金 鹿，桑 丹，張崇志，李勝利，張春華，張俊麗，施 安，孫海洲，李聚才

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所/內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏 銀川 750002）

胃腸道功能對(duì)于反芻動(dòng)物的機(jī)體健康、 生產(chǎn)潛能的發(fā)揮至關(guān)重要。 微生物群落是維系胃腸道正常功能的關(guān)鍵因素， 胃腸道的微生態(tài)平衡與宿主的健康［1］和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收［2］息息相關(guān)。對(duì)于反芻動(dòng)物而言， 胃腸道不同部位的微生物發(fā)揮的作用不同， 如瘤胃中的優(yōu)勢(shì)微生物群落主要由纖維素降解菌組成， 例如絲狀桿菌屬（Filamentous）、瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、白色瘤胃球菌（Ruminococcus albus）等，腸道中的優(yōu)勢(shì)菌群主要為可利用乳糖的微生物， 例如柔嫩梭菌（Clostridium tender）、擬球梭菌屬（Clostridium）、直腸真桿菌（Eubacterium rectale）等，胃腸道不同部位的微生物在反芻動(dòng)物疾病防控以及腸道健康方面起到關(guān)鍵作用［3-5］。 以前，通常以部分瘤胃或糞便樣品反映整個(gè)胃腸道微生物的結(jié)構(gòu)和組成［6-9］，進(jìn)而評(píng)估宿主的健康和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。 近年來(lái)越來(lái)越多的研究表明，盡管在同一個(gè)體中，動(dòng)物胃腸道不同部位的微生物群落多樣性也存在較大差異［10-12］。 由此可見(jiàn)，利用反芻動(dòng)物瘤胃和糞便微生物反映整個(gè)胃腸道微生物結(jié)構(gòu)與組成具有片面性。 目前，豬［13］、肉雞［14］、兔［15］等單胃動(dòng)物和牛［16］、山羊［17］等反芻動(dòng)物的胃腸道微生物多樣性的研究取得了重要發(fā)現(xiàn)， 但是對(duì)灘羊斷奶羔羊胃腸道微生物群落多樣性的研究較少。該研究以寧夏灘羊作為研究對(duì)象，采用16S rDNA 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)羔羊瘤胃和小腸中的微生物群落進(jìn)行測(cè)定， 探討不同部位菌群特征及差異， 以期為通過(guò)營(yíng)養(yǎng)干預(yù)手段調(diào)控胃腸道微生物定植、促進(jìn)羔羊健康發(fā)育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)試劑

DNA 提取試劑盒（QIAGEN）購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；2G Robust Hot Start Ready Mix（KAPA， KK5701） 和 文 庫(kù) 定 量 試 劑 盒（KAPA，KK4824）購(gòu)自上海易匯生物科技有限公司；核酸純化試劑盒（Beckman Coulter，A63882）購(gòu)自貝克曼庫(kù)爾特商貿(mào) （中國(guó)） 有限公司；DL 2 000 DNA Marker（TaKaRa，3427）購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；DNA 文庫(kù)制備試劑盒（NEB，E7645S）購(gòu)自南京賽泓瑞生物科技有限公司；MiSeqReagent Kit v3（600 cycle）（Illumina，15067874）購(gòu)自上海生物工程技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器

PCR 儀 （ABI9700，USA）、Nanodrop 微量分光光度計(jì)（ND-1000 型，Thermo Scientific），美國(guó)生物分 析 儀 （2100，Agilent）、 生 物 大 分 子 分 析 儀（PerkinElmer）、高通量二代測(cè)序儀（PE300 平臺(tái)，Illumina）。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選取體重18 kg 左右、65 日齡的斷奶灘羊公羔12 只，屠宰后采集瘤胃、十二指腸、空腸和回腸內(nèi)容物各12 管置于5 mL 的無(wú)酶無(wú)菌凍存管中，－80 ℃冰箱保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣本DNA 提取

