余潔瑜，林禮釗，李維新，何嘉慧

（鶴山市東古調(diào)味食品有限公司，廣東 江門 529738）

醬油是中國(guó)傳統(tǒng)的調(diào)味品之一，根據(jù)釀造工藝可分為低鹽固態(tài)醬油與高鹽稀態(tài)醬油。其中高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵包括固態(tài)制曲和鹽水發(fā)酵兩個(gè)階段。以大豆/豆粕、小麥/麩皮為原料，接入米曲霉進(jìn)行固態(tài)制曲，米曲霉分泌積累大量蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡萄糖苷酶等酶系，對(duì)曲料中的生物大分子物質(zhì)進(jìn)行初步水解[1-2]。然后向成曲中加入2.0～2.5倍的鹽水（18%～20%），進(jìn)入鹽水發(fā)酵階段[3]。在高鹽環(huán)境中霉菌的生長(zhǎng)基本停止，耐鹽乳酸菌和耐鹽酵母等微生物逐漸占主導(dǎo)地位，促進(jìn)醬油中醇、醛、酸、酯、酚等更多風(fēng)味物質(zhì)的形成[4-5]。

蛋白酶在鹽水溶液中不穩(wěn)定，在18%NaCl溶液中殘留的蛋白酶活性僅為3%[6]，導(dǎo)致蛋白質(zhì)原料在鹽水發(fā)酵階段無(wú)法被進(jìn)一步有效利用，造成原料浪費(fèi)。在醬油鹽水發(fā)酵階段添加酸性蛋白酶，可以彌補(bǔ)醬醪中酸性蛋白酶活力較低的不足。目前已有研究表明，在以蛋白質(zhì)為基質(zhì)的食品發(fā)酵過(guò)程中添加酸性蛋白酶，能夠提高蛋白質(zhì)利用率，縮短發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品的氨基酸態(tài)氮含量[7-9]。

醬油發(fā)酵是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，發(fā)酵過(guò)程中微生物、酶、代謝產(chǎn)物之間相互影響[1，10-12]，改變發(fā)酵條件或額外添加物質(zhì)對(duì)醬油發(fā)酵的影響是牽一發(fā)而動(dòng)全身的。有研究指出[13]，在醬醪中額外添加酵母菌或糖化液，會(huì)影響醬醪的菌群結(jié)構(gòu)及有機(jī)酸、氨基酸、揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)等代謝產(chǎn)物。酸性蛋白酶的加入也有可能改變發(fā)酵體系的菌群結(jié)構(gòu)、影響產(chǎn)品風(fēng)味[14-15]。目前關(guān)于酸性蛋白酶在醬油方面的研究主要集中在菌種選育和混合制曲兩個(gè)方面。SHU L等[16]采用大氣和室溫等離子體系統(tǒng)對(duì)米曲霉（Aspergillus oryzae）3.042菌株進(jìn)行誘變得到突變菌株B-2，其酸性蛋白酶活力增加54.7%。呂遠(yuǎn)平等[17]的研究表明，采用高活力酸性蛋白酶菌種與米曲霉混合制曲，能夠提高醬油曲的酸性蛋白酶活力，有效提高全氮利用率和氨基酸生成率。徐德峰[18]采用電場(chǎng)誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合技術(shù)篩選獲得一株酸性蛋白酶活力較親本米曲霉（A.oryzae）HN3042提高82.19%的融合子并將其初步應(yīng)用于醬油發(fā)酵，與親本米曲霉制備醬油發(fā)酵液相比，新菌株制備醬油發(fā)酵液中的總酸、總氮和氨基酸態(tài)氮含量均有所提高，醬油發(fā)酵液的風(fēng)味也有所改善。但目前對(duì)于在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵過(guò)程中添加酸性蛋白酶制劑的研究鮮有報(bào)道。

本研究以高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油為研究對(duì)象，在醬油發(fā)酵初期（0 d）添加酸性蛋白酶（1‰），通過(guò)分析發(fā)酵過(guò)程中醬醪的酸性和中性蛋白酶活力、pH、總酸含量、氨基酸態(tài)氨含量和游離氨基酸含量的變化，以及生醬油中呈味氨基酸含量，考察添加外源酸性蛋白酶對(duì)醬油發(fā)酵的影響，以期為外源酸性蛋白酶在工業(yè)化釀造醬油生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬油成曲（曲料無(wú)塊狀、呈淡黃色并帶淺綠色，具有成曲固有氣味，無(wú)異味；水分＜30%）：鶴山市東古調(diào)味食品有限公司；酸性蛋白酶（酶活50 000 U/g）：山東和眾康源生物科技有限公司。

