鮑朝霞，魏泓毓，陳 灰，曹金山，賀鵬飛，2*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點實驗室，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)能夠應(yīng)答胞外和胞內(nèi)刺激并介導(dǎo)細胞生長和分化、免疫反應(yīng)、炎癥以及腫瘤發(fā)生等多種生物學(xué)過程[1-3]。哺乳動物的MAPK家族主要包括3個亞族：細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2)、c-Jun 氨基末端激酶1/2/3(C-Jun N-terminal kinases1/2/3,JNK1/2/3)、p38蛋白激酶(P38MAPki-nases,p38 MAPK)[4]。上皮細胞中，MAPK的活化與炎性細胞因子表達密切相關(guān)，因此在機體免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。有研究表明，脂多糖(LPS)能夠激活免疫細胞及上皮細胞的MAPK信號通路，上調(diào)MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平，并且隨時間延長，其磷酸化水平呈動態(tài)變化。在奶牛乳腺上皮細胞中，LPS刺激0.5 h時，細胞ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平均顯著升高，但是LPS處理1 h后，ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平呈下降趨勢[5]。在奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞中，LPS處理30 min內(nèi)ERK1/2、JNK、P38MAPK的磷酸化水平呈上升趨勢，但45 min 后開始下降，上述研究結(jié)果提示上皮細胞內(nèi)存在一定的負反饋調(diào)節(jié)機制，以避免過度的炎性反應(yīng)[6]。

“膽堿能抗炎通路”已被證實在神經(jīng)抗炎機制發(fā)揮重要作用，α7煙堿乙酰膽堿受體(α7 Nicotinic acetylcholine receptors,α7-nAChR)是由同源的α7亞基組成的五聚體，通過調(diào)控細胞Ca2+通透性參與炎癥反應(yīng)，多種體內(nèi)及體外炎癥模型研究結(jié)果表明激活α7-nAChR具有抗炎作用，并且證明α7-nAChR在“膽堿能抗炎通路”中起核心作用。在免疫細胞和外緣細胞中，激活α7-nAChR可下調(diào)LPS誘導(dǎo)的ERK1/2、JNK、P38MAPK磷酸化水平，降低炎性介質(zhì)的產(chǎn)生從而發(fā)揮抗炎作用[7]。

在LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)，上皮細胞存在避免過度炎性反應(yīng)的負反饋調(diào)節(jié)機制，但這種細胞自我調(diào)控機制尚不明確。本研究通過比較兔子宮內(nèi)膜上皮細胞α7-nAChR表達與MAPK信號通路相關(guān)性，初步探討α7-nAChR是否介導(dǎo)細胞自我調(diào)控作用以避免過度炎癥反應(yīng)的機理。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性新西蘭大白兔，體質(zhì)量1.5～2.0 kg，購自北京斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實驗動物在溫度18～26℃、濕度30%～50%條件下，自由飲食和進水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)購自南京愛貝生物科技有限公司；青鏈霉素混合液、膠原酶Ⅰ、二甲基亞砜(DMSO)、D-PBS緩沖液、4×蛋白上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠試劑盒、20×PBST緩沖液、彩色蛋白預(yù)染Marker均購自北京索萊寶科技有限公司；0.25% 胰酶、DMEM/F12培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、20×PBS緩沖液均購自Gibco公司；尼古丁(α7-nAChR激動劑)購自上海士鋒生物科技有限公司； PNU282987(α7-nAChR激動劑)、甲基牛扁堿(α7-nAChR抑制劑，Methyl Mandeline,MLA)購自MCE生物公司；LPS購自Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒、M-PER細胞蛋白裂解液購自Thermo公司；蛋白酶抑制劑購自Pierce公司；牛血清白蛋白(BSA)購自BD Biosciences公司；Western抗體稀釋液購自Biosharp公司；10×Tris/Glycine Buffer購自Bio-Rad公司；p-ERK1/2、ERK1/2、p-JNK1/2/3、JNK1/2/3、α7-nAChR抗體均購自Affinity Biosciences公司；p-P38MAPK、P38MAPK抗體購自Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體、羊抗鼠二抗購自三箭生物公司。

