黃釗希，陸柳桂，高泳，廖新紅

(1. 廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；2. 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院超聲科，廣西 南寧 530021)

癌癥是嚴(yán)重危害中國居民健康的重大慢性疾病之一，其發(fā)病率及死亡率分別占全球的23.7%、30%[1]。盡管近年來靶向治療、免疫治療等新興療法已逐步應(yīng)用于臨床，化療依然是絕大多數(shù)惡性腫瘤的主要治療手段。以阿霉素為代表的蒽環(huán)類藥物仍是大多數(shù)實體腫瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療的基礎(chǔ)藥物，但由于阿霉素毒性大，引發(fā)心臟毒性、胃腸道反應(yīng)、骨髓抑制、脫發(fā)和藥物外滲等不良反應(yīng)，限制了其臨床應(yīng)用[2]。

已有研究表明，載藥超聲納米泡能作為藥物載體，高效運載化療藥物，聯(lián)合超聲輻射作用下，可實現(xiàn)化療藥物定向釋放提高療效，同時減少化療藥物在腫瘤以外的部位聚集，減輕全身毒副作用[3]。目前，載藥超聲納米泡的研究眾多，其制備條件及成膜材料不同，制備出來的超聲納米泡在各項物理特性和成像特性上均存在一定的差異[4-6]，因而，如何制備安全性高且穩(wěn)定性好的載藥超聲納米泡仍是目前分子影像研究的熱點及難點。本實驗通過添加聚合物N，N-二乙基丙烯酰胺(N，n-diethyl acrylamide， NNDEA)和表面活性劑Pluronic 124，擬制備一種既安全、穩(wěn)定且操作簡單、成本低的載藥超聲納米泡造影劑，通過優(yōu)化關(guān)鍵制備參數(shù)，觀察其理化特性，為后續(xù)探究載藥超聲納米泡的體內(nèi)腫瘤成像及治療提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine，DPPC)和二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇 (1，2-distearoyl-phosphatidylethanol amine-methyl-poly ethylene glycol conjugate-2000，DSPE-mPEG2000)購自北京謹(jǐn)明生物科技有限公司；二棕櫚酰磷脂酰膽堿(1，2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphorylethanolamin，DPPE)、二棕櫚酰磷脂酸(1，2 dipalmitoyl-sn-Glycero-3-Phosphate，DPPA)、甘油、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、鹽酸阿霉素(doxorubicin，Dox)、Irgacure 2959、N，N′-雙(丙稀酰)胱胺[N，N-bis(acryoyl) cystamine，BAC]均購自上海麥克林生化科技有限公司；N，N′-二乙基丙酰胺(NNDEA)購自上海賢鼎生物科技有限公司；Pluronic 124購自美國Sigma-Aldrich；氯仿購自成都科隆化學(xué)品有限公司；全氟丙烷氣體(C3F8)購自深圳金谷氣體有限公司。

1.2 主要儀器 XS205DU十萬分之一天平購自梅特勒-托利多，KQ-501DB超聲波清洗儀購自昆山市超聲儀器有限公司，XD-W2308加熱板購自深圳市興達(dá)恒業(yè)科技有限公司，HH-420恒溫水浴鍋購自金壇市易晨儀器有限公司，HL-AH(G8)銀汞調(diào)和器購自杭州中潤醫(yī)療器械有限公司，Zetasizer Nano ZS納米粒度電位儀購自英國馬爾文儀器有限公司；光學(xué)顯微鏡購自O(shè)lympus，血球計數(shù)板購自上海市求精生化試劑儀器有限公司，冷凍干燥機購自德國ALPHA 1-2 LD plus，Synergy H1多功能酶標(biāo)儀購自美國伯騰儀器有限公司，85-2恒溫磁力加熱攪拌器購自常州翔天實驗儀器廠，超聲治療儀UT1021購自深圳東迪欣科技有限公司，診斷超聲儀GELOGIQ E9。