福林酚（分析純）：福州飛凈生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；三氯乙酸、乳酸、乳酸鈉（均為分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠；酪氨酸、干酪素（均為分析純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%，天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、精氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、脯氨酸濃度均為2 500 pmol/μL，胱氨酸濃度為1 250 pmol/μL）：美國(guó)Sigma公司；甲醇、乙腈（均為色譜純）：北京迪馬科技有限公司；鄰苯二甲醛（o-phthaldialdehyde，OPA）、9-芴甲基氯甲酸酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)OMC）（分析純）：安捷倫科技貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色譜儀（配熒光檢測(cè)器）：美國(guó)安捷倫Agilent科技有限公司；905自動(dòng)電位滴定儀：瑞士萬(wàn)通（中國(guó)）有限公司；TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-W420數(shù)顯三用恒溫水箱：常州普天儀器制造有限公司；MS105DU/A半微量天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高鹽稀態(tài)醬油的制備工藝流程及操作要點(diǎn)

酸性蛋白酶、鹽水→成曲→天然曬制→生醬油

操作要點(diǎn)：

黃豆：鹽水的比例按照1.0∶2.6（g∶g）添加鹽水（19.4%），以黃豆質(zhì)量的1‰添加酸性蛋白酶。曲料攪拌均勻后進(jìn)行天然曬制（當(dāng)?shù)販囟葹?5～35 ℃）發(fā)酵，發(fā)酵2個(gè)月[19-20]后收取生醬油。

1.3.2 樣品的制備

樣品取自天然曬制工藝過(guò)程，分別收取發(fā)酵1 d、2 d、4 d、6 d、10 d、20 d、30 d、40 d、50 d、62 d醬油醪液樣品，用快速濾紙過(guò)濾，將濾液用于分析檢測(cè)。

1.3.3 分析檢測(cè)

中性蛋白酶、酸性蛋白酶活的測(cè)定：采用福林法[21]。中性蛋白酶的酶活定義：1 mL濾液在pH 7.5、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白中釋放1 μg酪氨酸的能力為1個(gè)活力單位（U/mL）；酸性蛋白酶的酶活定義：1 mL濾液在pH 3.0、40 ℃下，每分鐘水解酪蛋白中釋放1 μg酪氨酸的能力為1個(gè)活力單位（U/mL）。

pH的測(cè)定：采用pH計(jì)；總酸含量的測(cè)定：采用酸度計(jì)法[22]；氨基酸態(tài)氮含量的測(cè)定：采用甲醛法[22]。

游離氨基酸含量的測(cè)定：采用柱前衍生-高效液相色譜法，操作如下：

樣品前處理：參考馬艷莉等[23]的方法。吸取1 mL樣品濾液于50 mL的容量瓶中，加超純水定容，搖勻。根據(jù)氨基酸態(tài)氮含量的檢測(cè)結(jié)果，用超純水進(jìn)一步稀釋樣品到合適濃度（使稀釋液的胱氨酸濃度控制在2.5～200 pmol/μL、其他16種氨基酸的濃度控制在5～400 pmol/μL）?；靹蚝笕∠♂屢航?jīng)0.22 μm有機(jī)膜過(guò)濾進(jìn)2 mL樣品瓶，待上機(jī)。

柱前衍生條件：參考申兆棟等[24]的方法。吸取2.5 μL硼酸鹽溶液與1.0 μL樣品稀釋液，混合5次，等待0.2 min，吸取0.5 μL OPA衍生試劑，混合10次，吸取0.4 μL FOMC衍生試劑，混合10次，吸取32 μL進(jìn)樣稀釋劑，混合8次。

高效液相色譜條件：采用Agilent AdvanceBio AAA氨基酸色譜柱（4.6 mm×100 mm，2.7-Miron）進(jìn)行分離；流動(dòng)相A為10 mmol/L Na2HPO4：10 mmmol/L Na2B4O7（1∶1），用濃鹽酸調(diào)pH到8.2；流動(dòng)相B為乙腈∶甲醇∶水（45∶45∶10），采用梯度洗脫，0～0.50 min，98%流動(dòng)相A，2%流動(dòng)相B；0.50～20.50 min，98%～43%流動(dòng)相A，2%～57%流動(dòng)相B；20.50～20.60 min，43%～0%流動(dòng)相A，57%流動(dòng)相B，0%～43%超純水；20.60～22.00 min，57%；流動(dòng)相B，43%超純水；22.00～22.10 min，57%～100%流動(dòng)相B；22.10～24.30 min，100%流動(dòng)相B；24.30～24.40 min，100%～2%流動(dòng)相B，0%～98%超純水；24.40～27.00 min，2%流動(dòng)相B，98%超純水；柱溫為40 ℃；流速1.5 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)在0～16 min范圍內(nèi)，激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為450 nm，16 min后激發(fā)波長(zhǎng)為260 nm、發(fā)射波長(zhǎng)為325 nm。