瘤胃和小腸內(nèi)容物樣本DNA 提取采用DNA提取試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)方法， 采用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 分子質(zhì)量，用紫外分光光度計(jì)（Nanodrop）檢測(cè)DNA 濃度和純度。

1.2.2 16S rDNA 高可變區(qū)引物設(shè)計(jì)及PCR 擴(kuò)增

以V3 和V4 為目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。PCR 反應(yīng)體系見(jiàn)表2。PCR 擴(kuò)增程序如下：94 ℃模板DNA 預(yù)變性5 min；94 ℃模板DNA 變性30 s，50 ℃模板DNA 與引物退火30 s，72 ℃延伸60 s，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃保持7 min；4 ℃保存。

表1 引物信息

表2 PCR 反應(yīng)體系

1.2.3 測(cè)序

PCR 擴(kuò)增后， 正反向引物兩端分別加上不同的barcode 區(qū)分不同的腸道樣本。 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用PCR 純化試劑盒對(duì)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，并按測(cè)序要求混合。測(cè)序在北京奧維森基因科技有限公司提供的Mixed PE300 平臺(tái)進(jìn)行。

1.2.4 測(cè)序信息分析流程

對(duì)于MiSeq 測(cè)序獲得的雙端數(shù)據(jù)， 首先利用Trimmomatic、Pear 對(duì)Fastq 數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控。 利 用Flash、Pear 根據(jù)PE 的overlap 關(guān)系對(duì)兩端序列進(jìn)行拼接（merge）處理，根據(jù)已知數(shù)據(jù)庫(kù)用uchime方法比對(duì)去除Fasta 序列的嵌合體，對(duì)于未知數(shù)據(jù)庫(kù)使用自比對(duì)（denovo）方法進(jìn)行去除，同時(shí)去除不合要求的短序列。 對(duì)最終獲得有效數(shù)據(jù)（clean data）進(jìn)行OTU 聚類分析和物種分類學(xué)分析，數(shù)據(jù)分析程序見(jiàn)表3。

表3 數(shù)據(jù)分析程序列表

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SAS 9.0 軟件提供的One-Way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 氏新復(fù)極差法（SSR 法）進(jìn)行多重比較。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差” 的形式表示，P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 操作分類單位（OTU）數(shù)量

韋恩圖（Venn）用于分析環(huán)境樣品的OTU 數(shù)目組成相似性及重疊情況。 利用胃腸道細(xì)菌群落共享和獨(dú)特的OTU 豐度進(jìn)行分析。 由圖1 可知，4個(gè)部位共產(chǎn)生2 147 個(gè)OTU， 瘤胃產(chǎn)生872 個(gè)OTU，十二指腸產(chǎn)生1 197 個(gè)OTU，空腸產(chǎn)生655 個(gè)OTU， 回腸產(chǎn)生1 277 個(gè)OTU，4 個(gè)部位共享了364 個(gè)OTU，占總OTU 數(shù)目的16.95%。十二指腸、回腸、瘤胃、空腸獨(dú)有的OTU 類別和數(shù)目分別為450、445、278、28 個(gè)， 分 別 占 總OTU 數(shù) 目 的20.96%、20.73%、12.95%和1.30%，說(shuō)明十二指腸、回腸和瘤胃增加了特有微生物的種類和多樣性。

圖1 胃腸道菌群Venn 圖

2.2 Alpha 多樣性分析

2.2.1 稀釋曲線和Shannon 曲線

稀釋曲線可以反映樣品的測(cè)序深度，Shannon曲線反映各樣品在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性， 即在97%相似度OTU 水平下的微生物多樣性。 由圖2 可知，隨著測(cè)序深度的增加，曲線逐漸趨于平坦，說(shuō)明此時(shí)的測(cè)序數(shù)據(jù)量合理。當(dāng)測(cè)序深度較小時(shí)，Shannon 曲線迅速增加， 當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到5 000 reads 時(shí)，Shannon 曲線變緩，逐漸接近飽和狀態(tài)，表明當(dāng)測(cè)序深度達(dá)到5 000 reads 時(shí)，該數(shù)據(jù)量已足夠進(jìn)行樣品菌群多樣性分析（見(jiàn)圖3）。