1.3 主要儀器超凈工作臺購自Airtech公司；超純水儀購自Biotech公司；蛋白成像儀購自Generay公司；低速臺式離心機購自安亭公司；CO2培養(yǎng)箱、低溫高速離心機均購自Thermo公司；高壓蒸汽滅菌鍋、制冰機均購自Panasonic公司；電熱恒溫水槽購自上海森信實驗儀器有限公司；電泳槽、恒壓穩(wěn)流電泳儀、半干式轉(zhuǎn)膜儀均購自Bio-Rad公司；電子分析天平購自賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；倒置顯微鏡購自O(shè)LYMPUS公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱購自上海-恒科學(xué)儀器有限公司。

1.4 兔子宮內(nèi)膜上皮細胞的分離培養(yǎng)新西蘭大白兔肌肉注射PMSG 100 IU，48 h后耳緣靜脈注射hCG 80 IU以調(diào)整不同個體生理周期一致，18 h后耳緣靜脈注射空氣栓塞處死。無菌采集兔子宮，用含有3%青鏈霉素的生理鹽水反復(fù)沖洗3次，每次4℃靜置10 min，直至沖洗液澄清。在超凈臺內(nèi)用眼科剪將子宮縱向剖開，剪去多余組織，浸入含0.05% 膠原酶Ⅰ和0.05%胰蛋白酶的D-PBS中，37℃水浴消化30 min，之后使用含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化；培養(yǎng)基經(jīng)100 目細胞篩過濾，濾液再使用400 目細胞篩過濾，濾網(wǎng)上為兔子宮內(nèi)膜上皮細胞，使用DMEM/F12培養(yǎng)液反復(fù)沖洗細胞篩，沖洗液1 200 r/min離心5 min，棄上清，加入D-PBS緩沖液重懸細胞，離心，重復(fù)3次；最后加入含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞并接種于培養(yǎng)瓶，于37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.5 分組與給藥細胞經(jīng)0.25%胰酶消化后接種于6孔板中培養(yǎng)，待細胞密度至85%～90%時，更換未添加血清及抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基饑餓處理12 h，后更換為含15% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基。藥物處理分組如下：PBS處理為空白對照組(第1組)、100 μg/L LPS處理組(第2組)、5 μmol/L MLA處理組(第3組)、100 μg/L LPS+5 μmol/L PNU282987處理組(第4組)、100 μg/L LPS+5 μmol/L PNU282987+5 μmol/L MLA處理組(第5組)、100 μg/L LPS+10 mg/L尼古丁處理組(第6組)、100 μg/L LPS+10 mg/L尼古丁+5 μmol/L MLA處理組(第7組)。

1.6 Western blot檢測細胞經(jīng)過藥物處理12 h后用PBS清洗，加入適量的細胞裂解液提取總蛋白，用BCA法測定蛋白質(zhì)濃度并調(diào)整蛋白濃度一致。每組分別取等量的蛋白樣本進行SDS-PAGE凝膠電泳，后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，3% BSA室溫封閉2 h。分別加入稀釋相應(yīng)倍數(shù)的p-ERK1/2(1∶2 000)、ERK1/2(1∶5 000)、p-JNK1/2/3(1∶2 000)、JNK1/2/3(1∶800)、p-P38MAPK(1∶1 000)、P38MAPK(1∶1 000)、α7-nAChR(1∶1 000)、β-actin(1∶2 000)抗體，4℃過夜。TBST清洗3次，每次10 min。PVDF膜置入稀釋羊抗鼠二抗(1∶7 500)、羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min。使用ECL Plus超敏發(fā)光劑顯影、定影。以β-actin作為內(nèi)參，通過Image J對比蛋白灰度值進行分析計算。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0軟件中的單因素方差分析(One-way ANOVA)進行統(tǒng)計分析，使用GraphPad Prism 5.0軟件制作數(shù)據(jù)圖表，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 兔子宮內(nèi)膜上皮細胞α7-nAChR的表達由圖1可知，100 μg/L LPS、5 μmol/L MLA作用兔子宮內(nèi)膜上皮細胞12 h之后，α7-nAChR表達明顯高于對照組；相比于LPS組和MLA組，5 μmol/L PNU282987和10 mg/L尼古丁可明顯降低α7-nAChR的表達，MLA可逆轉(zhuǎn)PNU282987的效應(yīng)，但其與尼古丁共同作用時，進一步降低α7-nAChR的表達。