氨基酸的下降率計(jì)算公式如下：

定性、定量分析：根據(jù)17種氨基酸單標(biāo)的出峰時(shí)間對(duì)氨基酸進(jìn)行定性；采用外標(biāo)法定量。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2019和SPSS 22.0軟件處理數(shù)據(jù)，基于Duncan法多重比較檢驗(yàn)，P＜0.05，差異顯著；利用Origin 2018和TBtools v1.098661軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酸性蛋白酶對(duì)醬醪蛋白酶活力的影響

由圖1可知，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，酸性蛋白酶活力變化趨勢(shì)相同。發(fā)酵1 d時(shí)，K組和S組的酸性蛋白酶活力分別為74 U/mL和216 U/mL，隨著發(fā)酵時(shí)間在1～10 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，醪液中的酸性蛋白酶活力均迅速下降，酸性蛋白酶活性分別下降至26 U/mL、9 U/mL；發(fā)酵至20 d時(shí)，醪液中的酸性蛋白酶活力已經(jīng)低于檢測(cè)水平，未能檢出。其原因可能是：一方面，添加酸性蛋白酶直接提高了發(fā)酵醪液的酸性蛋白酶活力；另一方面，酸性蛋白酶能夠破壞細(xì)胞間質(zhì)[25]、提高原料被分解的速率，促進(jìn)曲料中蛋白酶分泌到醪液中，從而提高了發(fā)酵初期醪液的蛋白酶活力。有研究指出[8]，蛋白酶會(huì)對(duì)酶系造成一定的影響。在發(fā)酵初期添加酸性蛋白酶，對(duì)醬油發(fā)酵中期（20～40 d）和后期（40～62 d）的蛋白酶活力沒(méi)有影響。

圖1 發(fā)酵過(guò)程中蛋白酶活力的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic changes of protease activities of soy sauce during fermentation process

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，中性蛋白酶活力變化趨勢(shì)相同。發(fā)酵1 d時(shí)，K組和S組的中性蛋白酶活力分別為350 U/mL和747 U/mL，發(fā)酵1～20 d，醪液中的中性蛋白酶活力快速下降到較低水平，分別降低至120 U/mL、122 U/mL；發(fā)酵時(shí)間＞20 d時(shí)，兩個(gè)組別的中性蛋白酶活力雖有波動(dòng)，但基本趨于穩(wěn)定。

添加外源酸性蛋白酶，初期醪液中的酸性和中性蛋白酶活力都明顯提高。K組和S組的蛋白酶活力變化趨勢(shì)與童佳[26]的研究結(jié)果相似；CUI C等[27]的研究結(jié)果表明，在高鹽環(huán)境中，醬油的酸性和中性蛋白酶活力在發(fā)酵前15 d迅速下降，因此，通過(guò)添加酸性蛋白酶可以提高醬醪的酸性和中性蛋白酶活力，從而提高蛋白質(zhì)原料的利用率。

2.2 酸性蛋白酶對(duì)醬醪基本理化指標(biāo)的影響

2.2.1 總酸含量、pH的變化

醬油中的有機(jī)酸主要由乳酸菌等微生物代謝產(chǎn)生[28]，總酸含量的高低可以反映醬油發(fā)酵過(guò)程中微生物的代謝水平。酸可以改變發(fā)酵體系的pH，從而影響微生物的生長(zhǎng)、代謝途徑，以及美拉德反應(yīng)等化學(xué)反應(yīng)[29-30]，對(duì)醬油發(fā)酵有重要影響。

由圖2可知，添加酸性蛋白酶，可以增加醬醪中的總酸含量。在醬醪發(fā)酵前期（1～10 d），K組和S組的總酸含量快速增加；隨著發(fā)酵時(shí)間在10～50 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，總酸含量呈平緩增加的趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為50 d時(shí)，總酸含量均達(dá)到最大值，S組醬醪的總酸含量達(dá)到最大值，為2.44 g/100 mL，K組的總酸含量為1.59 g/mL；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞50 d后，S組總酸含量有所下降，而K組的總酸含量趨于平穩(wěn)。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，K組和S組的總酸含量分別為1.58 g/100 mL和2.16 g/100 mL。

