李錦濤，楊 涵，陳 洋，焦 宸，湯浩宇，何 健，黃 星

降解多菌靈和啶蟲脒殘留的復(fù)合菌劑研發(fā)及初步應(yīng)用①

李錦濤，楊 涵，陳 洋，焦 宸，湯浩宇，何 健，黃 星*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

針對(duì)菜田土壤中多菌靈和啶蟲脒的殘留問題，以多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2作為材料，進(jìn)行降解菌劑的復(fù)配，研究了使用復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥殘留土壤的修復(fù)效果及微生態(tài)效應(yīng)。研究結(jié)果表明：①復(fù)配降解菌株djl-6與D-2的最適體積比為5∶3，復(fù)合降解菌劑在3 d內(nèi)對(duì)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中50 μg/ml的多菌靈降解率為87.14%，對(duì)50 μg/ml的啶蟲脒降解率為96.10%。②初始接種量為7% 時(shí)，復(fù)合降解菌劑可在6 d內(nèi)將復(fù)合農(nóng)藥污染土壤中5 mg/kg多菌靈降解74.40%，將5 mg/kg啶蟲脒降解95.87%。土壤含水率為25% 時(shí)，復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥污染土壤中5 mg/kg多菌靈的降解率為80.80%，對(duì)5 mg/kg啶蟲脒的降解率為97.87%。③復(fù)合農(nóng)藥污染土壤中10 mg/kg多菌靈和10 mg/kg啶蟲脒即可對(duì)小青菜的生長產(chǎn)生明顯的藥害，小青菜生長24 d時(shí)根長僅為空白對(duì)照的66.56%、莖葉長為58.35%、鮮重為45.13%。在7% 的接種量條件下，復(fù)合降解菌劑可解除藥害，使小青菜的生長指標(biāo)恢復(fù)至對(duì)照水平。④多菌靈和啶蟲脒殘留造成土壤細(xì)菌群落的Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)降低，均與濃度呈正相關(guān)，接入復(fù)合降解菌劑后各指數(shù)均提高?？梢姡搹?fù)合降解菌劑具有較好的應(yīng)用前景。

多菌靈降解菌djl-6；啶蟲脒降解菌D-2；復(fù)合降解菌劑

設(shè)施栽培是提高蔬菜產(chǎn)量的有效途徑，可以解決我國蔬菜淡季的短缺問題，但因其種植密度高、濕度大、溫度高等特點(diǎn)，致使病蟲害多發(fā)，導(dǎo)致農(nóng)藥的使用頻次高，施用量大[1-2]。大量農(nóng)藥殘留沉積在土壤中會(huì)破壞微生物的生存環(huán)境，降低土壤中微生物的總量，折損土壤的肥力[3-4]。殺菌劑多菌靈和啶蟲脒因其高效低毒的特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于設(shè)施農(nóng)業(yè)中，但同樣也面臨著嚴(yán)重的殘留問題亟待解決，土壤中多菌靈和啶蟲脒殘留主要的降解途徑是微生物代謝[5-7]。

以高效降解菌株為材料，開發(fā)微生物菌劑用于修復(fù)農(nóng)藥殘留污染是一種公認(rèn)安全有效的方法[8-10]。菜地土壤農(nóng)藥殘留量大、殘留種類多，針對(duì)該問題組合不同功能的菌株，功能互補(bǔ)，優(yōu)化得到比單一菌株降解效果更好、更穩(wěn)定的微生物復(fù)合菌劑成為目前主要的研究和應(yīng)用方向[11-13]。研究表明，微生物菌劑施用得當(dāng)可以改善土壤的理化性質(zhì)，增加細(xì)菌群落豐富度和多樣性[14]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2為材料[15]，進(jìn)行降解菌劑的復(fù)配，確定復(fù)合降解菌劑的最適配比，并在此基礎(chǔ)上分別探究接種量及土壤含水率對(duì)復(fù)合降解菌劑降解效果的影響，以及復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥殘留土壤的修復(fù)效果及其微生態(tài)效應(yīng)，以期為菜地多菌靈和啶蟲脒土壤污染修復(fù)提供修復(fù)制劑及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)試劑及培養(yǎng)基

