莊文越，蘇小明，趙鳴瑤，李賀，王春梅，陳建光，李正祎，邱旭東，杜興旭

（北華大學 1.醫(yī)學技術(shù)學院，3.藥學院，5.附屬醫(yī)院，吉林吉林 132013；2.吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗科，吉林長春 130000；4.吉林醫(yī)藥學院檢驗學院，吉林吉林 132013）

黑色素存在于皮膚、頭發(fā)和眼睛中，決定皮膚顏色并保護機體免受紫外線損害，但若過度產(chǎn)生則可導致雀斑、黃褐斑和老年斑等［1］。近年來，中藥提取物因具有高效、低成本和不良反應(yīng)小等優(yōu)點，越來越多地應(yīng)用于美白化妝品之中［2-3］。

安五脂素（anwulignan）是五味子木脂素類成分中具有代表性的單體活性成分，具有抗細胞凋亡［4］、抗氧化［4-5］、抗疲勞［5-6］、抑制血小板聚集［7］和保肝［8］等作用，可通過調(diào)節(jié)核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor-2，Nrf-2）和P38 絲裂原活化蛋白激酶等信號通路參與抗氧化和抗炎等過程［8］。而黑色素的合成與氧化應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)［9-10］，目前尚未見安五脂素影響黑色素生成的報道。因此，本研究以α-黑色素細胞刺激素（α-melanocyte-stimulating hormone，α-MSH）誘導的小鼠黑色素瘤B16F10 細胞為模型，研究其對黑色素生成的影響及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、藥物、主要試劑和儀器

B16F10 細胞，中國科學院細胞庫。安五脂素（純度99.2%，批號：19073005），四川省維克奇生物科技有限公司。MTT，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司；左旋多巴（levodopa，L-DOPA）、NaOH和Triton X-100，上海生物工程有限公司；α-MSH，美國Sigma 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量和活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平測定試劑盒，南京建成生物工程研究所；兔抗小鼠Nrf-2、血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）和β 肌動蛋白單抗（一抗）及辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 多抗（二抗），武漢ABclonal 公司；RNA 提取試劑盒、HiScriptⅡQ RT SuperMix for qPCR 和2 x ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，美國Vazyme公司。全自動凝膠成像系統(tǒng)和Image J分析軟件，上海天能科技有限公司。

1.2 MTT法檢測B16F10細胞存活率

B16F10 細胞生長至對數(shù)生長期時，消化重懸，按照每孔5000 細胞（200 μL）加入96 孔板中。37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄培養(yǎng)基，加入安五脂素0，1.25，2.5，5，10，20，40 和80 μmol·L-1。孵育48 h 后，加入MTT 溶液20 μL，4 h后棄上清，加入DMSO 150 μL，室溫搖動10 min，490 nm 處測定吸光度值（A490nm）。每組設(shè)3 復孔，實驗重復3 次。細胞存活率（%）=給藥組A490nm/細胞對照組A490nm×100%。

1.3 細胞培養(yǎng)、分組和處理

取B16F10 細胞于25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，接種密度為1×109L-1。加5 mL 含10% 胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至約80%，用PBS 洗1 次，加入0.25%EDTA-胰蛋白酶1 mL，于37℃細胞培養(yǎng)箱中消化2 min，按1∶2 比例傳代。實驗分為細胞對照組、α-MSH模型組和模型+安五脂素5，10和20 μmol·L-1組。細胞對照組加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，模型組加入α-MSH 300 nmol·L-1［11］，模型+安五脂素組同時加α-MSH 300 nmol·L-1和不同濃度安五脂素。每組設(shè)3復孔，培養(yǎng)48 h。

1.4 NaOH裂解法檢測B16F10細胞黑色素含量

將細胞以1×108L-1接種于6孔板中，每孔2 mL培養(yǎng)24 h。按1.3 分組處理并收集細胞，加入含10% DMSO 的NaOH 1 mol·L-1溶液1 mL，80℃水浴1 h。取溶液200 μL 加入96 孔板中，測定A405nm。實驗重復3次。

1.5 L-DOPA 氧化速率法測定B16F10 細胞酪氨酸酶活性

按1.3 處理細胞，用預冷的PBS 洗滌后加入1 mL 1% Triton X-100 裂解，快速置-80℃冰箱中30 min，室溫下解凍約20 min?；靹蚝笕?00 μL于96 孔板中，加入100 μLL-DOPA 2 μmol·L-1混勻。37℃孵育1 h，測定A475nm。實驗重復3次。

1.6 WST-1 法檢測B16F10 細胞SOD 活性和MDA水平及化學熒光法檢測ROS水平

按1.3 用安五脂素處理細胞，按試劑盒說明書操作，檢測細胞SOD活性及MDA和ROS水平。

1.7 RT-qPCR檢測B16F10細胞HO-1基因mRNA表達水平

按1.3 處理細胞48 h，據(jù)RNA 提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。測定A260nm和A280nm評價RNA質(zhì)量。以RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA。按ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 試劑盒說明書進行實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（real time-quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）。反應(yīng)總體積20 μL，包括SYBR qPCR 混合液10 μL，引物（10 μmol·L-1）0.4 μL，cDNA 1 μg，無RNA 酶水補充至20 μL。HO-1基因序列在NCBI 查找，用Primer premier 6.0 軟件進行引物設(shè)計。β 肌動蛋白引物序列為上游：GGCTGTATTCCCCTCCATCG，下游：CCAGTTGGTAACAATGCCATGT；HO-1引物序列為上游：TGACACCAAGGACCAGAG，下游：AAGGACCCATCGGAGAAG。條件為：95℃30 s，95℃10 s 和60℃30 s（40個循環(huán)），95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s。制備熔解曲線，采用2-△△Ct表示HO-1mRNA相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測Nrf-2和HO-1蛋白表達水平

