李書(shū)帆，江漢美，劉 毅，劉天琪

（湖北中醫(yī)藥大學(xué)/湖北省藥用植物研發(fā)中心，武漢 430065）

固相微萃?。⊿PME）技術(shù)由固相萃?。⊿PE）發(fā)展而來(lái)，在保留SPE純化萃取特點(diǎn)的同時(shí)克服了SPE需要柱填充物和使用有機(jī)溶劑進(jìn)行解吸的缺點(diǎn)。固相微萃取技術(shù)摒棄了處理復(fù)雜樣品時(shí)傳統(tǒng)的溶劑提取操作步驟，利用待測(cè)物在固定相涂層與樣品之間的吸附平衡原理富集待測(cè)物，再通過(guò)解吸過(guò)程，使用與之相聯(lián)的分析儀器對(duì)待測(cè)物進(jìn)行分析［1］。

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiongHort.）的干燥根莖，具有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，川芎揮發(fā)油具有協(xié)同鎮(zhèn)痛、解熱、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等能力［2］。

葛根為豆科植物野葛［Pueraria lobata（Willd.）Ohwi］的干燥根，具有解肌退熱，生津止渴，透疹，升陽(yáng)止瀉，通經(jīng)活絡(luò)，解酒毒的功效。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，葛根揮發(fā)性成分具有抗腫瘤、抗氧化應(yīng)激、抗炎等生理活性，臨床用于溶解膽結(jié)石、緩解胃灼熱等治療［3］。

根據(jù)病情需要和藥性特點(diǎn)，按照用藥法度，將2種或2種以上藥物配合應(yīng)用，稱為配伍。藥對(duì)也稱作為對(duì)藥，是一種中醫(yī)臨床以相對(duì)固定的2味藥進(jìn)行配伍的形式，在方劑配伍中可以發(fā)揮出相輔相成的作用，是古今中醫(yī)學(xué)家長(zhǎng)期的醫(yī)療實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)的總結(jié)，具有豐富的內(nèi)容和奧妙的內(nèi)涵［4］。川芎-葛根藥對(duì)，目前被廣泛用于老年冠心病和老年性暈眩的治療［5，6］。

目前針對(duì)川芎-葛根藥對(duì)的研究多集中臨床應(yīng)用和藥理作用方面［7，8］，成分分析多集中在醇提成分上［9，10］，而對(duì)其揮發(fā)性成分研究較少。開(kāi)展川芎、葛根藥對(duì)配伍后揮發(fā)性成分研究，對(duì)剖析其配伍機(jī)理和應(yīng)用該藥對(duì)及其復(fù)方有重要價(jià)值。本研究采用固相微萃取（HS-SPME）與氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）的方法，對(duì)川芎、葛根以及川芎、葛根藥對(duì)中揮發(fā)性成分進(jìn)行分析，以期為二者及藥對(duì)的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent6890/5973型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；NIST05系列標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)；手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器裝置、65μm聚二甲基硅氧烷-二乙烯基苯（PDMS-DVB）萃取頭（德國(guó)Supelco公司）；15 mL頂空瓶。

1.2 試劑

川芎（批號(hào)20200915）、葛根（批號(hào)20200825）購(gòu)于武漢老百姓大藥房，其中川芎經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室楊紅兵教授鑒定為川芎的干燥成熟果實(shí)。

1.3 方法

1.3.1 GC-MS色譜條件 色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25μm）石英毛細(xì)管色譜柱；程序：升溫，初始溫度50℃，20℃/min升溫至75℃，再以5℃/min升溫至200℃，然后以20℃/min升溫至280℃；載氣：高純氦氣；流速：0.8 mL/min；不分流；無(wú)溶劑延遲；接口溫度：230℃。質(zhì)譜條件：離子源為EI源，電子能量；70 eV；離子源溫度：230℃；四極桿溫度：150℃；倍增管電壓：1.2 kV；質(zhì)量范圍：35～550m/z。