啶蟲脒(純度98.3%)原藥購自綠源制藥，多菌靈(純度99.8%)原藥購自江蘇新沂農(nóng)藥廠。無機(jī)鹽培養(yǎng)基：硝酸銨 1.0 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，磷酸氫二鉀 1.5 g/L，氯化鈉1.0 g/L，七水硫酸鎂 0.2 g/L，pH 7.0。LB培養(yǎng)基：酵母浸出物5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5.0 g/L，pH 7.0。D-2發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖9 g/L，硫酸銨0.9 g/L，酵母膏0.3 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣1 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，pH 7.0 ～ 7.2。djl-6發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖8 g/L，硫酸銨0.8 g/L，酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.1 g/L，碳酸鈣0.5 g/L，磷酸氫二鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂0.1 g/L，pH 7.0 ～ 7.2。

1.2 供試菌株、作物與土壤

供試多菌靈降解菌株djl-6和啶蟲脒降解菌株D-2，由本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏；供試作物選用上海青，購自南陽青青種業(yè)；供試土壤為黃棕壤，采集于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)牌樓實(shí)驗(yàn)基地。供試土壤基本理化性質(zhì)：pH 6.91，全氮 0.85 g/kg，全磷 0.32 g/kg，全鉀 1.41 g/kg，有機(jī)質(zhì)15.12 g/kg。

1.3 培養(yǎng)基中降解菌的最適接種量及復(fù)配比例確定

分別挑取菌株djl-6和菌株D-2的單菌落于液體LB培養(yǎng)基試管中，置于30℃搖床以160 r/min培養(yǎng)至菌株對(duì)數(shù)生長期。按照1% 的接種量將菌株分別接入裝有1 000 ml各自發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶中，培養(yǎng)至菌株對(duì)數(shù)生長期，使用無菌水進(jìn)行重懸至OD600約0.8左右(活菌數(shù)大約108cfu/ml)。將菌株djl-6的發(fā)酵液以0.5%、1%、3%、5%、7% 的接種量分別加入到多菌靈濃度為50 mg/L的100 ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)，于72 h時(shí)取樣，通過高效液相色譜(HPLC)測(cè)定樣品中多菌靈的濃度，并計(jì)算降解率。同時(shí)，將菌株D-2的發(fā)酵液以0.5%、1%、3%、5%、7% 的接種量分別加入到啶蟲脒濃度為50 mg/L的100 ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)，于72 h時(shí)取樣，通過高效液相色譜法測(cè)定樣品中啶蟲脒的濃度，并計(jì)算降解率。由上述試驗(yàn)分別確定菌劑djl-6和菌劑D-2的最適接種量，以接種量比例(體積比)將菌株djl-6的發(fā)酵液和菌株D-2的發(fā)酵液混合接種到多菌靈和啶蟲脒濃度均為50 mg/L的100 ml無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，30℃、160 r/min培養(yǎng)，于72 h時(shí)取樣，通過HPLC測(cè)定樣品中多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計(jì)算降解率。

1.4 多菌靈和啶蟲脒的提取及HPLC檢測(cè)條件

多菌靈和啶蟲脒的提?。涸诖郎y(cè)樣品中加入等體積的二氯甲烷充分振蕩萃取，去除上層廢液，下層有機(jī)相加入適量無水硫酸鈉后，取1.5 ml于離心管中置于通風(fēng)櫥中吹干，待揮發(fā)完全后加入300 μl甲醇(色譜純)溶解，經(jīng)有機(jī)相濾器(孔徑為0.22 μm)過濾后，用HPLC測(cè)定樣品中多菌靈和啶蟲脒的含量。

HPLC檢測(cè)條件：儀器型號(hào)為Dionex UltiMate 3000，色譜柱為C18反相色譜柱，規(guī)格為250 mm× 4.6 mm×5 μm，流動(dòng)相為甲醇∶水(60∶40，/)，柱溫為40℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量為20 μl，多菌靈檢測(cè)波長為240 nm和280 nm，啶蟲脒檢測(cè)波長為235 nm和260 nm。