圖2 樣品的稀釋曲線

圖3 樣品的Shannon 曲線

2.2.2 Alpha 多樣性分析

Alpha 多樣性分析與群落豐富度（community richness）和群落多樣性（community diversity）有關(guān)，群落豐富度指數(shù)包括Chao1 指數(shù)， 群落多樣性指數(shù)包括Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)。Chao1 指數(shù)用來(lái)估計(jì)OTU 數(shù)目，Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)為衡量微生物多樣性的指數(shù)，Shannon 值越高、灘羊胃腸道微生物群落多樣性越高。由表4 可知，瘤胃、十二指腸、空腸、回腸樣品的Chao1 指數(shù)、Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)差異均不顯著 （P＞0.05），但十二指腸樣品中Chao1 指數(shù)高于其他部位， 說(shuō)明十二指腸中細(xì)菌群落總數(shù)高于其他腸道部位。瘤胃樣品中Shannon 指數(shù)和Simpson 指數(shù)均高于十二指腸、空腸和回腸，說(shuō)明瘤胃樣品中細(xì)菌的多樣性最豐富。每組測(cè)序覆蓋率均高于99%，表明測(cè)序數(shù)據(jù)量是合理的， 并且能夠反映灘羊羔羊胃腸道微生物群落情況。

表4 Alpha 多樣性指數(shù)

2.3 細(xì)菌組成和群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 門(mén)水平的結(jié)構(gòu)分析

十二指腸、回腸、瘤胃和空腸菌群在門(mén)水平上的組成和相對(duì)豐度見(jiàn)表5 和圖4， 檢測(cè)結(jié)果包含21 個(gè)門(mén)，如厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、放 線 菌 門(mén)（Actinobacteria）、螺 旋 菌 門(mén)（Spirochaetae）、變形菌門(mén)（Proteobacteria）、糖細(xì)菌門(mén)（Saccharibacteria）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、藍(lán)藻菌門(mén) （Cyanobacteria） 等。 4 個(gè)部位中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）和放線菌門(mén)（Actinobacteria） 為優(yōu)勢(shì)類群， 占總細(xì)菌數(shù)目的90%以上。瘤胃液中擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、絲狀桿菌門(mén)（Fibrobacteres）的相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸、空腸和回腸，十二指腸中廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）的相對(duì)豐度與瘤胃相比有升高的趨勢(shì)（0.05＜P＜0.10），空腸和回腸中厚壁菌門(mén)（Firmicutes） 的相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸。

圖4 門(mén)水平上胃腸道菌群分布圖

表5 灘羊羔羊胃腸道菌群在門(mén)水平的相對(duì)豐度（＞1%）

2.3.2 屬水平的結(jié)構(gòu)分析

瘤胃、十二指腸、空腸和回腸菌群在屬水平上的組成和相對(duì)豐度見(jiàn)表6 和圖5。 從分析結(jié)果可知，4 個(gè)部位總共包含397 個(gè)屬。 有19 個(gè)屬的相對(duì)比例占到了總數(shù)的1%以上， 包括普雷沃菌屬_1（Prevotella_1）、 克 里 斯 滕 森 菌 屬 _R -7（Christensenellaceae_R-7_group）、 奧 爾 森 菌 屬（Olsenella）、 理 研 菌 屬 _RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 毛 螺 菌 屬_NK3A20（Lachnospiraceae_NK3A20_group）、密 螺旋 體 屬 _2 （Treponema_2）、 糖 酵 菌 屬（Saccharofermentans）、 雙 歧 桿 菌 屬（Bifidobacterium）、 瘤 胃 球 菌 屬 _gauvreauii（Ruminococcus_gauvreauii_group）、瘤胃球菌屬_UCG-014 （Ruminococcaceae_UCG-014）、 瘤胃球菌屬_NK4A214 （Ruminococcaceae_NK4A214_group）、夏 普 菌 屬 （Sharpea）、 毛 螺 旋 菌 屬（Acetitomaculum）、互營(yíng)球菌屬（Syntrophococcus）、瘤胃球菌屬_UCG-005 （Ruminococcaceae_UCG-005）、鐮孢菌屬（Catenisphaera）、產(chǎn)糞甾醇真細(xì)菌屬（Eubacterium_co prostanoligenes_group）、Family_ⅩⅢ_AD3011_group 等。 瘤 胃 中 理 研 菌 屬_RC9（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、 密螺旋體 屬_2（Treponema_2）、 瘤 胃 球 菌 屬 _NK4A214（Ruminococcaceae_NK4A214_group）、普雷沃菌屬_UCG-001（Prevotellaceae_UCG-001）相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）高于十二指腸、空腸和回腸。 空腸中Family_ⅩⅢ_AD3011_group 相對(duì)豐度顯著（P＜0.05）高于其他部位。

