邱錦鳴，劉 哲，吳佳佳，薛陳杰，劉雪梅

（淮陰工學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 淮安 223003）

貧營養(yǎng)微生物又稱為寡營養(yǎng)微生物，能夠在土壤、湖泊河水、地下水、沙表土等有機(jī)質(zhì)匱乏的環(huán)境中生長［1］。將貧營養(yǎng)微生物從環(huán)境中分離提純出來，用于自來水工藝中低濃度溶解性污染物的去除，這是近年來在給水處理領(lǐng)域形成的一個新思路［2，3］。

研究表明，自來水深度處理工藝中存在自然條件下形成的菌落，其對水質(zhì)提升具有積極作用，但自然形成菌落世代周期長，凈水效率低［4］。通過人工篩選的優(yōu)勢菌群投放可顯著縮短生物掛膜過程，并有針對性地對靶向污染指標(biāo)實(shí)施高效凈化。當(dāng)前中國的集中式飲用水水源地微污染形勢十分嚴(yán)峻，自來水廠對溶解性污染物去除率亟待提高，積極研發(fā)貧營養(yǎng)凈水微生物制劑，將實(shí)驗(yàn)室成果盡快產(chǎn)業(yè)化具有重要而迫切的現(xiàn)實(shí)意義［5，6］。

微囊化技術(shù)可以通過一定的理化手段將益生菌包裹在微小且封閉的膠囊中，不僅能在加工或貯藏過程中提高菌株的有效活菌數(shù)，還能在不利環(huán)境中對菌株進(jìn)行保護(hù)，提高其抗性［7，8］。由于Ca2＋-藻酸鹽凝膠的安全和無毒性質(zhì)，是最常用的微囊化壁材［9］。本研究利用淮陰工學(xué)院凈水微生物制劑研發(fā)課題組前期篩選出的兼性貧營養(yǎng)凈水碳源微生物菌株，將多菌株復(fù)配，采用乳化法制備微生物制劑，并研究其在微污染水體中的凈化效果。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

復(fù)配兼性貧營養(yǎng)菌株包括變形桿菌（Proteus）、短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）和蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus），由淮陰工學(xué)院凈水微生物制劑研發(fā)課題組優(yōu)選并經(jīng)16S RNA 進(jìn)行基因測序鑒定；MRS 培養(yǎng)基，宜興市永信生物有限公司；其他試劑均為分析純，由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KBS 型），上海申安醫(yī)療器械廠；高速冷凍大容量離心機(jī)（ST16R型），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；超凈工作臺（SW-CJ-1D 型），蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；TOC 測定儀（M5310C 型），蘇伊士水務(wù)技術(shù)（上海）有限公司；紫外分光光度計(jì)（752 型），上海美析儀器有限公司；激光粒度分析儀（MS-2000 型），英國馬爾文儀器有限公司；掃描電鏡（Hitachi 型），日立科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的配制 將保藏在冰箱中的菌種在固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，挑選單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，在振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。4 ℃、4 000 r/min 離心15 min 分離菌懸液。菌泥用0.9%生理鹽水懸浮后，4 ℃、4 000 r/min離心15 min，洗滌2 次，用生理鹽水懸浮細(xì)胞，將濃縮菌液濃度調(diào)節(jié)至1010CFU/mL，4 ℃冰箱保存。

1.2.2 乳化法制備微膠囊 采用外源乳化法，將菌懸液、滅菌的海藻酸鈉溶液（30 mg/mL）和含有（2 μL/mL）Tween-80 的植物油按照2∶3∶25（V/V）的比例混合，按200 r/min 對混合液進(jìn)行攪拌，待乳化完全后，加入100 mL 滅菌CaCl2溶液（20 mg/mL），繼續(xù)攪拌20 min。350 r/min 離心5 min，4 ℃條件下收集微膠囊，用滅菌生理鹽水清洗2 次除去殘余的CaCl2。將微膠囊放入-20 ℃冰箱中預(yù)凍2 h 后，置于-40 ℃，5.9 Pa 真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h，得到微膠囊凍干粉。

1.2.3 微膠囊理化性質(zhì)表征

1）外觀形貌測定。將樣品均勻分散在無水乙醇介質(zhì)中，取少量分散液滴在超薄碳膜上，待乙醇揮發(fā)后，在200 kV 電子加速電壓下進(jìn)行測試。

2）粒徑分析。以去離子水為分散介質(zhì)，對微膠囊的粒徑大小及其分布進(jìn)行測試。

3）微膠囊耐酸堿性的測定。錐形瓶中加入100 mL 去離子水，通過加鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH從2 到12，分別加入原菌懸液和微膠囊，控制原菌懸液中的菌量，使其與微膠囊中含菌量相同。處理2 h后，測其活菌數(shù)并比較其耐酸堿性能力。

4）微膠囊定儲存穩(wěn)定性試驗(yàn)。根據(jù)經(jīng)典恒溫法的指數(shù)理論，將未微膠囊化的菌種和微膠囊化的菌種置于恒溫57 ℃、相對濕度60%～65%條件下儲存7 d，相當(dāng)于室溫下儲存1 年，測其活菌數(shù)的變化。

