張晶晶，張 寧，侯 微，曲正義，李亞麗，鄭培和

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112）

人參（Panax ginsengC.A.Meyer）是五加科人參屬多年生草本植物，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值［1］。早在西漢時(shí)期，人參就在治療和防御疾病等方面被廣泛應(yīng)用［2］。人參藥用部位為多年生宿根，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，易遭受多種病原菌的侵染［3］。人參根腐病是一種土傳性真菌病害，是人參根部主要病害之一［4］。該病發(fā)病初期癥狀不明顯，后期葉片開(kāi)始變黃，地下根部腐爛，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致整株人參死亡，對(duì)人參的產(chǎn)量和質(zhì)量造成很大的影響［5-7］。篩選并培育人參抗根腐病品系是有效且常用的防治病害的方法之一，而抗病品系的發(fā)掘和利用是培育抗病品種的重要環(huán)節(jié)，因此，建立一套準(zhǔn)確、實(shí)用的人工接種抗病性篩選方法，可以加快人參的抗病育種進(jìn)程。

鄧麗君等［8］研究表明離體葉片接種法可用于甜瓜白粉病生理小種的鑒別和抗源鑒定。朱麗梅等［9］采用自然病圃法和離體葉片接種法分別對(duì)茄子早疫病進(jìn)行抗病性篩選比較，鑒定結(jié)果基本一致，說(shuō)明離體葉片接種法可作為茄子早疫病抗病性篩選的輔助手段。與活體接種篩選相比，離體葉片接種法篩選具有不損傷植株、節(jié)省菌液、接種標(biāo)準(zhǔn)一致以及不易產(chǎn)生病原菌擴(kuò)散等優(yōu)點(diǎn)［10］，但根腐病離體抗性篩選相關(guān)的報(bào)道相對(duì)較少。有研究表明，在木薯和白掌中可通過(guò)離體葉片接種法對(duì)根莖部病害進(jìn)行抗性篩選［11，12］。在百合中，離體葉片接種法可用于鱗莖腐爛病抗性資源篩選，并通過(guò)試驗(yàn)表明該方法可靠、有效［13］。

目前，國(guó)內(nèi)外鮮見(jiàn)人參根腐病離體抗性篩選的相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)人參離體接種方法對(duì)人參離體葉片和根塊進(jìn)行根腐病接種，并利用病斑直徑及發(fā)病情況對(duì)人參種質(zhì)材料進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)，為人參根腐病的抗性篩選及資源評(píng)價(jià)提供新的技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為吉林省吉林市左家鎮(zhèn)試驗(yàn)基地（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家資源圃）4年生人參。

1.2 供試菌株

腐皮鐮刀菌（Fusarium solani），由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室前期篩選所得。

1.2.1 培養(yǎng)基 固體培養(yǎng)基：稱取37 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），加入1 000 mL去離子水中，加熱煮沸溶解，分裝，121℃高壓滅菌15 min，備用。

液體培養(yǎng)基：稱取35 g馬鈴薯葡萄糖肉湯培養(yǎng)基（PDB），加熱攪拌，溶于1 000 mL去離子水中，分裝，115℃，高壓滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌種培養(yǎng) 活化培養(yǎng)：將帶有腐皮鐮刀菌菌絲的瓊脂塊通過(guò)無(wú)菌手術(shù)刀切成0.4～0.5 cm的菌塊，接種到PDA培養(yǎng)基的平板上。封口膜封口后，倒置于25℃培養(yǎng)箱中，活化培養(yǎng)2～3 d，至白色菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面時(shí)取出。

擴(kuò)大培養(yǎng)：將活化培養(yǎng)的0.4～0.5 cm的菌塊，接種到新的PDA培養(yǎng)基，相同條件下培養(yǎng)2～3 d，至白色菌絲長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面時(shí)取出，備用。