1.5 接種量對(duì)土壤中復(fù)合降解菌劑降解效果的影響

向供試土壤中同時(shí)加入多菌靈和啶蟲脒的水溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆?，使土壤中多菌靈和啶蟲脒最終濃度為5 mg/kg。按1%、3%、5%、7% 和9% 的接種量將復(fù)合降解菌劑接入含100 g土壤的避光塑料杯中，調(diào)節(jié)土壤含水率為20%，以不加菌劑的土壤為對(duì)照組，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，并置于光照培養(yǎng)箱(26 ℃、16 h光照和20℃、8 h黑暗為一個(gè)周期)中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天進(jìn)行稱重，通過補(bǔ)水來保持土壤的含水率，并且每3 d取一次土樣，使用HPLC檢測(cè)多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計(jì)算其降解率。

1.6 土壤含水率對(duì)復(fù)合降解菌劑降解效果的影響

將復(fù)合降解菌劑以1.5節(jié)中確定的最適接種量接種至含土壤100 g的避光塑料杯中，調(diào)節(jié)土壤含水率為10%、15%、20%、25% 和30%，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，置于光照培養(yǎng)箱(26℃、16 h光照和20℃、8 h黑暗為一個(gè)周期)中培養(yǎng)。培養(yǎng)過程中，每天進(jìn)行稱重，通過補(bǔ)水來保持土壤的含水率，并且每3 d取一次土樣，使用HPLC檢測(cè)多菌靈和啶蟲脒的濃度，并計(jì)算其降解率。

1.7 復(fù)合降解菌劑對(duì)小青菜生長的修復(fù)與促進(jìn)作用

設(shè)置土壤中復(fù)合農(nóng)藥殘留濃度分別為10 mg/kg (多菌靈和啶蟲脒濃度均為10 mg/kg)和50 mg/kg(多菌靈和啶蟲脒濃度均為50 mg/kg)，復(fù)合降解菌劑的接種量為7%，進(jìn)行以下6組處理：空白對(duì)照組(CK)、添加復(fù)合降解菌劑(J)、添加復(fù)合農(nóng)藥殘留10 mg/kg (Y)、添加復(fù)合農(nóng)藥殘留10 mg/kg和復(fù)合降解菌劑(JY)、添加復(fù)合農(nóng)藥殘留50 mg/kg(Y5)、添加復(fù)合農(nóng)藥殘留50 mg/kg和復(fù)合降解菌劑(JY5)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。供試小青菜種子消毒、萌發(fā)后，播種在盆缽中，在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中進(jìn)行試驗(yàn)。在24 d時(shí)取樣，對(duì)各處理盆缽中的小青菜隨機(jī)取樣，對(duì)莖葉長度、根系長度和鮮重等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)量。

1.8 復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥殘留污染土壤修復(fù)的微生態(tài)效應(yīng)

作物根際微生物對(duì)植物的生長和群落演替起重要的作用，根際土壤中微生物的群落結(jié)構(gòu)對(duì)于了解添加農(nóng)藥殘留和添加外源微生物對(duì)環(huán)境的影響具有重要意義。本試驗(yàn)分別對(duì)1.7節(jié)中6組處理的小青菜根際土(24 d時(shí))進(jìn)行測(cè)序分析(北京諾禾致源科技股份有限公司)。包括對(duì)有效數(shù)據(jù)進(jìn)行OTU(operational taxonomic units)物種分類分析，根據(jù)OTU分析結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU做物種注釋，得到對(duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況；對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性分析，得到樣品均勻度、物種豐富度、組內(nèi)和組間樣品多樣性差異等信息。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

利用Microsoft Excel?軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，采用IBM SPSS statistical Ver. 25.0 software進(jìn)行方差分析。將IonS5TMXL下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)barcode序列區(qū)分為各個(gè)樣本的數(shù)據(jù)，然后進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)。對(duì)所有樣本的Effective Tags以97% 的一致性(Identity)進(jìn)行OTU聚類，用Mothur方法與SILVA132的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋分析，獲得物種分類學(xué)信息并分別在門水平和屬水平統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Alpha多樣性指數(shù)，包括Observed species指數(shù)、Chao1 指數(shù)、Shannon指數(shù)和ACE指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基中降解菌的最適接種量及復(fù)配比例