5）凈水試驗(yàn)。取淮陰工學(xué)院湖水，用脫脂棉過濾，除去湖水中的懸浮物，得到有機(jī)質(zhì)均一的水作為試驗(yàn)用水，每個錐形瓶中平均分裝200 mL。將原菌懸液2 mL 接種到裝有198 mL 湖水的錐形瓶中，投菌量保持在108～109CFU/mL，同時(shí)稱取1 g 的凍干粉投入到裝有200 mL 湖水的錐形瓶中，于28 ℃條件下靜置培養(yǎng)7 d，測定總有機(jī)碳（TOC）的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微膠囊外觀形態(tài)

微膠囊產(chǎn)品為淡黃色粉末，分散性、流動性較好，易溶于水。由圖1 可知，微膠囊大體呈圓球狀，囊壁較平滑，有凹陷。從破碎的微膠囊中看到內(nèi)部包埋的大量細(xì)菌。造成囊壁凹陷的原因可能是由于分子之間的結(jié)合力不同，導(dǎo)致囊膜薄厚程度呈現(xiàn)差異。不同厚度的囊壁抵抗變形能力不同，從而導(dǎo)致在冷凍干燥過程中，薄壁處出現(xiàn)凹槽，從而造成微膠囊表面凹凸不平。

圖1 不同放大倍數(shù)下微膠囊掃描電子顯微鏡（SEM）觀測

2.2 微膠囊粒徑分布測定

粒徑相關(guān)分析測定結(jié)果（圖2）表明，微膠囊的比表面積（SSA）為326 cm2/g，比表面積較小，表明包埋效果較好。微膠囊的粒徑大小為2.512～954.993 μm；d（0.5）（中位徑）為134.272 μm，表明微膠囊中大于和小于134.272 μm 的顆粒各占50%；顆粒分布主要集中在104.713～239.883 μm。微膠囊粒徑分布較寬的原因可能是乳化過程中，攪拌器周邊不同空間范圍的微粒受到的作用力不同所致［10］。

圖2 微膠囊粒徑分布統(tǒng)計(jì)

2.3 微膠囊耐酸堿性的測定

分別在不同pH 的體系中投加菌懸液與微膠囊，保持初始含菌量相同（活菌濃度約為2.2×109CFU/g），2 h 后測定各個體系中的活菌數(shù)。由圖3 可知，在菌懸液體系中，中性條件下（pH 6～8）活菌數(shù)最高；隨著酸性或堿性的增強(qiáng)，活菌數(shù)均顯著下降。微膠囊的活菌數(shù)受pH 變化影響較小，活菌數(shù)始終高于菌懸液中的最高活菌數(shù)。由此可知，微膠囊化明顯增強(qiáng)了菌株的耐酸堿性。

2.4 微膠囊穩(wěn)定性測定

將微膠囊化的菌株和未微膠囊化的菌種在恒溫57 ℃、相對濕度60%～65%條件下儲存7 d，其活菌數(shù)測定結(jié)果如圖4 所示。在恒溫57 ℃條件下儲存7 d后，未微膠囊化的活菌數(shù)降低較快，當(dāng)儲存到5 d 時(shí)已基本檢測不到活菌數(shù)。微膠囊化的活菌數(shù)降低緩慢，儲存7 d 后活菌數(shù)為8.6×108CFU/g，相當(dāng)于在室溫條件下儲存1 年的活菌數(shù)，僅降低了1 個數(shù)量級?？梢?，未微膠囊化的細(xì)菌儲存穩(wěn)定性較差，不利于細(xì)菌的保存；將細(xì)菌微膠囊化，可以有效提高細(xì)菌在常溫下的存活率。

圖4 微膠囊的儲存穩(wěn)定性

2.5 TOC 測定

從圖5 可以看出，菌懸液對水體的TOC 降解速度先快后慢，后期基本趨于緩和，7 d 時(shí)TOC 去除率達(dá)48.82%；微膠囊化的菌種對水體的TOC 降解速度前期比較緩和，中期比較迅速，后期仍然保持較高的去除效率，7 d 時(shí)TOC 去除率達(dá)61.21%。分析原因可能是由于微膠囊化的細(xì)菌前期處于休眠狀態(tài)，需要時(shí)間來恢復(fù)活性；待活性恢復(fù)后，逐步向水體釋放，對水體中的TOC 進(jìn)行降解。由于微膠囊化后，菌株具有緩釋作用，因而能夠持續(xù)地發(fā)揮凈水作用，并且能夠耐受營養(yǎng)元素逐步降低的外部環(huán)境，而未微膠囊化的細(xì)菌可能隨著可利用營養(yǎng)物質(zhì)含量的降低而整體代謝活性降低。因此，微膠囊化有利于細(xì)菌在各種復(fù)雜的條件下保持持續(xù)的高效凈水效率。

圖5 TOC 濃度隨時(shí)間的變化

3 小結(jié)

本試驗(yàn)采用外源乳化法制備了貧營養(yǎng)復(fù)合菌微膠囊制劑。結(jié)果表明，該微生物制劑粒徑分布合理，耐酸堿性及穩(wěn)定性較未膠囊化的菌株明顯提高，可在較低的濃度水平下，實(shí)現(xiàn)對水體TOC 的高效降解，具有良好的應(yīng)用前景。