將保存的根腐病菌轉(zhuǎn)接到PDB液體培養(yǎng)基中，將其在溫度為25℃、轉(zhuǎn)速為200 r/min的搖床上避光搖3 d，使其產(chǎn)生大量的孢子，將含孢子的PDB液體培養(yǎng)基用2層無(wú)菌紗布過(guò)濾，除去菌絲以獲取孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為1×106個(gè)/mL，用于接種鑒定。

1.2.3 人參離體葉片接種 每株摘取6片完全展開(kāi)的葉片，采用菌塊、孢子懸浮液2種不同的接種方法分別對(duì)人參葉片正反面進(jìn)行接種，每組3次重復(fù)，以不接種病菌作為對(duì)照，將葉片置于含有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中，使用10μL的移液器吸取10μL的孢子懸浮液滴在單葉的葉脈2側(cè)，用打孔器打取菌塊（直徑4 mm）在同樣位置接種于單葉的葉脈2側(cè)，培養(yǎng)皿補(bǔ)充少量清水，封口后置于生化培養(yǎng)箱中，每天14 h光照、10 h黑暗處理。每天觀察葉片的發(fā)病情況，并測(cè)量病斑直徑大小。

1.2.4 人參根塊接種 取人參（與前面離體葉片所用的人參來(lái)自同一品系）根塊置于空培養(yǎng)皿中，在每塊人參根塊上接種病原菌孢子懸浮液10μL，以沒(méi)作任何處理的根塊作為對(duì)照組，將培養(yǎng)皿放于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，觀察人參根塊的發(fā)病情況。

1.2.5 不同品系人參抗性評(píng)價(jià) 每個(gè)品系（編號(hào)：FS、SW、HS、FX2）摘取完全展開(kāi)的葉片，采用菌塊接種方法對(duì)人參葉片進(jìn)行正面接菌，4組重復(fù)，以不接種病菌作為對(duì)照，將葉片置于含有吸水濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)測(cè)量方法同“1.2.3”。同時(shí)，采取4種不同品系人參的參須進(jìn)行平行抗病性評(píng)價(jià)。

1.2.6 病害嚴(yán)重度分級(jí) 病害嚴(yán)重度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：1為無(wú)明顯損傷；2為病斑直徑小于1.0 cm；3為病斑直徑為1.0～1.5 cm；4為病斑直徑為1.5～2.0 cm；5為病斑直徑大于2.0 cm，病斑相連呈不規(guī)則大斑塊；6為整片葉片侵染發(fā)病。計(jì)算病情指數(shù)。其中病情指數(shù)分為4級(jí)：1級(jí)，免疫，病情指數(shù)=0；2級(jí)，高抗（HR）0＜病情指數(shù)≤35.0；3級(jí)，中抗（MR），35.0＜病情指數(shù)≤50.0；4級(jí)，高感（HS），病情指數(shù)＞50.0。病情指數(shù)計(jì)算公式如下。

1.2.7 人參抗、感株系的參須回接試驗(yàn) 通過(guò)離體葉片方法從1 424株人參中篩選出人參抗病株50株，從中選取8株抗病株和8株感病株，取其參須進(jìn)行回接試驗(yàn)，在每組抗感株系的參須上各接種病原菌孢子懸浮液10μL，于25℃的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，3 d后觀察參須的發(fā)病情況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用Prism 6軟件對(duì)離體葉片接種法進(jìn)行相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參離體葉片接種法分析