由圖1可知，接種量為5% 時(shí)，菌劑djl-6能夠在72 h內(nèi)降解88.00% 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中濃度為50 mg/L的多菌靈。接種量為3% 時(shí)，菌劑D-2能夠在72 h內(nèi)降解96.89% 無機(jī)鹽培養(yǎng)基中濃度為50 mg/L的啶蟲脒。將菌劑djl-6的發(fā)酵液和菌劑D-2的發(fā)酵液以體積比為5∶3混合制成復(fù)合降解菌劑，以7% 的接種量接入啶蟲脒與多菌靈的濃度均為50 mg/L的無機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，在72 h內(nèi)多菌靈的降解率達(dá)到87.14%，啶蟲脒的降解率達(dá)到96.10%。

(圖中小寫字母不同表示處理間差異顯著(P<0.05))

2.2 接種量對(duì)土壤中復(fù)合降解菌劑降解效果的影響

由圖2可知，較高的接種量更有利于復(fù)合降解菌劑對(duì)多菌靈和啶蟲脒的降解。多菌靈和啶蟲脒的降解率和復(fù)合降解菌劑的起始接種量呈正相關(guān)。在光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，接種量越大，起始降解率越高；當(dāng)接種量大于7% 時(shí)，受底物濃度的限制，降解效果基本一致。在培養(yǎng)6 d時(shí)，以7%、9% 的接種量接入復(fù)合降解菌劑的試驗(yàn)組對(duì)5 mg/kg啶蟲脒的降解率已經(jīng)接近最高值；在培養(yǎng)9 d時(shí)，除了接種量為1% 的試驗(yàn)組，其余試驗(yàn)組對(duì)5 mg/kg多菌靈的降解率均已達(dá)到最高值。

圖2 復(fù)合菌劑不同接種量對(duì)復(fù)合農(nóng)藥降解的影響

2.3 土壤含水率對(duì)復(fù)合降解菌劑降解效果的影響

圖3的結(jié)果表明，較高的土壤含水率更有利于復(fù)合降解菌劑對(duì)多菌靈和啶蟲脒的降解。多菌靈和啶蟲脒的降解率與土壤含水率呈正相關(guān)。在光照培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)時(shí)，土壤含水率越大，起始降解率越高。在培養(yǎng)12 d時(shí)，土壤含水率大于25% 時(shí)，多菌靈的降解率達(dá)94.71%，同時(shí)趨于穩(wěn)定；土壤含水率為20% 時(shí)，啶蟲脒的降解率基本達(dá)到最高；土壤含水率低于25% 時(shí)，復(fù)合降解菌劑對(duì)啶蟲脒的降解效果優(yōu)于對(duì)多菌靈的降解效果。

圖3 土壤含水率對(duì)復(fù)合降解菌劑降解復(fù)合農(nóng)藥的影響

2.4 不同處理?xiàng)l件下小青菜的生長情況

由表1可知，多菌靈和啶蟲脒的復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)小青菜的生長產(chǎn)生明顯的藥害且與濃度呈正相關(guān)，導(dǎo)致小青菜的根系長度、莖葉長度和鮮物質(zhì)量的生理指標(biāo)都遠(yuǎn)低于CK，添加50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留處理(Y5)的小青菜根長僅為CK的30.10%、莖葉長僅為CK的43.30%，鮮物質(zhì)量僅為CK的31.94%。復(fù)合降解菌劑可以有效降解多菌靈和啶蟲脒復(fù)合農(nóng)藥殘留，修復(fù)復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)小青菜產(chǎn)生的藥害，添加10 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留和復(fù)合降解菌劑處理(JY)的小青菜生長指標(biāo)基本達(dá)到CK水平，添加50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留和復(fù)合降解菌劑處理(JY5)的小青菜各生長指標(biāo)相較于Y5處理提高1倍以上。

表1 不同處理?xiàng)l件下小青菜的生長指標(biāo)

注：表中數(shù)據(jù)后小寫字母不同表示處理間差異顯著(<0.05)。

2.5 復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥殘留污染土壤修復(fù)的微生態(tài)效應(yīng)