1.3 實驗方法

1.3.1 NBs的制備及優(yōu)化 ①以質(zhì)量比為1∶1.5∶4∶1準(zhǔn)確稱取DPPA、DPPE、DPPC和DSPE-mPEG2000于離心管中，加入氯仿，在37 ℃超聲波清洗儀中振蕩充分溶解；②隨后將澄清的脂質(zhì)材料混合液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，開蓋置于65 ℃加熱板上作用，去除溶劑，直至瓶內(nèi)脂質(zhì)材料呈薄膜狀；③取甘油50 μL，以及一定比例的Pluronic 124、Irgacure 2959溶液的混合液1 mL加入薄膜瓶中，加蓋密封，65 ℃水浴30 min；④以2∶1的比例加入NNDEA、BAC。⑤抽出瓶內(nèi)空氣并充入C3F8氣體。使用銀汞調(diào)和儀以恒定振蕩頻率下調(diào)整振蕩時間，4 ℃倒置分層，下層清液為所需NBs。

1.3.2 Dox-NBs的制備 ①以質(zhì)量比為1∶1.5∶4∶

1準(zhǔn)確稱取DPPA、DPPE、DPPC和DSPE-mPEG2000于離心管中，加入氯仿，在37 ℃超聲波清洗儀中振蕩充分溶解；②隨后將澄清的脂質(zhì)材料混合液轉(zhuǎn)移至樣品瓶中，開蓋置于65 ℃加熱板上作用，去除溶劑，直至瓶內(nèi)脂質(zhì)材料呈薄膜狀；③取甘油50 μL，以及一定比例的Pluronic 124、Dox、Irgacure 2959溶液的混合液1 mL加入薄膜瓶中，加蓋密封，65 ℃水浴30 min；④以2∶1的比例加入NNDEA、BAC；⑤抽出瓶內(nèi)空氣并充入C3F8氣體，用銀汞調(diào)和儀高速振蕩60 s，置于254 nm紫外燈下照射30 min，4 ℃倒置分層，下層清液為所需Dox-NBs，以上操作避光進(jìn)行。

1.3.3 超聲納米泡的表征檢測 將Dox-NBs及NBs用PBS稀釋相同倍數(shù)，采用納米粒度電位儀檢測樣本的粒徑大小及分散度、Zeta電位(儀器設(shè)置條件：T=25 ℃，laser wavelength=660 nm，angle=90)，光學(xué)顯微鏡×400下觀察Dox-NBs的一般形態(tài)，血球計數(shù)板計數(shù)Dox-NBs濃度[25×16規(guī)格，計數(shù)公式：a=(b/5)×25×10000×稀釋倍數(shù)]。

1.3.4 Dox-NBs中Dox的載藥量與包封率測定 采用酶標(biāo)儀波長λ=483 nm條件下繪制阿霉素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程備用。將樣品瓶中Dox-NBs轉(zhuǎn)移至分子截留量為12 000～14 000 Da透析袋中透析過夜，以去除游離的Dox。采用冷凍干燥機將透析后的樣品凍干。將凍干的載Dox納米顆粒稱重，并以1 ∶1的體積比溶解在甲醇和PBS的混合液中。隨后使用酶標(biāo)儀測混合液的吸光度，利用回歸方程計算出NBs包封Dox的量。平均載藥量=包封Dox的量(μg)/凍干的載Dox納米顆粒的重量(mg)。包封率=包封Dox的量(μg)/初始Dox投入的量(μg)×100%。

1.3.5 Dox-NBs體外藥物釋放實驗 分為Dox-NBs組和Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組。分別取等量Dox-NBs樣品加至5 mL置于透析袋中，封口。Dox-NBs組立即放入200 mL PBS容器中，Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組在超聲治療儀作用(參數(shù)設(shè)置：頻率3 MHz，占空比20%，聲強1 W/cm2，輻照時間3 min)后再加入。將容器置于磁力攪拌器上以100 r/min的速度旋轉(zhuǎn)作用。分別于設(shè)定的時間點(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、8 h、11 h、24 h)取容器中透析出的Dox溶液1 mL于小管中，同時補加1 mL的PBS。用酶標(biāo)儀檢測不同時間點所取樣品中Dox含量，計算Dox-NBs的累計釋放百分比，做出累積釋放率-時間曲線圖。

