艾麗平，張士霞，李 航，張暖暖，張瑋琪 (河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000)

腹腔鏡外科發(fā)展已有120多年的歷史，我國腹腔鏡技術(shù)起步雖晚，但發(fā)展迅速，目前在動物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛。腹腔鏡手術(shù)過程中需要建立CO2氣腹，但隨著人們對腹腔鏡手術(shù)越來越深入的了解，發(fā)現(xiàn)CO2氣腹充氣再放氣的過程會對組織造成缺血再灌注損傷(ischemia /reperfusion injury，I/RI)，影響生理功能。腎臟是機(jī)體供血量最豐富的器官，CO2氣腹對腎臟生理功能影響尤甚。CO2氣腹對大鼠腎臟的損傷機(jī)制復(fù)雜，尚未完全闡明。研究表明，CO2氣腹致腎臟損傷的發(fā)生可能與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[1-3]。氧化應(yīng)激會進(jìn)一步誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，持續(xù)、強(qiáng)烈的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激還可以引起腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡[4-5]。右美托咪定(dexmedetomidine，Dex)是一種新型高選擇性α2受體激動劑，具有鎮(zhèn)靜、抗焦慮等作用，臨床上常被應(yīng)用于麻醉的輔助用藥[6]。大量動物試驗表明Dex有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡作用，可以從多方面起到保護(hù)腎臟的功能[7]。但其對腹腔鏡氣腹所致腎臟損傷的預(yù)防保護(hù)機(jī)制還不是很清楚。為找到減輕氣腹所致的腎缺血再灌注損傷的藥物或治療方法來盡量避免腹腔鏡技術(shù)的缺點，拓展其發(fā)展，使其更好的應(yīng)用于獸醫(yī)臨床。本試驗探究了Dex對CO2氣腹引起的腎臟損傷的保護(hù)作用，并初步闡明其機(jī)制，為臨床上減輕CO2氣腹所致腎臟損傷提供一種可選擇的保護(hù)方法，促進(jìn)腹腔鏡外科的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料鹽酸右美托咪定購于上海源葉生物科技有限公司；肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醇(MDA)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所；大鼠白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、大鼠白細(xì)胞介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購于北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；PrieScriptTM RT Master Mix試劑盒和TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購自大連TaKaRa公司；TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒購自北京全式金生物公司。

1.2 模型制備8周齡健康雄性Sprang-Dawley (SD)大鼠18只(由北京斯貝福生物技術(shù)有限公司提供)，體質(zhì)量250～300 g，飼喂標(biāo)準(zhǔn)化鼠糧，不限飲水，保證飼養(yǎng)環(huán)境穩(wěn)定。實驗動物隨機(jī)分為3組，分別為對照(Sham)組，氣腹(Pp)組，右美托咪定預(yù)處理(Dex)組，每組各6只。Sham組進(jìn)行呼吸麻醉，麻醉后將氣腹針扎入腹中但不充氣；Pp組和Dex組分別腹腔注射生理鹽水(1 mL/kg)和Dex(50 μg/kg)，30 min后進(jìn)行呼吸麻醉，進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，將氣腹針插入腹中，給予15 mmHg壓力建立CO2氣腹，氣腹持續(xù)90 min。氣腹解除后6 h采集血液和組織，采用大鼠麻醉箱進(jìn)行麻醉，進(jìn)入全麻狀態(tài)后從心臟采血，分離血清保存于-80℃，用于檢測腎功和炎癥指標(biāo)。大鼠處死后，一部分腎組織放于福爾馬林固定液中，用于病理切片制作；另一部分腎組織放于-80℃ 保存，用于組織氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡相關(guān)基因的檢測。

1.3 腎功能檢測根據(jù)試劑盒說明書檢測血清中Cr和BUN含量的變化。

1.4 腎臟氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測取-80℃凍存的腎組織100 g，加入900 μL生理鹽水制備10%腎組織勻漿。剪碎組織，冰水浴中制備勻漿，4℃，2 500 r/min，離心10 min，取上清后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，根據(jù)檢測試劑盒說明書檢測腎臟組織勻漿中氧化應(yīng)激指標(biāo) MDA、SOD含量的變化。

1.5 炎癥細(xì)胞因子檢測根據(jù)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒說明書，采用雙抗夾心法檢測大鼠血清中的白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素 6(IL-6)的水平。