本試驗(yàn)通過IonS5TMXL 平臺(tái)對(duì)各處理樣本中的16S V3 ～ V4 區(qū)域進(jìn)行PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，下機(jī)數(shù)據(jù)根據(jù)barcode 序列對(duì)各個(gè)樣本數(shù)據(jù)進(jìn)行區(qū)分、過濾，獲得有效數(shù)據(jù)。對(duì)不同樣本在97% 一致性閾值下的Alpha 多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(均一化時(shí)選取的數(shù)據(jù)量：cutoff=28 239)。

Alpha多樣性主要關(guān)注的是單個(gè)樣本下物種的多樣性，也被稱為生境內(nèi)的多樣性，是反映豐富度和多樣性的綜合指標(biāo)。Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)用來反映群落的豐富度，即樣本中所含OUT數(shù)目，指數(shù)越大，群落豐富度越高。Shannon指數(shù)用來反映群落的多樣性，即群落中個(gè)體分配上的均勻性，其中Shannon值越大，說明群落多樣性越高。Observed species指數(shù)代表OTU的直觀數(shù)量統(tǒng)計(jì)，表示該樣品中含有的物種數(shù)目。Good coverage指數(shù)是反映測(cè)序深度的指標(biāo)，其值越接近于1，說明測(cè)序深度越合理，即該深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種；反之，測(cè)序深度不高，許多物種僅被測(cè)到了一次，暗示著很多低豐度物種可能尚未被測(cè)序測(cè)到。由表2可知，各處理樣品Good coverage指數(shù)均大于0.95，本試驗(yàn)測(cè)序深度合理，基本覆蓋到樣品中所有的物種。相較于CK，不同處理的Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)、Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)的變化具有一致性。在添加復(fù)合降解菌劑處理中，各指數(shù)均顯著高于CK。添加復(fù)合農(nóng)藥的各處理相比于CK均降低，且復(fù)合農(nóng)藥的濃度越高抑制作用越明顯。JY處理與CK基本持平，而JY5處理則低于CK，但也高于Y5處理。綜上，復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)土壤群落的物種數(shù)目、豐富度和多樣性具有抑制作用且與濃度呈正相關(guān)，而接入復(fù)合降解菌劑能夠在很大程度上減輕抑制作用，使其恢復(fù)至正常狀態(tài)。

表2 不同處理?xiàng)l件下根際土壤中細(xì)菌的Alpha多樣性指數(shù)

各處理土壤中細(xì)菌在門水平物種相對(duì)豐度如圖4所示，由高到低分別是Proteobacteria(變形菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)。相較CK，Proteobacteria相對(duì)豐度在其他處理中均降低，但在添加復(fù)合農(nóng)藥殘留的處理中尤為明顯。Actinobacteria相對(duì)豐度在各個(gè)處理中基本保持穩(wěn)定。Acidobacteria相對(duì)豐度在所有添加復(fù)合農(nóng)藥殘留的處理中均表現(xiàn)為升高。Bacteroidetes相對(duì)豐度在添加10 mg/kg和50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留處理中呈現(xiàn)顯著提高。CK處理中(紅球菌屬)相對(duì)豐度為0.085%、(嗜染料菌屬)相對(duì)豐度為0.004%，接入復(fù)合降解菌劑處理中相對(duì)豐度為7.822%、相對(duì)豐度為1.286%。

3 討論

微生物復(fù)合菌劑相較于單一菌劑有明顯優(yōu)勢(shì)，競(jìng)爭(zhēng)力較強(qiáng)，接種后可迅速成為優(yōu)勢(shì)菌群，提高對(duì)目標(biāo)污染物的降解能力[16]。復(fù)合菌劑的制備需要充分了解菌株的生物學(xué)特性，將菌種進(jìn)行科學(xué)、合理的復(fù)配，發(fā)揮復(fù)合菌劑菌群間的互惠、協(xié)同、共生等作用，以避免競(jìng)爭(zhēng)或拮抗的發(fā)生[17]。本試驗(yàn)先分別確定培養(yǎng)基中菌劑djl-6和菌劑D-2的最適接種量，以接種量體積比配置復(fù)合菌劑再加以驗(yàn)證，最終確定復(fù)合菌劑的復(fù)配比例為體積比5∶3。復(fù)合降解菌劑可在3 d內(nèi)將無機(jī)鹽培養(yǎng)基中復(fù)合農(nóng)藥殘留中的50 mg/kg的多菌靈降解87.14%，將50 mg/kg的啶蟲脒降解96.10%?？梢?，復(fù)合降解菌劑對(duì)復(fù)合農(nóng)藥殘留的降解效果達(dá)到了單一菌劑的水平，滿足開展后續(xù)試驗(yàn)的條件。