以相同濃度的菌懸液（1×106個(gè)/mL）分別采用正面和反面2種接種方法接種到人參同一植株不同葉片上，試驗(yàn)設(shè)置3組重復(fù)。對(duì)接種5 d后的葉片進(jìn)行調(diào)查（圖1），發(fā)現(xiàn)2種方法均可誘導(dǎo)葉片發(fā)病，對(duì)照組不發(fā)病，且葉片正面接菌比背面接菌發(fā)病更快，病斑更大。正面接種產(chǎn)生的病斑直徑大小平均為2.01 cm，反面接種產(chǎn)生病斑大小的平均值為1.82cm。采用同樣大小菌塊（直徑0.40 cm）進(jìn)行接種（圖1），結(jié)果表明，正面和反面2種接種方法均可誘導(dǎo)葉片發(fā)病，對(duì)照組不發(fā)病。正面接種產(chǎn)生的病斑直徑大小平均為2.17 cm，反面接種產(chǎn)生的病斑直徑大小平均為2.03 cm。比較正、反面2種接種方法的效果，正面接種要比反面更容易受到病原菌的侵染，對(duì)比菌液和菌塊接種，菌塊接種比菌液接種能產(chǎn)生更大的病斑，說(shuō)明菌塊接種發(fā)病效果更好。

圖1 人參根腐病不同接種方法比較

2.2 人參離體葉片發(fā)病癥狀表現(xiàn)

利用離體葉片接種法接種，人參離體葉片發(fā)病癥狀表現(xiàn)如圖2所示。從圖2可以看出，接種3 d后，接種部位出現(xiàn)病斑；接種5 d后，病斑明顯擴(kuò)大且葉片開(kāi)始發(fā)黃；接種7 d后，接種部位腐爛，葉片整體發(fā)黃，病斑幾乎蔓延整個(gè)葉片；接種11 d后，整個(gè)葉片失綠且腐爛。因此可以確定接種5 d后對(duì)發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查最為合適。

圖2 人參離體葉片接種不同時(shí)間發(fā)病癥狀對(duì)比

2.3 人參根塊接種法分析

將腐皮鐮刀菌接種于人參根塊上，回接驗(yàn)證效果見(jiàn)圖3。從圖3可以看出，接種3 d后，人參根塊上面長(zhǎng)有明顯的病斑，病原菌生長(zhǎng)旺盛，菌絲體向外延伸，根塊有腐爛跡象。接種5 d后，根塊開(kāi)始泛黃，出現(xiàn)腐爛現(xiàn)象。接種7 d后，根塊松軟，且腐爛部位顏色加深，整個(gè)根塊幾乎全部腐爛。人參根塊接種結(jié)果與離體葉片接種結(jié)果基本一致。

圖3 人參根塊回接驗(yàn)證

2.4 不同品系人參離體葉片接種抗性評(píng)價(jià)

接種5 d后，對(duì)葉片發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。FS發(fā)病情況最輕，病斑直徑最小，HS發(fā)病情況最嚴(yán)重，病斑直徑最大，SW和FX2發(fā)病情況差不多，SW病斑直徑比HS略微小一些。通過(guò)統(tǒng)計(jì)病斑直徑可知，4個(gè)品系中，F(xiàn)S抗病性最強(qiáng)，HS抗病性最差；通過(guò)計(jì)算其病情指數(shù)可知，F(xiàn)S為高抗等級(jí)，SW為中抗等級(jí)，HS和FX2為高感等級(jí)。

表1 不同品系人參葉片抗病性鑒定

2.5 不同品系人參須接種抗性評(píng)價(jià)

采取4種不同品系人參的參須進(jìn)行抗病性評(píng)價(jià)（圖4）。接種3 d后，對(duì)參須發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)FS參須腐爛情況最輕，SW和HS居中，F(xiàn)X2發(fā)病情況最嚴(yán)重，說(shuō)明FS抗病性最強(qiáng)，F(xiàn)X2抗病性最差，該結(jié)果與離體葉片抗性評(píng)價(jià)基本一致。

圖4 不同品系人參須抗病性鑒定

2.6 人參抗、感株系的參須回接試驗(yàn)

取抗病株和感病株的參須，將腐皮鐮刀菌懸液分別接種于參須上，回接驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種3 d后，抗病株有輕微發(fā)病現(xiàn)象，參須腐爛情況不明顯，感病株整體腐爛嚴(yán)重。通過(guò)參須回接試驗(yàn)進(jìn)一步表明離體葉片接種法可用于人參根腐病的抗性篩選。