1.6 組織病理學(xué)形態(tài)檢查將新鮮腎組織固定在10%中性福爾馬林中，48 h后取出，修剪為合適尺寸，用流水沖洗過夜，分別依次放入70%，80%，90%，95%和100%酒精中進(jìn)行脫水，經(jīng)二甲苯透明、浸蠟、包埋處理后進(jìn)行切片，HE染色，鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)變化并拍照記錄。

1.7 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和相關(guān)凋亡基因的mRNA檢測采用實時熒光定量方法進(jìn)行基因水平的檢測。用TransZol Up Plus RNA Kit試劑盒提取腎組織勻漿總RNA，使用PrieScriptTMRT Master Mix試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，在LightCycler?96中進(jìn)行實時定量PCR。擴(kuò)增條件：95℃ 30 s預(yù)變性；95℃ 5 s變性，60℃ 30 s退火延伸，40個循環(huán)。所用引物(表1)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用2-△△Ct方法分析相對mRNA的表達(dá)。

表1 引物名稱及序列

2 結(jié)果

2.1 血清Cr和BUN水平的測定結(jié)果大鼠腎功能檢測結(jié)果顯示(圖1)，與Sham組相比，Pp組和Dex組氣腹后6 h血清中BUN和Cr水平均極顯著升高(P<0.01)。與Pp組相比，Dex組Cr水平顯著降低(P<0.05)，BUN極顯著降低(P<0.01)。

A.大鼠血清中Cr的含量(n=6)；B.大鼠血清中BUN的含量(n=6)圖1 血清中BUN及Cr含量

2.2 腎臟MDA和SOD的測定結(jié)果大鼠腎組織勻漿中氧化應(yīng)激因子含量檢測結(jié)果如圖2顯示，與Sham 組相比，Pp組和Dex組腎臟中SOD活力極顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著升高(P<0.01)；與Pp組相比，Dex組腎臟中SOD極顯著升高(P<0.01)，MDA極顯著降低(P<0.01)。

A.大鼠腎組織勻漿中SOD含量(n=6)；B.大鼠腎組織勻漿中MDA的含量(n=6)圖2 腎臟組織中MDA和SOD含量

2.3 血清 IL-1β、IL-6、TNF-α的測定結(jié)果大鼠血清中炎癥因子結(jié)果(圖3)顯示，與Sham 組相比，Pp組和Dex組血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子含量均極顯著升高(P<0.01)；與Pp組相比，Dex組血清中IL-1β、IL-6、TNF-α炎癥因子含量均極顯著降低(P<0.01)。

圖3 血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量變化(n=6)

2.4 腎臟病理學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果大鼠腎組織光鏡下病理切片顯示，Sham組腎小管上皮細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，刷狀緣完整，腎組織未顯示任何明顯病理變化(圖4A)；Pp組可見大量腎小管上皮細(xì)胞腫脹，部分腎小管上皮細(xì)胞刷狀緣脫落，細(xì)胞膜破裂，核裸露、淡染，腎小管間隙有出血，部分腎間質(zhì)有炎癥細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和系膜細(xì)胞有炎性細(xì)胞浸潤，部分還可見腎小球系膜細(xì)胞增生(圖4B)；Dex組與Pp組相比明顯減輕，腎間質(zhì)出血減少，上皮細(xì)胞刷狀緣脫落明顯改善(圖4C)。

A.Sham組；B.Pp組；C.Dex組圖4 腎臟組織病理學(xué)變化(400×)

2.5 腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)基因mRNA水平檢測大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激IRE1-α通路相關(guān)基因mRNA檢測結(jié)果顯示，與Sham 組相比，Pp組和Dex組GRP78、IRE1-α、XBP-1 mRNA水平均極顯著升高(P<0.01)；與Pp組相比，Dex組GRP78、IRE1-α、XBP-1 mRNA水平均極顯著降低(P<0.01)(圖5)。

圖5 腎臟中GRP78、IRE1-α、XBP-1基因的表達(dá)

2.6 大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路相關(guān)基因mRNA水平RT-qPCR結(jié)果顯示，與Sham 組相比，Pp組和Dex組CHOP、Caspase-12 mRNA的表達(dá)均極顯著升高(P<0.01)；與Pp組相比，Dex組CHOP極顯著降低(P<0.01)，Caspase-12 mRNA顯著降低(P<0.05)(圖6)。

圖6 腎臟中CHOP、Casp-12基因表達(dá)