圖4 不同處理?xiàng)l件下細(xì)菌門水平相對(duì)豐度

本試驗(yàn)結(jié)果表明，多菌靈和啶蟲脒的降解率與復(fù)合降解菌劑的起始接種量和土壤含水率呈正相關(guān)，當(dāng)接種量大于7% 或含水率高于25% 時(shí)，受底物濃度限制，降解效果基本一致。同時(shí)土壤含水率低于25% 時(shí)，復(fù)合降解菌劑對(duì)啶蟲脒的降解效果優(yōu)于對(duì)多菌靈的降解效果。研究表明，土壤含水率對(duì)多菌靈和啶蟲脒的降解具有不同的影響，在一定的土壤含水率范圍內(nèi)，隨著含水率升高，多菌靈在土壤中的降解速度加快，而土壤濕度為20% 和80% 時(shí)，啶蟲脒降解速率無明顯差異[18-19]。復(fù)合降解菌劑的接種量是田間施用時(shí)的重要指標(biāo)，接種量過小會(huì)導(dǎo)致菌株生長延滯期延長，降解效果差。而接種量過大一方面增加生產(chǎn)成本造成浪費(fèi)，另一方面可能影響土壤菌群群落結(jié)構(gòu)，消耗營養(yǎng)物質(zhì)而降低土壤肥力[20]。綜合考量復(fù)合降解菌劑的降解效果、田間的環(huán)境條件以及在實(shí)際應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)效益，本研究認(rèn)為7% 為復(fù)合降解菌劑的最佳接種量，同時(shí)在復(fù)合降解菌劑施用期間應(yīng)保持土壤含水率不低于25%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合降解菌劑可以有效降解多菌靈和啶蟲脒復(fù)合農(nóng)藥殘留，修復(fù)復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)小青菜產(chǎn)生的藥害，添加10 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留和復(fù)合降解菌劑處理組小青菜的生長指標(biāo)基本達(dá)到對(duì)照組水平，添加50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留和復(fù)合降解菌劑處理組的小青菜各生長指標(biāo)相較于添加50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留處理均大幅提高。土壤的生物肥力指土壤中的微生物等有機(jī)體為作物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)和理化條件做出的貢獻(xiàn)，長期大量施用農(nóng)藥會(huì)對(duì)土壤肥力產(chǎn)生損害，施用微生物菌劑是維持和提高土壤肥力的有效手段[21]。

微生物種群的多樣性和豐富度是其實(shí)現(xiàn)土壤物質(zhì)循環(huán)和養(yǎng)分轉(zhuǎn)化等功能的基礎(chǔ)，也是維持土壤肥力的保障。研究表明，土壤微生物量與土壤的肥力狀況存在顯著相關(guān)性[22]，土壤微生物群落豐富度和多樣性對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中作物的抗病性起到重要作用[23]。微生物菌劑的施用會(huì)在一定程度上提高土壤細(xì)菌種群多樣性，豐富細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)土壤群落的物種數(shù)目、豐富度和多樣性具有顯著的抑制作用且與農(nóng)藥殘留的濃度呈正相關(guān)，而接入復(fù)合降解菌劑不僅能夠使其恢復(fù)至正常狀態(tài)，且有明顯的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，Proteobacteria(變形菌門)相對(duì)豐度在所有處理中均降低，但在添加復(fù)合農(nóng)藥殘留的處理中尤為明顯，推測(cè)可能的原因是復(fù)合降解菌劑接種后與其產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，同時(shí)復(fù)合農(nóng)藥殘留對(duì)Proteobacteria也有一定的抑制效果。Acidobacteria(酸桿菌門)和Bacteroidetes (擬桿菌門)相對(duì)豐度在添加10 mg/kg和50 mg/kg復(fù)合農(nóng)藥殘留處理中呈現(xiàn)顯著提高。

