劉靜靜 劉曉蕊 李琳 王盈 楊海元 戴一凡

（南京醫(yī)科大學(xué)江蘇省異種移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 211166）

自閉癥是一種嚴(yán)重的神經(jīng)發(fā)育疾病，臨床表現(xiàn)為社會(huì)交往障礙、語(yǔ)言交流障礙和刻板重復(fù)的行為方式［1］。自閉癥致殘率較高，且患病率有逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但尚未開發(fā)出特異性的治療藥物，給患者和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)。自閉癥病因和發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，目前受到關(guān)注最多的是催產(chǎn)素系統(tǒng)假說。催產(chǎn)素是一種具有高度保守結(jié)構(gòu)的神經(jīng)肽，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明它與情感反應(yīng)和社會(huì)認(rèn)知等社會(huì)行為有關(guān)。催產(chǎn)素的生理作用是通過其唯一的受體OXTR來(lái)介導(dǎo)的。人類催產(chǎn)素受體（OXTR）屬于I類G蛋白偶聯(lián)受體，位于3p25-3p26.2，由3個(gè)內(nèi)含子和4個(gè)外顯子組成［2］。催產(chǎn)素受體分布在杏仁核、紋狀體、海馬等調(diào)節(jié)社會(huì)認(rèn)知的重要區(qū)域［3-4］。OXTR基因變異可引起大腦結(jié)構(gòu)改變并與社會(huì)行為相關(guān)聯(lián)，如下丘腦和杏仁核的病變以及社交缺陷等［5-8］。研究表明OXTR基因變異與自閉癥存在相關(guān)性，但催產(chǎn)素受體影響自閉癥的分子機(jī)制還不明確。

OXTR基因敲除的動(dòng)物模型是揭示OXTR生理功能的重要工具。目前，已有OXTR基因敲除的小鼠、斑馬魚被用于自閉癥相關(guān)行為缺陷的研究［9-10］，但它們存在社交信號(hào)（發(fā)聲、面部表情）和大腦活動(dòng)模式有限等缺陷［11］。選擇更理想的自閉癥動(dòng)物模型顯得尤為迫切。豬和人生理特征和解剖結(jié)構(gòu)更為相近，基因組大小相近、基因數(shù)量和結(jié)構(gòu)類似［12-13］。豬大腦回旋類似于人的新皮質(zhì)且它們灰質(zhì)和白質(zhì)的分布相似［14-15］。此外，豬的快速繁殖期（性成熟5-6個(gè)月）和大窩產(chǎn)仔數(shù)（平均7-8頭仔豬），在構(gòu)建人類疾病模型方面比非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有明顯優(yōu)勢(shì)。然而，目前還未見OXTR基因敲除豬報(bào)道，限制了在豬上開展關(guān)于OXTR對(duì)于社會(huì)認(rèn)知影響的實(shí)驗(yàn)研究。

近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的不斷發(fā)展極大推動(dòng)了創(chuàng)建基因編輯豬疾病模型的研究［16-17］。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建OXTR基因敲除的巴馬公豬PFFs細(xì)胞系，為構(gòu)建OXTR基因編輯豬模型進(jìn)而深入研究遺傳性自閉癥的發(fā)病機(jī)制和防治策略奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原代巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞由本組實(shí)驗(yàn)室提取培養(yǎng)。DH5α感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司，pX330質(zhì)粒（Addgene 42230）、Bbs I限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶均購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs 公司，細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自德國(guó)Lonza公司，DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、G418藥物均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 人/豬OXTR的同源性分析 通過NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找并下載人和豬等多個(gè)物種的OXTR的氨基酸序列，利用MEGA-X軟件中鄰接法（neighbor-joining method）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，自展分析1 000次用于檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)化樹的穩(wěn)定性。在線工具 iTOL（https://itol.embl.de/）進(jìn)一步繪制系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 人/豬OXTR的結(jié)構(gòu)分析 采用DNAMAN軟件、DNASTAR軟件對(duì)人/豬OXTR的一級(jí)、二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，使用BLAST中的Global Align程序計(jì)算一致性和相似性，Chou-Fasman算法預(yù)測(cè)人/豬OXTR的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角的比例。接著利用Swiss Model在 線 工 具（https://www.swissmodel.expasy.org/）對(duì)人/豬OXTR三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行建模，采用PyMOL軟件比較兩者蛋白結(jié)構(gòu)的相似度。

1.2.3 豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域的鑒別 利用NCBI當(dāng)中的CD-search工具搜索鑒定豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域。輸入豬OXTR氨基酸序列，同時(shí)在右方OPTIONS中選擇數(shù)據(jù)庫(kù)選擇具有保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)（conserved domain database，CCD庫(kù)），提交完成后搜索匹配結(jié)果。