1.CON組；2.LPS組；3.MLA組；4.LPS+PNU282987組；5.LPS+PNU282987+MLA組；6.LPS+尼古丁組；7.LPS+尼古丁+MLA組 *示P<0.05；**示P<0.01；***示P<0.001

2.2 兔子宮內(nèi)膜上皮細胞α7-nAChR介導(dǎo)調(diào)控MAPK信號通路關(guān)鍵因子磷酸化由圖2可知，100 μg/L LPS與5 μmol/L MLA處理兔子宮內(nèi)膜上皮細胞12 h之后，相比于細胞空白對照組可明顯降低JNK1/2及P38MAPK磷酸化水平，5 μmol/L PNU282987和10 mg/L尼古丁可明顯抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平，MLA可顯著逆轉(zhuǎn)PNU282987和尼古丁效應(yīng)。

3 討論

子宮內(nèi)膜上皮細胞是子宮內(nèi)膜抵抗病原微生物的第1道物理屏障，具有重要的免疫防御作用。大腸桿菌是引起子宮感染性疾病的重要致病菌，在感染子宮中會產(chǎn)生大量的內(nèi)毒素，LPS是大腸桿菌的主要毒力因子[8-10]，低濃度的LPS便可以引起機體的炎癥反應(yīng)。機體免疫細胞及上皮細胞通過“模式識別受體”識別LPS并分泌炎性細胞因子以抵抗病原感染。但是過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致敗血癥、感染性休克或者全身炎癥反應(yīng)綜合征。

MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是生物體內(nèi)LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的信號通路之一，由相關(guān)的絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，在哺乳類動物中有6種亞群，其中ERK1/2、JNK1/2/3、p38 MAPK主要參與機體的炎癥及免疫反應(yīng)[11]。當菌體釋放內(nèi)毒素后，LPS與LBP(LPS結(jié)合蛋白)結(jié)合形成LBP-LPS復(fù)合體，LBP將LPS運輸?shù)郊毎げ⑴c膜上的CD14結(jié)合，激活細胞表面的TLR4。TLR4識別LPS后導(dǎo)致細胞內(nèi)MyD88和TRIF信號通路的激活，最終引起MAPK信號通路的激活[12-15]。

LPS在短時間內(nèi)引起MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平上升，并且隨時間延長，其磷酸化水平呈動態(tài)變化。有研究表明，LPS快速激活奶牛子宮內(nèi)膜上皮細胞和巨噬細胞的MAPK通路，p-ERK1/2、p-P38MAPK和p-JNK的表達量在30 min 時快速升高，之后磷酸化蛋白快速降解并開始受到抑制，表明細胞內(nèi)存在一定的負反饋調(diào)節(jié)機制，以避免過度的炎性反應(yīng)[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，兔子宮內(nèi)膜上皮細胞在100 μg/L LPS刺激12 h后ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平明顯低于細胞空白對照組，說明兔子宮內(nèi)膜上皮細胞存在細胞內(nèi)負反饋調(diào)節(jié)機制，但這種細胞自我調(diào)控機制尚不明確[16-17]。

α7-nAChR在非中樞性炎癥調(diào)節(jié)中具有重要作用，其介導(dǎo)JAK2/STAT3、NF-κB和MAPK等信號通路參與炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)。本研究主要目的是探討兔子宮內(nèi)膜上皮細胞α7-nAChR與細胞避免炎癥過度反應(yīng)的自我調(diào)控機制的相關(guān)性。結(jié)果表明，在作用12 h后，LPS可明顯抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平，α7-nAChR抑制劑MLA單獨處理也可抑制ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK 磷酸化水平。有意思的是，α7-nAChR激動劑PNU282987和尼古丁分別與LPS共同處理細胞后ERK1/2、JNK1/2及P38MAPK磷酸化水平顯著低于與其相應(yīng)的MLA處理組，且這種反應(yīng)與α7-nAChR表達呈一定的負相關(guān)，上述結(jié)果初步說明LPS長時間刺激細胞后MAPKs磷酸化水平受到α7-nAChR調(diào)控，這種調(diào)控作用是細胞避免炎癥過度反應(yīng)自我調(diào)控的潛在機制。