3 討論

腹腔鏡手術(shù)期間為了提供清晰的視野條件，需要向體內(nèi)不斷的注入CO2，將氣腹維持在一定壓力，建立操作空間。CO2氣腹產(chǎn)生的壓力會壓迫血管和器官，導(dǎo)致組織缺血，供氧量減少，使細(xì)胞發(fā)生水腫、鈣超載等損傷[8]。當(dāng)CO2氣腹消除時，血液和氧氣重新灌注，又會使腎組織發(fā)生再灌注損傷[9]。腎功能指標(biāo)Cr、BUN的水平變化，是評價腎功能損傷的標(biāo)準(zhǔn)之一[10]。試驗結(jié)果顯示，氣腹壓升高到15 mmHg，腎臟BUN和Cr均顯著升高；在腎臟病理組織切片中也看到腎小管上皮細(xì)胞腫脹、刷狀緣丟失；腎小管間隙出血、有炎癥因子浸潤等病理變化，表明CO2氣腹對腎臟造成了損傷，造模成功。但通過腹腔注射Dex干預(yù)氣腹過程后，BUN和Cr水平均顯著下降；腎小管上皮細(xì)胞腫脹有所緩解，刷狀緣完整，腎小管間隙出血減少，說明通過腹腔注射Dex進(jìn)行預(yù)處理可以減輕CO2氣腹后腎臟損傷程度。

大量臨床研究表明，CO2氣腹可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[11]。MDA是常用的脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，可通過MDA含量的高低變化評估氧化損傷的程度，含量越高說明氧化損傷越嚴(yán)重。而SOD是機(jī)體重要的自由基清除劑，能減少脂質(zhì)過氧化，維持氧化及抗氧化平衡[12]。試驗結(jié)果顯示CO2氣腹后，MDA顯著升高，SOD含量下降顯著，表明CO2氣腹可能引起了腎臟的氧化應(yīng)激損傷。但用Dex進(jìn)行干預(yù)后，與氣腹組相比，MDA下降顯著，SOD含量升高顯著，證明Dex可以通過調(diào)節(jié)MDA和SOD水平減輕機(jī)體腎臟組織的氧化損傷。

CO2氣腹過程中腎臟組織出現(xiàn)缺血、缺氧狀態(tài)，恢復(fù)再灌注時會產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-1、TNF-α等的釋放，參與炎癥反應(yīng)[13-14]。本試驗中病理切片和炎癥因子的檢測均顯示，CO2氣腹過程有炎癥反應(yīng)的參與，應(yīng)用Dex干預(yù)氣腹過程后，抑制了IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌，預(yù)示著Dex能從抗炎方面保護(hù)腎功能。

機(jī)體的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)均可以導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress，ERS)，從而激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)。UPR過程中，肌醇需求酶 (inositol-requiring enzyme 1，IRE1)從葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)上解離下來，一方面通過 GRP78與未折疊蛋白結(jié)合，另一方面，游離下來的IRE1通過激活I(lǐng)RE1/XBP-1(X-box binding protein 1，X盒結(jié)合蛋白1)通路調(diào)控下游基因表達(dá)等方式緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[15-16]。但如果內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激程度過強(qiáng)或者時間過長，可激活與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)關(guān)聯(lián)的凋亡信號C/EBP同源蛋白(CHOP)的表達(dá)和Caspase-12活化，引起細(xì)胞凋亡[17-19]。試驗中GRP78、IRE1、XBP-1 mRNA的表達(dá)均升高，說明腎臟細(xì)胞可能發(fā)生了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，CHOP、Caspase-12等的mRNA表達(dá)升高，由此推斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)可能進(jìn)一步引起了細(xì)胞凋亡。Dex預(yù)處理組中GRP78、IRE1-α、XBP-1和CHOP、Caspase-12的表達(dá)水平均有所下降，表明Dex可能通過減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減少凋亡的發(fā)生。

CO2氣腹可以導(dǎo)致腎臟發(fā)生炎癥損傷、氧化應(yīng)激損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，而Dex可以從降低腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)、減少炎癥因子的釋放等方面減弱CO2氣腹引起的腎臟缺血再灌注損傷。其保護(hù)機(jī)制還可能包括通過抑制IRE1的表達(dá)，下調(diào)XBP-1、CHOP、Caspase-12的表達(dá)，減少腎臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和降低細(xì)胞凋亡。