1.3.2 頂空固相微萃取條件的優(yōu)化 取川芎、葛根樣品粉末0.6 g置于樣品瓶中，插入裝有65μm PDMS-DVB萃取纖維頭（使用前先將萃取頭在氣相色譜進(jìn)樣口230℃老化18 min）的手動(dòng)進(jìn)樣器。

以出峰數(shù)和峰面積為指標(biāo)，分別對(duì)川芎-葛根藥對(duì)粉末質(zhì)量（0.4、0.6、0.8 g）、萃取溫度（60、80、100℃）、萃取時(shí)間（15、20、25 min）、解吸附時(shí)間（3、4、5 min）進(jìn)行比較。最終確定條件為質(zhì)量0.6 g，萃取溫度100℃，萃取時(shí)間20 min，解吸附時(shí)間3 min。

1.3.3 樣品處理

1）葛根揮發(fā)性成分提取測(cè)定。取干燥葛根塊，粉碎、過(guò)4號(hào)篩，稱取粉末0.6 g，置于15 mL頂空采樣瓶中，將老化過(guò)的固相微萃取探頭插入采樣瓶中，將萃取探頭里的萃取纖維推出，距離粉末約5 cm。于100℃下頂空萃取20 min，取出，插入氣相色譜儀進(jìn)樣口（230℃），解吸附3 min，進(jìn)行GC-MS分析。

2）川芎揮發(fā)性成分提取測(cè)定。取干燥川芎塊，粉碎、過(guò)4號(hào)篩，稱取粉末0.6 g，按照葛根揮發(fā)成分提取測(cè)定方法，進(jìn)行GC-MS分析。

3）川芎-葛根藥對(duì)揮發(fā)性成分提取測(cè)定。取葛根、川芎藥材粉末各0.3 g，按照葛根揮發(fā)成分提取測(cè)定方法，進(jìn)行GC-MS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 揮發(fā)性組分定量分析

葛根、川芎、川芎-葛根藥對(duì)的揮發(fā)性成分TIC色譜見(jiàn)圖1、圖2、圖3。如圖1至圖3所示，葛根藥材粉末出峰30個(gè)，定性化學(xué)成分13個(gè)；川芎藥材粉末出峰70個(gè)，定性化學(xué)成分31個(gè)；川芎-葛根藥材粉末出峰67個(gè)，定性化學(xué)成分36個(gè)。通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算葛根、川芎、川芎-葛根藥對(duì)中各成分的相對(duì)峰面積，得到葛根、川芎、川芎-葛根藥對(duì)揮發(fā)性組分含量分別占總出峰成分的84.12%、90.08%、87.91%。

圖1 葛根揮發(fā)性成分TIC色譜

圖2 川芎揮發(fā)性成分TIC色譜

圖3 川芎-葛根藥對(duì)揮發(fā)性成分TIC色譜

2.2 藥對(duì)與單味藥之間揮發(fā)性成分含量比較與分析

檢索鑒定各個(gè)化合物結(jié)構(gòu)與名稱，部分化合物分析和計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表1。由表1列出的化學(xué)成分可知，葛根揮發(fā)性組分主要為（-）-α-蓽澄茄油烯（13.85%）、1，2，4a，5，6，8a-六氫-1-異丙基-4，7-二甲基萘（11.16%）、4-甲基吲哚啉（3.12%）等。川芎揮發(fā)性組分主要為間甲酚（48.49%）、9-（1-甲基亞乙基）-1，5-環(huán)十一二烯（7.77%）等。川芎-葛根藥對(duì)的揮發(fā)性組分主要為β-甲基苯丙醛（46.84%）、9-（1-甲基亞乙基）-1，5-環(huán)十一二烯（8.05%）、Naphthalene，1，2，3，4，4a，7-hexahydro-1，6-dimethyl-4-（1-methylethyl）-（6.95%）、γ-松油烯（4.35%）等。