圖5 人參須回接驗(yàn)證

3 小結(jié)與討論

目前在三七中，已經(jīng)采用離體葉片接種法建立了一種用于三七黑斑病抗性鑒定的方法［14］。在大豆中也有相關(guān)研究，可采用離體葉片接種的方法對(duì)大豆疫霉根腐病抗病性進(jìn)行鑒定［15］。在水稻中，采用q-PCR和離體葉片相結(jié)合的方法對(duì)水稻紋枯病發(fā)病程度進(jìn)行定量分析［16］。任琴琴等［17］通過(guò)分子標(biāo)記與離體葉片接種方法相結(jié)合，對(duì)甜瓜蔓枯病抗感材料進(jìn)行了篩選，成功篩選出了抗感株系。在西瓜中，建立了一種西瓜炭疽病菌離體葉片接種鑒定技術(shù)，可用于對(duì)炭疽病抗性進(jìn)行鑒定［10］。張志剛等［18］通過(guò)分析小麥白粉病在室內(nèi)植株上的發(fā)病特點(diǎn)，進(jìn)行了離體葉片人工接種方法的探索，結(jié)果表明該方法可行。應(yīng)用離體葉片法還可以對(duì)菠蘿資源心腐病抗性進(jìn)行鑒定［19］。研究表明［11］，離體葉片接種法可用于篩選木薯根腐病抗病資源，是一種高效、可靠的抗性篩選方法，為木薯抗病育種奠定了基礎(chǔ)。林善海等［20］發(fā)明了一種采用離體葉片鑒定甘蔗梢腐病抗性的方法，該方法無(wú)需按照季節(jié)進(jìn)行甘蔗種苗的種植，不受甘蔗苗齡和場(chǎng)地的限制，操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好，對(duì)大量樣本的篩選具有較好的省工、省時(shí)的特點(diǎn)。戴樺均［12］通過(guò)研究明確了離體葉片接種法可用于植物根部病害抗性篩選的可行性，克服了傳統(tǒng)根莖部病害抗性鑒定的不足。

本研究嘗試將離體接種法應(yīng)用于篩選人參根腐病抗病性的可能性，將人參根腐病接種到離體葉片上，并采用菌塊、菌液2種不同接種方法分別對(duì)人參葉片正、反面進(jìn)行接種，結(jié)果表明，正面接種要比反面接種更容易受到病原菌的侵染，菌塊、菌液接種相比較，菌塊接種發(fā)病效果更好。將病原菌接種到人參根塊上，發(fā)現(xiàn)發(fā)病情況和葉片基本一致，通過(guò)2種離體接種方法比較，表明用離體葉片比用根塊接種更加直觀、簡(jiǎn)便，進(jìn)一步通過(guò)人參抗感株系的參須回接試驗(yàn)，初步證明離體葉片接種法可以用于人參根腐病的抗性篩選。通過(guò)對(duì)不同品系人參進(jìn)行接菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FS抗病性最好，F(xiàn)X2抗病能力最差，通過(guò)統(tǒng)計(jì)病斑直徑，計(jì)算其病情指數(shù)可知，F(xiàn)S為高抗等級(jí)，SW為中抗等級(jí)，HS和FX2為高感等級(jí)，試驗(yàn)表明離體葉片接種法可用于人參根腐病抗性篩選。本研究對(duì)人參根腐病離體抗性篩選方法進(jìn)行了初步探究，發(fā)現(xiàn)該方法可用于對(duì)試驗(yàn)田的人參進(jìn)行抗感株系的初步篩選，具有操作簡(jiǎn)便、植株發(fā)病癥狀明顯、速度快、不傷害植物等優(yōu)點(diǎn)，為人參根腐病抗性篩選提供更多輔助方法，為人參抗根腐病種質(zhì)資源的篩選提供參考。