1.3.6 Dox-NBs的體外超聲顯影 將Dox-NBs用PBS按1∶100稀釋，置入瓊脂糖凝膠制成的孔洞模具中，以PBS為空白對照組。用診斷超聲儀(GELOGIQ E9)進(jìn)行超聲造影成像顯影(儀器設(shè)置：9 L探頭，頻率8 MHz，機械指數(shù)0.13，TIS 0.0，增益6 dB)。

2 實驗結(jié)果

2.1 振蕩時間對NBs粒徑大小的影響 粒徑檢測結(jié)果顯示，振蕩時間為45 s 、60 s、90 s制備的NBs平均粒徑分別為(557.69±19.73) nm、(119.20±16.89) nm、(364.00±18.06) nm，三組間平均粒徑比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，振蕩時間為60 s時，制備所得NBs粒徑大小最佳，見圖1。

***P<0.001。

2.2 Dox-NBs的表征 成功制備Dox-NBs，外觀呈紅色濁液，光學(xué)顯微鏡下觀察呈球形，大小形態(tài)分布均勻，無聚集，見圖2。振蕩時間均為60 s的Dox-NBs組與對照組NBs的平均粒徑分別為(286.93±14.45) nm、(119.20±16.89) nm，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)、Zeta電位分別為(-13.30±2.17) mV、(-11.07±1.33) mV，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.056>0.05)，見圖3。血球計數(shù)板計數(shù)Dox-NBs濃度(3.17±2.37)×108個/毫升。

圖2 光鏡 載藥納米泡形態(tài)( ×400)

圖3 Dox-NBs粒徑及Zeta電位分布結(jié)果

2.3 Dox-NBs的平均載藥量、包封率、體外藥物釋放 酶標(biāo)儀阿霉素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.0005x+0.0417，R2=0.9959，測定Dox-NBs中阿霉素的平均載藥量為(45.85±2.17) μg/mg，包封率為(42.40±4.62)%。體外釋放實驗結(jié)果顯示，兩組所有時間點比較累計釋放量差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組在時長為5 h時藥物釋放達(dá)50%以上，單純Dox-NBs組時長為5 h藥物釋放僅為25%左右，經(jīng)24 h釋放至50%左右，見表1。Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組和單純Dox-NBs組3 h內(nèi)的藥物釋放曲線見圖4。

表1 Dox-NBs組、Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組體外阿霉素累積釋放率比較

2.4 Dox-NBs的體外顯影評價 在超聲造影模式下，體外顯影結(jié)果顯示，Dox-NBs組顯示點狀強回聲，分布均勻?？瞻讓φ战M的PBS顯示為無增強的液性暗區(qū)，見圖5。

圖5 超聲造影下載藥納米泡的體外顯影情況

3 討論

穩(wěn)定性能是載藥超聲納米泡發(fā)揮作用的重要影響因素。超聲納米泡的制備處方不同，其穩(wěn)定性不同[7-9]。目前納米泡的制備多為脂質(zhì)類外殼，其生物相容性良好，回聲強度滿意，但穩(wěn)定性較差[10-11]。因此，

與Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組比較，*P<0.05，***P<0.001。

本研究在脂質(zhì)類外殼基礎(chǔ)上嘗試通過添加Pluronic 124、NNDEA來提高超聲納米泡的穩(wěn)定性。Zeta電位結(jié)果提示，制備的空白NBs和Dox-NBs在PBS溶液中均有較好的穩(wěn)定性。表面活性劑Pluronic是一類兩親性高分子材料，可在脂質(zhì)材料之間排列構(gòu)成外殼。脂質(zhì)殼流動性在一定程度上與脂質(zhì)類納米泡的穩(wěn)定性和回聲性質(zhì)相關(guān)，Pluronic則通過改變脂質(zhì)堆積結(jié)構(gòu)及增加外膜流動性降低納米泡表面張力[12-13]。同時，本研究添加的NNDEA可與Pluronic組成的膠束互穿交聯(lián)形成更為穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[14]，從而保持納米泡不被破壞。體外釋放實驗中，在模擬體內(nèi)血流循環(huán)條件下，沒經(jīng)超聲治療儀作用的Dox-NBs藥物釋放曲線平緩，藥物釋放到50%需時間較長，提示Dox-NBs可較好保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，沒有外力加促納米泡破裂的情況下，其裝載的藥物釋放緩慢，有利于下一步藥物的定點定位釋放研究，這與PERERA R H等[15]研究一致。穩(wěn)定性良好的Dox-NBs體外超聲顯影結(jié)果顯示呈點狀均勻強回聲，效果良好，為后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)腫瘤診療實驗提供了良好基礎(chǔ)。

超聲觸發(fā)藥物遞送系統(tǒng)是目前腫瘤診療研究中的熱點及研究方向。利用腫瘤增強的滲透和滯留效應(yīng)，以及多數(shù)腫瘤內(nèi)皮間隙可擴大至380～780 nm[16]，因此粒徑在此范圍內(nèi)的超聲納米泡可穿過血管抵達(dá)腫瘤血管外間質(zhì)，實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞顯像，還可通過裝載藥物、基因、連接靶點等形成功能化超聲納米泡，實現(xiàn)靶向治療。由此可見，除了納米泡的穩(wěn)定性以外，粒徑大小是影響靶向超聲分子成像的另一關(guān)鍵因素。超聲納米泡通過高速振蕩使微泡分裂產(chǎn)生[17]，因此，這過程中的振蕩參數(shù)對粒徑大小的影響至關(guān)重要。振蕩程度不夠，微泡不足以分裂產(chǎn)生納米泡；振蕩程度過度，使產(chǎn)生的納米泡破裂融合，粒徑會增加，所以振蕩參數(shù)的設(shè)置非常關(guān)鍵。本實驗中采用的是高速水平往復(fù)式振蕩，振蕩頻率與振蕩幅度相對恒定，因此需對振蕩時間的3組設(shè)定參數(shù)進(jìn)行篩選。3組樣品粒徑結(jié)果顯示，振蕩時間為60 s時粒徑最佳。本實驗制備的Dox-NBs平均粒徑為(286.93±14.45) nm，呈單峰分布，分散度好，粒徑范圍窄，大小形態(tài)均勻，無聚集，完全能實現(xiàn)穿越血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙實現(xiàn)血管外顯像的能力。

近年來，已有較多研究利用載藥超聲納米泡降低阿霉素的毒副作用[18-20]。本實驗中制備的Dox-NBs平均載藥量與包封率實驗結(jié)果與NITTAYACHARN P等[21-23]研究結(jié)果相近。體外阿霉素釋放實驗顯示，Dox-NBs聯(lián)合超聲治療儀組前24 h阿霉素累計釋放量高于Dox-NBs組。表明本實驗制備的載藥超聲納米泡可有效包裹藥物，聯(lián)合超聲輻射作用，可實現(xiàn)腫瘤部位的藥物定點定位釋放，有望發(fā)揮腫瘤精準(zhǔn)治療作用，提高在腫瘤部位的藥物濃度，減少全身毒副作用。

綜上所述，本實驗成功制備了一種粒徑小、穩(wěn)定性好、體外顯像效果良好的載阿霉素超聲納米泡，為后續(xù)開展體內(nèi)腫瘤超聲分子精準(zhǔn)治療提供了實驗依據(jù)。