圖2 發(fā)酵過(guò)程中總酸含量及pH的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of total acid contents and pH of soy sauce during fermentation process

在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，K組和S組的pH值均呈下降趨勢(shì)，在發(fā)酵時(shí)間為1 d時(shí)，K組的pH為5.36，S組的pH為5.47；隨著發(fā)酵時(shí)間在1～6 d范圍內(nèi)的增加，pH值呈快速下降的趨勢(shì)；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞6 d時(shí)，pH均緩慢下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，K組和S組的pH分別為4.68和4.50。這與文獻(xiàn)報(bào)道的研究結(jié)果相似[31-32]。

當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞10 d，與K組相比，S組的總酸含量較高，pH較低。結(jié)果表明，通過(guò)在醬油發(fā)酵初期加入外源酸性蛋白酶，可以使發(fā)酵體系的微生物活力更加旺盛，尤其是提高了乳酸菌等產(chǎn)酸微生物的代謝速率；可以加速發(fā)酵體系形成更適合酵母菌生長(zhǎng)的酸性環(huán)境[19]，從而影響醬油發(fā)酵體系的菌落結(jié)構(gòu)。

2.2.2 氨基酸態(tài)氮含量的變化

由圖3可知，在發(fā)酵前期（1～10 d），K組的氨基酸態(tài)氮含量快速增加；隨著發(fā)酵時(shí)間在10～50 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，K組的氨基酸態(tài)氮含量緩慢上升；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為50 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量達(dá)到0.96 g/100 mL；發(fā)酵時(shí)間＞50 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量變化趨于平穩(wěn)，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其含量為0.97 g/100 mL。

圖3 發(fā)酵過(guò)程中氨基酸態(tài)氮含量的動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of amino nitrogen contents of soy sauce during fermentation process

在發(fā)酵前期（1～10 d），S組的氨基酸態(tài)氮含量快速增加；隨著發(fā)酵時(shí)間在10～50 d范圍內(nèi)的延長(zhǎng)，S組的氨基酸態(tài)氮含量一直緩慢上升；發(fā)酵時(shí)間＞50 d時(shí)，氨基酸態(tài)氮含量出現(xiàn)下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，其含量為1.13 g/100 mL。

整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，添加外源酸性蛋白酶組（S）的氨基酸態(tài)氮含量均高于未添加蛋白酶組（K）。外源酸性蛋白酶的加入，提高了醬醪的酸性蛋白酶活力，使曲料中蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)被分解得更徹底，從而提高了氨基酸態(tài)氮含量[31]；但是到了發(fā)酵后期（50～62 d），氨基酸態(tài)氮含量有所下降的原因可能是，一方面豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)促進(jìn)了醬醪微生物的生長(zhǎng)代謝、提高了氨基酸態(tài)氮的消耗速率，另一方面蛋白酶活力較低、氨基酸態(tài)氮生成速率降低，此時(shí)氨基酸態(tài)氮的消耗速度大于生成速度[31-33]。

2.3 酸性蛋白酶對(duì)游離氨基酸的影響

2.3.1 游離氨基酸含量的動(dòng)態(tài)變化

為了進(jìn)一步研究添加外源酸性蛋白酶對(duì)醬油發(fā)酵的影響，對(duì)醬油釀造過(guò)程中17種游離氨基酸的含量變化進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，S組在發(fā)酵時(shí)間為1～20 d時(shí)，除精氨酸和酪氨酸外的15種游離氨基酸含量不斷積累上升；發(fā)酵在20 d時(shí)，S組總游離氨基酸含量達(dá)到最高值，為64.56 g/L；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間在20～62 d范圍內(nèi)，S組總游離氨基酸含量從發(fā)酵20 d的64.56 g/L下降至55.75 g/L，下降率約為13.64%，谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、精氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸含量顯著下降（P＜0.05），其中谷氨酸含量由11.13 g/L降至1.26 g/L，甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸含量顯著上升（P＜0.05），其他5種游離氨基酸的含量無(wú)顯著變化。發(fā)酵初期添加酸性蛋白酶促進(jìn)了游離氨基酸的生成速率，從而促進(jìn)微生物生長(zhǎng)[34]，可能改變了醬醪微生物的菌群結(jié)構(gòu)和代謝速率，影響氨基酸的含量及組成。醬油發(fā)酵過(guò)程中谷氨酸含量下降可能是由于醬油發(fā)酵過(guò)程中，谷氨酸和丙酮酸可以反應(yīng)生成丙氨酸、α-酮戊二酸[35]；谷氨酸脫羧酶生成能將谷氨酸脫羧產(chǎn)生γ-氨基丁酸[12]；谷氨酸在酸性條件下不穩(wěn)定能夠轉(zhuǎn)化為焦谷氨酸[36]。