圖5 屬水平上胃腸道菌群分布圖

表6 灘羊羔羊胃腸道菌群在屬水平的相對(duì)豐度（＞1%）

3 討論

反芻動(dòng)物胃腸道微生態(tài)系統(tǒng)是機(jī)體最重要的微生態(tài)系統(tǒng)， 反芻動(dòng)物胃腸道內(nèi)的大量微生物有提供營(yíng)養(yǎng)、抵御外界病原生物侵害、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)和生物屏障等作用，它們與機(jī)體互相制約，互相依存構(gòu)成了動(dòng)態(tài)、統(tǒng)一的平衡體。當(dāng)機(jī)體處于健康狀態(tài)時(shí)， 動(dòng)物胃腸道內(nèi)的微生物是相對(duì)平衡的微生態(tài)環(huán)境，對(duì)于宿主來(lái)說(shuō)是一種有益的狀態(tài)。健康的胃腸道微生物系統(tǒng)是動(dòng)物內(nèi)環(huán)境必不可少的組成部分［17］。目前，利用高通量測(cè)序技術(shù)研究綿羊瘤胃和糞便微生物， 尤其有關(guān)灘羊胃腸道微生物多樣性的研究報(bào)道較少。 該試驗(yàn)采用二代測(cè)序技術(shù)分析灘羊羔羊胃腸道微生物組成及其豐度， 根據(jù)稀釋曲線和Coverage 指數(shù)分析結(jié)果， 各組測(cè)序數(shù)據(jù)的覆蓋率均高于99%， 能夠真實(shí)全面反映胃腸道菌群組成情況。 根據(jù)Alpha 多樣性分析可知，不同部位的細(xì)菌微生物多樣性及相對(duì)豐度存在差異，瘤胃細(xì)菌的多樣性最豐富。