1.2.4 sgRNA靶點(diǎn)設(shè)計(jì) 根據(jù)GenBank中公布的豬的OXTR基因序列（NC_010455.5），設(shè)計(jì)引物（表1），并提取巴馬豬PFFs基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序驗(yàn)證是否與公布的基因序列相符。利用在線工具CRISPOR（http://crispor.tefor.net/）針對(duì)第2外顯子區(qū)篩選關(guān)鍵靶向位點(diǎn)，設(shè)計(jì)Oligo合成。

表1 OXTR基因exon 2序列擴(kuò)增引物Table 1 Amplification primers for exon 2 sequene of OXTR gene

1.2.5 CRISPR/Cas9打靶載體構(gòu)建 用T4 DNA連接酶將Oligo退火形成的雙鏈二聚體與Bbs I酶切的pX330骨架質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，均勻涂布于Ampicillin抗性的LB瓊脂培養(yǎng)板上。挑取單菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，擴(kuò)增鑒定連接成功的菌液，并用質(zhì)粒抽提試劑盒提取。

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇凍存的野生型巴馬豬原代PFFs，用細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底90%左右轉(zhuǎn)染。利用核轉(zhuǎn)染儀將打靶載體1 μg及Neomycin抗性質(zhì)粒（由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建）2 μg共轉(zhuǎn)染至野生型PFFs，核轉(zhuǎn)染程序設(shè)定U-023。

1.2.7 單細(xì)胞克隆的篩選與鑒定 轉(zhuǎn)染24 h后，用含有G418藥物的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)10 d左右，可見G418抗性單細(xì)胞克隆形成。用克隆環(huán)挑選狀態(tài)佳的單克隆，轉(zhuǎn)移至24孔板。第2天用含G418的培養(yǎng)液培養(yǎng)，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底，胰酶消化并傳代至12孔板，待12孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿后，即可凍存?zhèn)溆?；遺留在24孔板中的細(xì)胞長(zhǎng)滿后用NP40裂解，裂解程序60℃，60 min；95℃，10 min，以裂解產(chǎn)物為模板PCR，并將產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序鑒定。

2 結(jié)果

2.1 人/豬OXTR生物信息學(xué)分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，豬的OXTR進(jìn)化距離與人接近（圖1）。經(jīng)DNAMAN比對(duì)分析，人/豬OXTR氨基酸序列高度一致（一致性/Identity=91%；相似性/similarity=93%）（圖2-A）。利用DNASTAR軟件Protein模塊中對(duì)人和豬OXTR的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，Chou-Fasman算法預(yù)測(cè)人OXTR的α螺旋占30.3%，β折疊占40.6%，β轉(zhuǎn)角占21.6%，豬OXTR的α螺旋占42.2%，β折疊占37.7%，β轉(zhuǎn)角占19.3%（圖2-B）。人和豬OXTR具有相似排布和占比的α螺旋、β折疊、β轉(zhuǎn)角。而人和豬OXTR三維建模顯示也具有極高相似度的三維空間排列，RMSD值為0.009（圖2-C）。以上生物信息學(xué)分析表明，人/豬OXTR序列和結(jié)構(gòu)具有高度的同源一致性，推測(cè)人/豬OXTR具有相似的生物學(xué)功能。

圖1 不同物種OXTR序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree of OXTR sequences of different species

圖2 人/豬OXTR的一級(jí)、二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Analysis of primary，secondary，and tertiary structures of OXTR between humans and pigs

2.2 豬OXTR關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的鑒別和靶點(diǎn)區(qū)域的選擇

在CD-search的CDD分析中，鑒別出豬OXTR的7個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域，分別是41-67，74-101，112-142，152-173，197-226，270-300，310-335間的氨基酸殘基（圖3）。研究發(fā)現(xiàn)，人類OXTR的7個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域中，第2-5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域與底物的相互作用有關(guān)，其中第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域還與受體的激活相關(guān)［18］。豬OXTR的第2-5個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域由豬OXTR的第2外顯子編碼。因此，本研究選擇豬OXTR的第2外顯子作為敲除的靶點(diǎn)位置。

圖3 豬OXTR關(guān)鍵殘基和結(jié)構(gòu)域的鑒別Fig. 3 Identification of domains and key residues of porcine OXTR

2.3 CRISPR/Cas9打靶載體的構(gòu)建

針對(duì)巴馬豬OXTR基因第2外顯子序列，設(shè)計(jì)了2對(duì)sgRNA oligos（表2、圖4-A）。測(cè)序結(jié)果顯示，Oligo退火形成的雙鏈sgRNA-1、sgRNA-2成功插入線性化的pX330骨架質(zhì)粒中（圖4-B-D），并用試劑盒成功提取打靶載體質(zhì)粒。

圖4 OXTR基因靶點(diǎn)和重組載體測(cè)序Fig.4 Target of OXTR gene and sequencing of recombinant vectors

表2 OXTR基因靶向位點(diǎn)的sgRNA寡核苷酸序列Table 2 Oligonucleotide sequences of sgRNAs at OXTR targeting sites

