李澤娜，劉 暢，吳乾峰，王 福，陳鴻平，劉友平

（成都中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，四川 成都 611130）

杜仲為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv. 的干燥樹皮，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，有補肝腎、強筋骨、安胎之效［1］，被譽為“植物黃金”。有研究表明，杜仲的藥效成分主要為木脂素類、環(huán)烯醚萜類、酚酸類、黃酮類及多糖等，具有降壓、降糖、降脂、抗骨質(zhì)疏松、抗病毒等多種藥理作用［2］，是臨床上治療高血壓的良藥。

產(chǎn)地加工方法是保證中藥材質(zhì)量的重要環(huán)節(jié)。杜仲傳統(tǒng)產(chǎn)地加工方法為堆置“發(fā)汗”［1］；《本草經(jīng)集注》［3］記載“杜仲采后陰干”；《中華本草》［4］中要求杜仲須經(jīng)沸水燙泡，再堆置“發(fā)汗”。杜仲“發(fā)汗”后的化學(xué)成分、藥效會發(fā)生改變。由于部分產(chǎn)地選擇陰干處理，且杜仲加工方法多樣，導(dǎo)致藥材質(zhì)量參差不齊，可能影響其臨床療效。杜仲所含化學(xué)成分豐富，已分離鑒定的化學(xué)成分有200多種，然而關(guān)于杜仲產(chǎn)地加工方法的研究主要為靶向性研究，僅關(guān)注某一個或某一類成分［5-7］，如松脂醇二葡萄糖苷、綠原酸、桃葉珊瑚苷、總黃酮。對杜仲干燥前后以及不同加工干燥方法下整體成分的比較研究鮮有報道。

目前，文獻常用液相色譜、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用等技術(shù)對杜仲及相關(guān)制劑化學(xué)成分進行定性定量研究［8-9］，但檢測到的成分較少，難以全面反映杜仲的整體代謝產(chǎn)物。代謝組學(xué)是一門新學(xué)科，主要研究生物體或細胞受外界環(huán)境干擾后低分子量代謝產(chǎn)物種類和數(shù)量的變化［10］。近年來，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）代謝組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，可對樣本中所有代謝物進行全面覆蓋檢測，相比于傳統(tǒng)色譜技術(shù)，在靈敏度、選擇性、動態(tài)范圍等方面具有顯著優(yōu)勢［11］。目前尚未見不同加工干燥方法下杜仲整體代謝產(chǎn)物的差異分析報道。本研究以新鮮杜仲、堆置“發(fā)汗”、燙泡“發(fā)汗”、陰干杜仲為研究對象，采用UPLC-MS/MS代謝組學(xué)技術(shù)，對杜仲的代謝產(chǎn)物進行全面分析，并采用主成分分析（PCA）、正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）篩選差異代謝物，考察其在不同加工干燥方法杜仲中的相對含量，為深入研究杜仲藥材的品質(zhì)形成機制及確定杜仲適宜的產(chǎn)地加工方法提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與樣品

Nexera X2 型超高效液相色譜（日本Shimadzu）和4500 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜（美國Applied Biosystem）；LGJ-22型冷凍干燥機（北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司）；ME04E電子分析天平（捷久計量衡器（上海）有限公司）；MM 400 型研磨儀（德國Retsch）；5427R 型離心機、Research plus 單道移液槍（德國Eppendorf）。甲醇、乙腈（色譜級，Merck）；甲酸（色譜級，Aladdin）。

實驗所用樣品購自四川省廣元市旺蒼縣正源鄉(xiāng)深溪村，采集時間為2021年5月24日，采用環(huán)剝技術(shù)剝皮后，趁鮮貨運至成都中醫(yī)藥大學(xué)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定系嚴(yán)鑄云教授鑒定為杜仲科植物杜仲（Eucommia ulmoidesOliv.）。

1.2 樣品處理

取新鮮杜仲分別進行以下處理：（1）新鮮杜仲：取杜仲新鮮樹皮，刮去外表面粗皮，于-80 ℃冰箱中保存，編號XP。（2）堆置“發(fā)汗”：取杜仲新鮮樹皮，使內(nèi)表面層相對，層層堆疊，堆置高度為80 cm，“發(fā)汗”至內(nèi)表面呈紫褐色（7 d），取出曬干即得，編號DP。（3）燙泡“發(fā)汗”：取杜仲新鮮樹皮，于沸水中燙泡2 min，使內(nèi)表面層相對，層層堆疊，堆置高度為80 cm，“發(fā)汗”至內(nèi)表面呈紫褐色（7 d），取出曬干即得，編號TP。（4）陰干：取杜仲新鮮樹皮，使內(nèi)表面朝上，于陰涼通風(fēng)處晾干即得，編號YP。

