1%～3%能加快厭氧發(fā)酵進程，并且能夠維持厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷系統(tǒng)的pH保持在6.76～7.39。添加適量的活性炭對秸稈與豬糞混合厭氧發(fā)酵系統(tǒng)產(chǎn)甲烷能力有顯著的促進作用，在2%活性炭添加量的條件下促進效應(yīng)最為顯著，其累積甲烷產(chǎn)量與對照組相比提高了29.29%。活性炭的添加還能促進纖維素和半纖維素的降解。添加量在3%時對秸稈的降解作用最好，總木質(zhì)纖維素降解率達到29.57%。