2.4 OXTR基因敲除細(xì)胞系的鑒定

將靶向豬OXTR的CRISPR/Cas9質(zhì)粒和Neomycin抗性表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染豬胎兒成纖維細(xì)胞，通過G418（1 mg/mL）篩選，獲得到了抗性的單克隆細(xì)胞系。提取抗性的單克隆細(xì)胞的基因組DNA，PCR擴(kuò)增OXTR靶點(diǎn)區(qū)域片段后進(jìn)行測(cè)序，并與野生型豬OXTR基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示共獲得了5個(gè)純合的OXTR雙等位基因敲除的細(xì)胞克隆，其基因型可分為3種類型，在OXTR的靶點(diǎn)區(qū)域產(chǎn)生了411 bp的缺失（mutant type 1），412 bp的缺失（mutant type 2），289 bp的缺失和289 bp的插入（mutant type 3）（圖5，表3）。

表3 OXTR 敲除PFFs的基因型Table 3 Genotypes of OXTR-knockout PFFs

圖5 OXTR敲除PFFs的測(cè)序結(jié)果Fig.5 Sequencing results of OXTR-knockout PFFs

3 討論

自閉癥是一種極其復(fù)雜的疾病，與遺傳、環(huán)境等多種因素密切相關(guān)。雙生子研究證實(shí)遺傳因素是影響自閉癥的重要因素［19］。全基因組測(cè)序確定OXTR基因是自閉癥的候選基因［20］。催產(chǎn)素受體作為神經(jīng)通路的重要環(huán)節(jié)，其異?？赡茉斐杉?xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化，導(dǎo)致神經(jīng)元功能受損，進(jìn)而影響社會(huì)認(rèn)知功能［21］。因此，OXTR基因與自閉癥存在高度相關(guān)性。由于自閉癥涉及多種復(fù)雜的高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)，要為自閉癥研究和治療提供更有利支持，更高級(jí)的OXTR基因敲除動(dòng)物模型非常必要。豬被認(rèn)為是理想的人類疾病動(dòng)物模型，因此，本研究選擇用豬胎兒成纖維細(xì)胞的OXTR基因進(jìn)行編輯。

豬OXTR基因位于第13號(hào)常染色體上，生物信息學(xué)分析提示，豬OXTR基因突變后可能產(chǎn)生和人類似的遺傳效應(yīng)和病理表型。sgRNA原則上可以設(shè)計(jì)在任何外顯子區(qū)域，對(duì)目標(biāo)序列進(jìn)行切割，通過DNA自身修復(fù)機(jī)制引入突變導(dǎo)致基因的敲除。由于在OXTR受體基因的5′上游區(qū)域存在許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這些位點(diǎn)在調(diào)節(jié)受體轉(zhuǎn)錄發(fā)揮主要作用［22］，結(jié)合對(duì)豬OXTR關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域的分析，本研究在第2外顯子選擇靶基因的識(shí)別序列，設(shè)計(jì)并合成sgRNA。CRISPR/Cas9優(yōu)勢(shì)在于操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)周期短、成本低。本課題組已利用此技術(shù)成功構(gòu)建色氨酸羥化酶2（Tph2）基因敲除豬、OSBPL2敲除豬等［23-24］，驗(yàn)證了CRISPR/Cas9技術(shù)在豬基因組修飾上的有效性。我們前期研究中選擇單個(gè)sgRNA進(jìn)行基因打靶，獲得的細(xì)胞克隆多數(shù)為靶點(diǎn)區(qū)域產(chǎn)生小片段插入缺失，且敲除的效率相對(duì)較低［25］。本研究設(shè)計(jì)2個(gè)靶向OXTR的sgRNA進(jìn)行打靶。結(jié)果顯示，5個(gè)OXTR雙等位基因敲除的單細(xì)胞克隆均在預(yù)期的靶點(diǎn)位置發(fā)生了大片段的堿基缺失或插入，確保OXTR蛋白被完全破壞，表明利用2個(gè)sgRNA同時(shí)進(jìn)行基因打靶能夠顯著提高基因敲除的效率。

據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球自閉癥病患病率為6.25%，男性患病率約為女性的4倍。我們推測(cè)OXTR突變的雄性巴馬豬更有可能出現(xiàn)自閉癥的病理表型，因此本研究中我們僅對(duì)雄性的巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)行了OXTR基因的打靶。本研究中獲得的OXTR基因敲除的巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞后續(xù)將用作SCNT（somatic cell nuclear transfer）的核供體細(xì)胞，通過胚胎移植構(gòu)建OXTR敲除巴馬豬疾病動(dòng)物模型。

4 結(jié)論

本研究基于CRISPR/Cas9基因編輯工具在巴馬公豬成纖維細(xì)胞系上高效實(shí)現(xiàn)了OXTR基因的打靶，成功構(gòu)建了OXTR基因敲除的成纖維細(xì)胞系，為建立OXTR敲除的豬模型提供了實(shí)驗(yàn)材料。