1.3 供試品溶液的制備

將杜仲藥材置于冷凍干燥機中干燥，研磨至粉末狀。取100 mg粉末，加1.2 mL 70%甲醇溶解，經(jīng)6次渦旋提取后置于4 ℃冰箱，過夜后取樣品溶液于12 000 r/min離心10 min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，用于進樣分析。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件 Agilent SB-C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm），流動相為0.1%甲酸水（A）-0.1%甲酸乙腈（B），梯度洗脫：0～9 min，5%～95%B；9～10 min，95%B；10～11 min，95%～5%B；11～14 min，5%B。柱溫40 ℃，進樣量4μL，流速0.35 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），溫度為550 ℃，正負離子切換模式掃描，離子源電壓分別為5 500、4 500 V，離子源氣體Ⅰ（GS Ⅰ）、氣體Ⅱ（GS Ⅱ）和簾氣（CUR）分別為3.45×105、4.14×105、1.72×105Pa，碰撞誘導(dǎo)電離參數(shù)設(shè)置為高。采用MRM模式，通過進一步優(yōu)化去簇電壓（DP）和碰撞能（CE）進行檢測。

1.5 定性定量分析

基于色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測得到的一級、二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)，結(jié)合自建數(shù)據(jù)庫Metware Database（MWDB）和公共數(shù)據(jù)庫Human Metabolome Database（HMDB）、MassBank、KNAPSAcK、METLIN、MoTo DB 中代謝物信息，實現(xiàn)定性分析。過程中排除了同位素信號，含K+、Na+、NH+4以及大分子物質(zhì)的碎片離子重復(fù)信號的干擾。

基于三重四極桿質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）對樣本中的所有色譜峰進行峰面積積分，并對不同樣本中的相同代謝物進行峰面積積分校正，實現(xiàn)定量分析。

1.6 多元統(tǒng)計分析

將代謝物原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Analyst 1.6.3（AB Sciex）軟件中對色譜峰進行峰提取、峰對齊、峰積分、歸一化等處理，采用R 軟件對處理后的數(shù)據(jù)進行PCA 和OPLS-DA 分析。根據(jù)單變量差異倍數(shù)值（FC）≥2或≤0.5，即log2FC ≥1或≤-1，結(jié)合OPLS-DA獲得的變量重要性投影值（VIP）≥1篩選差異代謝物。

2 結(jié)果與討論

2.1 數(shù)據(jù)質(zhì)控樣本的適用性評價

質(zhì)控樣本（QC）由實驗樣本的提取液等量混合制得，是進行高質(zhì)量代謝組學(xué)研究的基礎(chǔ)。以負離子模式為例，質(zhì)控樣品質(zhì)譜檢測TIC 重疊圖和樣品MRM 代謝物檢測多峰圖如圖1A、1B 所示，結(jié)果表明儀器檢測及代謝物提取具有良好的穩(wěn)定性和可靠性。

圖1 QC樣品質(zhì)譜檢測TIC重疊圖（A）和MRM模式下代謝物的多峰圖（B）Fig.1 TIC overlap mass spectrometry of QC sample（A）and multi peak diagram of metabolite detected in MRM mode（B）

2.2 PCA及OPLS-DA分析

PCA 是代謝組學(xué)數(shù)據(jù)中的常用方法，主要通過降維手段將相關(guān)變量重新組合成一系列不相關(guān)的變量，以方差大、殘差小的主成分反映原變量的信息［12］?；赨PLC-MS/MS 檢測平臺和自建數(shù)據(jù)庫，在正、負離子模式下共檢測到420 個代謝物，采用無監(jiān)督模式識別的PCA 進行分析，結(jié)果見圖2。PCA共篩選到3 個主成分PC1、PC2、PC3，方差貢獻率分別為31.75%、22.52%和13.01%，累計方差貢獻率達67.28%。由圖可見，DP、TP、YP 和XP 4 個組可明顯區(qū)分，且無相互交叉重疊現(xiàn)象，說明DP、TP、YP和XP 4個組的代謝物有顯著差異。

圖2 不同加工干燥方法杜仲代謝物PCA圖Fig.2 PCA diagram of Eucommiae Cortex metabolites with different processing and drying methods

OPLS-DA 是一種有監(jiān)督模式識別的分析方法，可去除不相關(guān)變量的影響，實現(xiàn)不同組間差異代謝物的篩選［13］。Q2是評價OPLS-DA 模型的參數(shù)，反映模型的預(yù)測能力，通常以Q2＞0.5 為宜，越接近1 效果越佳。本研究通過建立成對比較組OPLS-DA 模型篩選差異代謝物，相關(guān)參數(shù)見表1。結(jié)果顯示各比較組的Q2值均大于0.5，說明模型具有一定的可靠性，預(yù)測信度良好，可用于差異代謝物的分析。