動(dòng)物胃腸道中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)是擬桿菌門(mén)和厚壁菌門(mén)［18-19］。 厚壁菌門(mén)能將飼料中纖維降解為揮發(fā)性脂肪酸，促進(jìn)飼料消化和動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育，而擬桿菌門(mén)能降解非纖維類物質(zhì)［20-21］。 厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)可以促進(jìn)機(jī)體吸收能量，因此，厚壁菌門(mén)與擬桿菌門(mén)細(xì)菌的比值可以反映機(jī)體的肥胖狀況［22-23］。腸道中擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度與宿主的體脂含量呈顯著負(fù)相關(guān)［24-25］，擬桿菌門(mén)數(shù)量越多，機(jī)體對(duì)脂肪的分解和脂肪酸氧化的能力越高，因此，一定數(shù)量的擬桿菌有利于降低宿主的脂肪含量。王繼文等［26］研究表明，在門(mén)水平上，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是山羊瘤胃微生物中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)， 且擬桿菌門(mén)豐度高于厚壁菌門(mén)。 Jesus-Laboy 等［27］研究表明，在山羊糞便微生物中， 厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度高于擬桿菌門(mén)。該試驗(yàn)結(jié)果表明，灘羊羔羊瘤胃中的微生物相對(duì)豐度最高的是厚壁菌門(mén)， 其次為擬桿菌門(mén)和放線菌門(mén)，3 種細(xì)菌占到總量的90%以上；灘羊羔羊十二指腸中的優(yōu)勢(shì)菌群依次為放線菌門(mén)、 厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和糖細(xì)菌門(mén)；空腸和回腸中的優(yōu)勢(shì)菌群相似，均為厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)，且厚壁菌門(mén)所占比例高于放線菌門(mén)。 該研究結(jié)果與前人研究有所不同， 其原因可能是細(xì)菌的定植時(shí)間與動(dòng)物日齡相關(guān)， 從不同日齡的動(dòng)物中取到的微生物群落可能會(huì)有差異； 試驗(yàn)動(dòng)物品種的選取、 飼糧的結(jié)構(gòu)、 采樣的部位和方式以及測(cè)序的區(qū)域?qū)τ谖⑸锶郝錅y(cè)定也會(huì)產(chǎn)生一定影響［20，28］。 在屬水平上，灘羊羔羊瘤胃液中相對(duì)豐度較高的菌屬為普雷沃菌屬；十二指腸、空腸和回腸中相對(duì)豐度較高的菌屬為奧爾森菌屬，這與以往在其他反芻動(dòng)物如奶牛［29］、肉牛［30］、綿 羊［31］以 及 山 羊［26］中 的 研 究 結(jié) 果 存 在 差異。 研究發(fā)現(xiàn)，同一品種的動(dòng)物，不同腸段微生物組成存在特異性［32-33］， 因?yàn)椴煌c道部位的pH值、食糜蠕動(dòng)、分泌物和氧化還原電位均不相同。奧爾森菌屬是分布于健康牛瘤胃中的一種革蘭陽(yáng)性細(xì)菌，最終代謝產(chǎn)物主要是乙酸和乳酸［34］。普雷沃菌屬是擬桿菌門(mén)的主要細(xì)菌， 可以獨(dú)立降解蛋白質(zhì)、糖類和碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，由于該菌屬微生物種型多、遺傳多樣性豐富、底物寬泛，所以能在瘤胃中處于優(yōu)勢(shì)地位［26］。由試驗(yàn)結(jié)果可知，利用反芻動(dòng)物部分瘤胃和糞便微生物反映整個(gè)胃腸道微生物結(jié)構(gòu)與組成具有片面性， 并不能反映真實(shí)情況。Frey 等［35］研究表明，在胃腸道進(jìn)行食糜消化的全過(guò)程中，微生物結(jié)構(gòu)在不斷發(fā)生變化，所以食糜在胃腸道中消化的過(guò)程是導(dǎo)致胃腸道不同部位微生物組成存在差異的原因。

瘤胃球菌屬是普遍存在于草食動(dòng)物胃腸道的主要纖維降解菌， 包括黃色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌，這2 種菌能夠產(chǎn)生纖維水解酶，對(duì)粗飼料中纖維素和半纖維素的降解起著重要作用［36］，但該研究發(fā)現(xiàn)瘤胃球菌屬在瘤胃的豐度僅有6%左右，在小腸的豐度為4%～7%。 Girija 等［37］有關(guān)牛糞微生物的研究發(fā)現(xiàn)， 該菌屬在瘤胃的豐度僅為2%，表明其在瘤胃中的占比很小， 說(shuō)明以往借助傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)得到的試驗(yàn)結(jié)果也許夸大了瘤胃球菌屬在瘤胃中的作用?；诋?dāng)前細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)，該研究發(fā)現(xiàn)在灘羊羔羊瘤胃、腸道（十二指腸、空腸、回腸）內(nèi)還檢測(cè)到大量未被分類鑒定的菌屬（Unidentified），提示在特定生態(tài)環(huán)境條件下形成的地方優(yōu)良特色裘皮品種灘羊羔羊胃腸道可能存在特有的微生物菌群。

4 結(jié)論

灘羊羔羊瘤胃中細(xì)菌的多樣性最豐富。 瘤胃微生物與十二指腸、 空腸和回腸的細(xì)菌區(qū)系顯著不同，可能與其特定的功能差異有關(guān)。