取1.3 處理細胞，用PBS 洗滌2 次，用含1%苯甲磺酰氟和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液在冰浴條件裂解細胞60 min，4℃9419×g離心5 min，分離上清液獲得總蛋白。用BCA 試劑盒進行蛋白質(zhì)定量。用10%十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，并與一抗（抗HO-1 單抗：1∶1000；抗β 肌動蛋白單抗：1∶2000）孵育過夜。用含吐溫-80的Tris緩沖液（TBS-T）洗滌，再與二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h；TBS-T洗滌，最后用增強型ECL顯影液顯色，用全自動凝膠成像系統(tǒng)采集蛋白條帶，Image J分析其積分吸光度值。用目標蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 安五脂素對B16F10細胞存活率的影響

如圖1 所示，與細胞對照組相比，安五脂素濃度＜20 μmol·L-1對B16F10 細胞存活率無顯著影響。因此選擇安五脂素5，10 和20 μmol·L-1進行后續(xù)實驗。

2.2 安五脂素對α-MSH 誘導的B16F10 細胞黑色素含量的影響

如圖2 所示，與細胞對照組相比，模型組B16F10細胞黑色素含量顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+安五脂素5 μmol·L-1組細胞黑色素含量無明顯變化，10和20 μmol·L-1組顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.3 安五脂素對α-MSH 誘導的B16F10細胞酪氨酸酶活性的影響

如圖3所示，與細胞對照組相比，模型組酪氨酸酶活性顯著升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+安五脂素10 和20 μmol·L-1組酪氨酸酶活性顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 安五脂素對α-MSH 誘導的B16F10 細胞SOD活性及MDA和ROS水平的影響

如圖4 和圖5 所示，與細胞對照組相比，模型組B16F10細胞SOD活性降低（P＜0.01），MDA和ROS水平升高（P＜0.01）。與模型組相比，模型+安五脂素3 個濃度組SOD 活性均升高（P＜0.05，P＜0.01），MDA和ROS水平明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

2.5 安五脂素對α-MSH 誘導的B16F10 細胞Nrf-2蛋白及下游HO-1 mRNA和蛋白表達的影響

如圖6A所示，與細胞對照組相比，模型組HO-1mRNA 表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+安五脂素5，10 和20 μmol·L-1組HO-1mRNA表達水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。如圖6B所示，與細胞對照組相比，模型組HO-1 和Nrf-2 蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；與模型組相比，模型+安五脂素20 μmol·L-1組HO-1 蛋白表達水平明顯增加（P＜0.01），模型+安五脂素5，10 和20 μmol·L-1組Nrf-2蛋白表達均明顯增加（P＜0.01）。

3 討論

α-MSH 作為促黑色素生產(chǎn)激素，可使B16F10細胞酪氨酸酶活性增強，黑色素生成增多。因此，選擇合適濃度的α-MSH 可作為誘導劑刺激黑色素分泌，建立色素沉著模型以研究藥物的美白作用［11-13］。本研究結(jié)果顯示，安五脂素在濃度＜20 μmol·L-1時對細胞無明顯毒性作用，故采用安五脂素5，10和20 μmol·L-1進行后續(xù)實驗。

酪氨酸酶是黑色素合成的限速酶，因此阻斷或抑制黑色素形成過程中酪氨酸酶活性即可有效抑制黑色素生成。本研究結(jié)果顯示，B16F10 細胞經(jīng)α-MSH誘導后，細胞黑色素含量和酪氨酸酶活性明顯增加，表明α-MSH誘導的黑色素高表達細胞模型制備成功。安五脂素10 和20 μmol·L-1顯著抑制α-MSH誘導的B16F10 酪氨酸酶活性，減少黑色素生成。

黑色素的生成過程受多方面調(diào)控，包括黑色素小體轉(zhuǎn)運［14］、自噬［15］和氧化應(yīng)激［12］等。據(jù)報道，在α-MSH 促進黑色素合成的同時，大量自由基可在L-3，4-二羥苯丙氨酸的氧化還原反應(yīng)過程中生成［16］，且α-MSH 誘導黑色素生成與ROS 的產(chǎn)生有關(guān)［17］。SOD不僅能有效清除體內(nèi)氧自由基，還可抑制酪氨酸酶的活性，通過清除超氧陰離子維持細胞氧化還原穩(wěn)態(tài)，從而減少活性氧對細胞的損傷，具有減輕色素沉著的作用［18-19］。許多研究報道了多種抗氧化劑，如沒食子酸［20］、姜黃素［21］和抗壞血酸［22］等具有抗黑色素生成的作用。本研究結(jié)果表明，安五脂素可抑制α-MSH 誘導的B16F10 細胞ROS 生成，降低MDA 水平，提高關(guān)鍵抗氧化酶SOD活性。

Nrf-2/HO-1 信號通路是主要抗氧化應(yīng)激的通路之一，在抗ROS 生成和氧化應(yīng)激中發(fā)揮重要作用。Nrf2 與其負性調(diào)節(jié)因子Keap1 解離后進入細胞核，上調(diào)其下游抗氧化基因HO-1的轉(zhuǎn)錄表達，維持體內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)［23］。已有研究報道，安五脂素具有抗炎和抗氧化作用，可有效激活Nrf-2 信號通路發(fā)揮抗氧化作用［5-6］。本研究結(jié)果表明，安五脂素能上調(diào)α-MSH 誘導的B16F10細胞Nrf2表達，且增加其下游HO-1表達。

上述結(jié)果表明，安五脂素可能通過抗氧化作用抑制黑色素合成，其機制亦可能與其抑制Nrf-2 信號通路有關(guān)。