表1 OPLS-DA模型相關(guān)參數(shù)Table 1 Relevant parameters of OPLS-DA model

2.3 差異代謝物的篩選

2.3.1 新鮮杜仲與不同加工干燥方法杜仲的比較研究 采用VIP 值和log2FC 值對新鮮杜仲與分別采用3 種方法干燥的杜仲的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果見圖3。圖中一個點表示一個代謝物，紅色的點表示log2FC ≥1 且VIP ≥1，即上調(diào)（Up）；綠色的點表示log2FC ≤-1 且VIP ≥1，即下調(diào)（Down）；灰色點表示差異不明顯的代謝物（Insignificant）。火山圖顯示，在DP 與XP 之間有173 種差異代謝物（149種上調(diào)，24 種下調(diào)；圖3A），TP 與XP 之間有171 種（130 種上調(diào)，41 種下調(diào)；圖3B），在YP 與XP之間有175 種（152 種上調(diào)，23 種下調(diào)；圖3C）。結(jié)果說明杜仲在加工干燥過程中超過80%的代謝物均呈上調(diào)表達趨勢。研究表明，加工干燥過程中的溫度、含水量變化會打破藥用植物內(nèi)正常代謝及生理生化過程的穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)與次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)酶的表達，從而促進次生代謝產(chǎn)物的生成［14］。

取DP與XP組、TP與XP組、YP與XP組的差異代謝物，繪制韋恩圖，如圖3D所示，共得到127種共有差異代謝物，說明DP、TP、YP與XP相比，代謝物差異較大，與PCA分析結(jié)果一致。

圖3 新鮮杜仲與不同加工干燥方法杜仲的火山圖（A～C）與韋恩圖（D）Fig.3 Volcano diagrams（A-C）and Venn diagram（D）of fresh Eucommiae Cortex and Eucommiae Cortex with different processing and drying methods

2.3.2 不同加工干燥方法杜仲的比較研究 對3種不同加工方法進行兩兩成對比較，繪制火山圖。在DP與TP之間有118種差異代謝物（75種上調(diào)，43種下調(diào)；圖4A），DP與YP之間有86種（48種上調(diào)，38種下調(diào)；圖4B），YP 與TP 之間有80 種（50 種上調(diào)，30 種下調(diào)；圖4C）。在DP 與TP 組，DP 與YP 組，YP與TP組中上調(diào)代謝物數(shù)量均高于下調(diào)代謝物，說明堆置“發(fā)汗”過程有利于杜仲中次生代謝產(chǎn)物的積累。取DP 與TP 組、DP 與YP 組、YP 與TP 組差異代謝物的交集（圖4D），僅篩選到9 種共有差異代謝物，說明DP、TP、YP代謝物差異較大。

圖4 不同加工干燥方法杜仲的火山圖（A～C）與韋恩圖（D）Fig.4 Volcano diagrams（A-C）and Venn diagram（B）of Eucommiae Cortex with different processing and drying methods

2.3.3 部分代謝物的相對含量分析 本研究表明，不同加工干燥方法對杜仲次生代謝產(chǎn)物具有顯著影響。表2為相對含量變化顯著的部分代謝物，其相對含量結(jié)果以均值表示（n=3）。

木脂素和香豆素是一類含有一個或幾個C6～C3單位的天然化合物，是杜仲的主要活性成分。表2的9種木脂素和香豆素類成分中，丁香樹脂酚-4'-O-（6''-乙酰）葡萄糖苷在TP 組含量較低，原因可能與沸水燙泡過程影響該成分轉(zhuǎn)化所需酶活性及其溶解性有關(guān)；其余8種代謝物含量均在XP組最低，說明杜仲加工干燥后大部分木脂素和香豆素類均發(fā)生轉(zhuǎn)化，含量增加，推測其為杜仲采后加工干燥脅迫誘導(dǎo)的產(chǎn)物［14］。在TP、YP 與DP 組之間，除7-羥基香豆素外，其余8 種代謝物相對含量均以DP 組最高，究其原因，可能是堆置過程使植物組織中的細胞呼吸加快，溫度升高，促進了酶促或非酶促反應(yīng)的發(fā)生，有利于成分的合成［15］。而7-羥基香豆素作為香豆素類成分的基本母核，在酶的作用下會生成其它香豆素類，表明其含量會受下游產(chǎn)物的影響，在3 種加工干燥方法之間，堆置“發(fā)汗”的溫濕度更適宜酶的生存［16］，故DP組的7-羥基香豆素轉(zhuǎn)化較多，造成含量偏低。研究表明，香豆素和木脂素同為苯丙素類化合物，其生物合成途徑及前體物質(zhì)基本一致［17］，DP組的木脂素類成分含量較高，相對的，其香豆素類成分含量則有所降低。這也是引起DP組7-羥基香豆素含量偏低的原因之一。