表1 川芎-葛根藥對(duì)及其單味藥揮發(fā)性化學(xué)成分分析

葛根與川芎的共有揮發(fā)性組分有6個(gè)，葛根與川芎-葛根藥對(duì)的共有揮發(fā)性組分有5個(gè)，川芎與川芎-葛根藥對(duì)的共有揮發(fā)性組分有14個(gè)。三者共有成分為4-萜烯醇、1，2，4a，5，6，8a-六氫-1-異丙基-4，7-二甲基萘、去氫白菖烯、3-甲基十三烷。同時(shí)，藥對(duì)新增21個(gè)成分，組成藥對(duì)后，單味藥中有32種成分在藥對(duì)中未能檢測(cè)出。

續(xù)表1

3 小結(jié)與討論

3.1 小結(jié)

本研究分析了川芎-葛根藥對(duì)及其單味藥揮發(fā)性成分的組成和藥理作用。采用固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，對(duì)川芎-葛根藥對(duì)與單味藥中揮發(fā)性化學(xué)成分進(jìn)行定性和定量分析，以峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。結(jié)果初步鑒定出68種化合物。藥對(duì)、川芎和葛根中含量最高的揮發(fā)性成分相對(duì)含量依次為β-甲基苯丙醛（46.84%）、間甲酚（48.49%）、（-）-α-蓽澄茄油烯（13.85%）。組成藥對(duì)后新增21種成分，原有組分減少32種。證明該方法穩(wěn)定可靠，適用于川芎-葛根藥對(duì)及其單味藥揮發(fā)性成分的快速分析。同時(shí)，川芎、葛根二者聯(lián)用，形成的藥對(duì)在配伍前后成分發(fā)生了較為明顯的變化。

3.2 討論

3.2.1 揮發(fā)性成分存在情況 通過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，發(fā)現(xiàn)川芎、葛根和川芎-葛根藥對(duì)揮發(fā)性成分存在3種情況，一是單味藥中某種揮發(fā)性成分在配伍后的藥對(duì)中，該成分含量介于單味藥之間，比如去氫白菖烯（0.23%）；二是單味藥中某種揮發(fā)性成分在配伍后的藥對(duì)中，含量幾乎無(wú)變化，如苯戊酮（0.25%）；三是部分揮發(fā)性成分只存在于單味藥或者藥對(duì)中，即成分有新增或減少，比如川芎獨(dú)有揮發(fā)性成分間甲酚（48.49%），葛根獨(dú)有揮發(fā)性成分（-）-α-蓽澄茄油烯（13.85%），川芎-葛根藥對(duì)獨(dú)有揮發(fā)性成分β-甲基苯丙醛（46.84%），其原因可能是葛根、川芎藥材在萃取揮發(fā)性組分時(shí)，產(chǎn)生了化學(xué)反應(yīng)或物理變化，具體原因還有待進(jìn)一步的研究。

3.2.2 藥對(duì)與單味藥揮發(fā)性成分藥理作用分析 川芎-葛根藥對(duì)與單味藥對(duì)比，新增的（1R）-（+）-α-蒎烯，具有抑菌、改善潰瘍和寬中除脹的功效［10］；藥對(duì)中特有的松油醇，具有抑菌止咳、解熱的作用［11］；新增的丁香烯，有研究表明其具有消炎、抗菌、平喘作用［12，13］，同時(shí)具有免疫促進(jìn)作用［14］，還有研究表明丁香烯具有治療慢性心律失常的作用［15］，為其在心血管疾病治療上提供了理論依據(jù)，推測(cè)丁香烯與老年冠心病及老年性暈眩有關(guān)。川芎含有的γ-欖香烯，據(jù)報(bào)道具有抗病毒抗腫瘤的功效［16］；金合歡烯具有抗氧化和抑菌的作用［17］。而葛根中含有的β-欖香烯對(duì)癌細(xì)胞具有抑制作用，同時(shí)還有調(diào)節(jié)心血管功能作用，這可能為其組成藥對(duì)后治療冠心病提供線索［18，19］。藥對(duì)配伍的意義，并不是2味藥相加的總和，而是在2味藥結(jié)合的同時(shí)，通過(guò)復(fù)雜反應(yīng)，發(fā)揮協(xié)同增效的作用，雙方通過(guò)相須相使使藥性達(dá)到1+1＞2的效果［20］。