本研究提供了一種降解能力可靠、具備實(shí)際開發(fā)價(jià)值的復(fù)合農(nóng)藥殘留降解菌劑，為復(fù)合農(nóng)藥殘留的降解以及復(fù)合降解菌劑的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。但是也存在一定的局限性，如未開展田間試驗(yàn)，同時(shí)復(fù)合菌劑菌群與土壤菌群間的互作及其在根際土壤的定殖還有待進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

復(fù)合降解菌劑中菌株djl-6與D-2的最適體積比為5∶3，其在3 d內(nèi)對(duì)無機(jī)鹽培養(yǎng)基中50 μg/ml的多菌靈降解率為87.14%，對(duì)50 μg/ml的啶蟲脒降解率為96.10%。復(fù)合降解菌劑的最佳接種量為7%，菌劑施用期間土壤含水率應(yīng)保持在25% 以上。復(fù)合降解菌劑可有效修復(fù)多菌靈和啶蟲脒殘留對(duì)小青菜的藥害，同時(shí)對(duì)小青菜有顯著的促生作用。施加復(fù)合降解菌劑可有效提高土壤微生物種群的多樣性和豐富度，進(jìn)而提高土壤的肥力。

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Development and Preliminary Application of Compound Bacterial Agent for Degrading Carbendazim and Acetamiprid Residues

LI Jintao, YANG Han, CHEN Yang, JIAO Chen, TANG Haoyu, HE Jian, HUANG Xing*

(College of Life Science, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In order to solve carbendazim and acetamiprid residues in vegetable soil, carbendazim degradation straindjl-6 and acetamiprid degradation strainD-2 were used as materials to study the remediation effect and microecological effect of compound degradation bacteria on compound pesticide residue soil. The results show that:1) The optimum volume ratio of compound degradation strain djl-6︰D-2 is 5︰3, and the degradation rates of carbendazim and acetamiprid are 85.46% and 94.36% for 50 μg/ml respectively within 3 days. 2) When the initial inoculation amount is 7%, the degradation rates of 5 mg/kg carbendazim and acetamiprid in compound pesticide contaminated soil are 74.40% and 95.87% respectively within 6 days. When soil water content is 25%, the degradation rates of 5 mg/kg carbendazim and 5 mg/kg acetamiprid in soil contaminated by compound pesticides are 80.80% and 97.87%, respectively. 3) Soil contaminated by 10 mg/kg carbendazim and 10 mg/kg acetamiprid (compound pesticides) cause obvious drug damage to the growth of green vegetables. After growing for 24 days, the root length, stem and leaf length and fresh weight of green vegetables are only 66.56%, 58.35% and 45.13% of those of the blank control. Under the condition of 7% inoculation, the compound degradation bacteria can relieve the drug damage, and the growth index of green vegetables is consistent with that of the control. 4) Carbendazim and acetamiprid residues have significant inhibitory effects on Observed species index, Shannon index, Chao1 index and ACE index of soil bacterial community, which are positively correlated with the concentrations of carbendazim and acetamiprid. In conclusion, the compound degradation bacterial agent has a broad application prospect.

Carbendazim-degrading strain djl-6; Acetamiprid-degrading strain D-2; Compound degradation agents

X172

A

10.13758/j.cnki.tr.2022.03.027

李錦濤, 楊涵, 陳洋, 等. 降解多菌靈和啶蟲脒殘留的復(fù)合菌劑研發(fā)及初步應(yīng)用. 土壤, 2022, 54(3): 646–652.

中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)項(xiàng)目 (KYZZ2022001)和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目(CX(18)1005)資助。

(huangxing@njau.edu.cn)

李錦濤(1998—)，男，安徽阜陽人，碩士研究生，主要從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail: 2020816122@stu.njau.edu.cn