酚酸是一類含有酚羥基和羧基的次生代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，極易發(fā)生分解轉(zhuǎn)化。不同干燥方法對丹參［18］、益母草［19］、金銀花［20］中酚酸的影響結(jié)果均表明溫度和氧氣是影響酚酸類成分變化的重要原因，溫度越低，氧分壓越低，越有利于酚酸類成分的保留。但本研究中XP 組的酚酸類成分含量較低，推測是由于新鮮杜仲中酚酸積累較少，在干燥脫水的過程中，隨著水分的散失，細胞受到脅迫，酚酸在某種機制作用下轉(zhuǎn)變成游離態(tài)或大量積累，但具體機制有待進一步研究［21］。在3 種加工干燥方法中有17種變化明顯的酚酸類，其中3-O-對香豆?？鼘幩岬?種在YP組最高，提示陰干可促進酚酸類成分含量的提升。陰干是在自然環(huán)境中干燥，相較于其他2 種方法，溫度相對更低，故能有效地保留酚酸類成分。但脫氫雙松柏醇、丁香酸等5 種成分含量在DP 組最高，3，4，5-三咖啡?？鼘幩岬? 種成分含量在TP組最高?？赡苁且驗槎阎眠^程激活了多酚氧化酶、過氧化物酶活性，導(dǎo)致酚酸類成分發(fā)生氧化；也可能是溫度引起酚酸類成分發(fā)生分解、脫羥基反應(yīng)等［22］。

環(huán)烯醚萜類是臭蟻二醛的縮醛衍生物，性質(zhì)活潑，易受溫度、酶、pH 值的影響，發(fā)生氧化、開環(huán)、聚合、轉(zhuǎn)化等反應(yīng)。表2展示了12種差異明顯的環(huán)烯醚萜類代謝物，其中有1種環(huán)烯醚萜類在XP組較高，7種在DP組較高，1種在YP組較高，3種在TP組較高，提示堆置“發(fā)汗”有利于環(huán)烯醚萜類成分的保留。分析原因，可能是陰干時可與氧氣充分接觸，使得萜類成分發(fā)生氧化作用造成含量降低［23］，而沸水高溫會破壞成分結(jié)構(gòu)和酶活性，且后期“發(fā)汗”導(dǎo)致微生物重新滋生，引起萜類成分反應(yīng)［24］。

杜仲中的主要活性成分有木脂素類、酚酸類、萜類，本研究僅對這3 大類成分的變化規(guī)律進行了探討。結(jié)果發(fā)現(xiàn)除3類主要成分外，在加工過程中還伴隨生物堿、黃酮及醌類等成分的變化，如表2所示，篩選的1個黃酮類成分在TP 組中含量較高，說明燙泡“發(fā)汗”有利于黃酮類成分的積累；篩選的1 個醌類成分在DP 組中含量較高，說明堆置“發(fā)汗”有利于醌類成分的積累；而篩選的7 個生物堿類成分中有5個在XP組中含量較高，說明絕大多數(shù)生物堿在杜仲鮮皮中含量較高。

表2 不同加工干燥方法杜仲的部分代謝物信息（n=3）Table 2 Partial metabolites information of Eucommiae Cortex with different processing and drying methods（n=3）

（續(xù)表2）

3 結(jié) 論

本文建立了UPLC-MS/MS代謝組學(xué)分析方法，對不同加工干燥方法下杜仲的差異代謝物及其變化規(guī)律進行比較研究。結(jié)果顯示，新鮮杜仲經(jīng)加工干燥后，代謝物含量顯著增加，不同加工干燥方法對杜仲代謝物的影響規(guī)律不同。整體而言，堆置“發(fā)汗”上調(diào)代謝物數(shù)量較多；對不同類別代謝物而言，堆置“發(fā)汗”有利于木脂素和香豆素類、環(huán)烯醚萜類、醌類成分的保留，陰干有利于酚酸類成分的保留，燙泡“發(fā)汗”有利于黃酮類成分的保留。研究結(jié)果表明，杜仲加工方法以堆置“發(fā)汗”較為適宜。本實驗結(jié)果為杜仲加工方法的確定及杜仲品質(zhì)形成機制研究提供了依據(jù)。酶活性差異是引起代謝物含量變化的主要原因，后續(xù)將考慮研究“發(fā)汗”過程中的關(guān)鍵酶，探討代謝物變化與酶活性的相關(guān)性，以期闡釋杜仲的“發(fā)汗”機制。