圖4 發(fā)酵過(guò)程中游離氨基酸含量變化的熱圖Fig.4 Heatmap of changes of free amino acid contents in soy sauce during fermentation process

在發(fā)酵時(shí)間為1～40 d內(nèi)時(shí)，K組的氨基酸（酪氨酸、精氨酸、組氨酸除外）含量呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵時(shí)間為40 d時(shí)，17種游離氨基酸總含量達(dá)到最高，總游離氨基酸含量為66.07 g/L。在40～62 d范圍內(nèi)，氨基酸總量下降至63.06 g/L，下降率約為4.55%，纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、脯氨酸含量顯著下降（P＜0.05），蘇氨酸含量顯著上升（P＜0.05），其他氨基酸含量均無(wú)顯著變化（P＞0.05）。

發(fā)酵初期（1～20 d），S組總游離氨基酸含量高于K組，且氨基酸生成速率更高，S組的總游離氨基酸含量在20 d即可達(dá)到最高值（64.56 g/L），而K組的總游離氨基酸含量在40 d時(shí)，達(dá)到最高（66.07 g/L），隨著繼續(xù)發(fā)酵，游離氨基酸總量均下降。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，與K組相比，S組的總游離氨基酸含量減少了11.59%，但S組的甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸（8種）含量顯著增加（P＜0.05），其中丙氨酸含量提高了51.17%，其他7種游離氨基酸含量提高了14.00%～21.35%。與K組相比，S組的谷氨酸、絲氨酸、組氨酸、苯丙氨酸含量顯著減少（P＜0.05），其中谷氨酸含量減少了89.06%，這是導(dǎo)致S組游離氨基酸總含量少于K組的主要原因，若不計(jì)谷氨酸含量，S組另外16種游離氨基酸總含量（54.49 g/L）高于K組（51.55 g/L）。

2.3.2 生醬油呈味氨基酸含量對(duì)比

游離氨基酸對(duì)大豆發(fā)酵食品獨(dú)特滋味和香氣的形成具有重要作用，是醬油特有味道的重要組成部分。為了進(jìn)一步分析添加外源酸性蛋白酶對(duì)醬油品質(zhì)的貢獻(xiàn)，考察外源添加酸性蛋白酶對(duì)醬油中鮮味氨基酸（Asp、Glu）、甜味氨基（Ser、Gly、Thr、Ala）、甜苦味氨基酸（Lys、Pro）、苦味氨基酸（His、Arg、Tyr、Val、Met、Phe、Ileu、Leu）和無(wú)味氨基酸（Cys-Cys）[37-38]的影響，發(fā)酵62 d的生醬油的呈味氨基酸含量見(jiàn)圖5。

圖5 發(fā)酵62 d的生醬油的呈味氨基酸含量Fig.5 Contents of flavor amino acid of raw soy sauce fermented for 62 d

由圖5可知，添加外源酸性蛋白酶使生醬油中的甜味氨基酸含量顯著增加（P＜0.05），增加1.97 g/L，其中甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸均顯著增加（P＜0.05）；甜苦味、無(wú)味氨基酸含量有所增加，分別增加了1.11 g/L、0.69 g/L，苦味氨基酸含量有所減少，減少了0.44 g/L；但鮮味氨基酸顯著下降（P＜0.05），減少了10.64 g/L，其中主要是谷氨酸含量顯著下降（P＜0.05），天冬氨酸含量無(wú)顯著變化?？傮w上呈味氨基酸含量下降，下降了7.31 g/L，這主要是谷氨酸被大量消耗所導(dǎo)致的。由此認(rèn)為，添加外源酸性蛋白酶可能對(duì)醬油在呈味方面的影響較大，在實(shí)際投入生產(chǎn)應(yīng)用中，應(yīng)該關(guān)注其對(duì)醬油滋味的影響。

3 結(jié)論

在發(fā)酵初期添加酸性蛋白酶，可以提高酸性、中性蛋白酶活力，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組酸性蛋白酶和中性蛋白酶活力分別提高2.9倍和2.1倍。發(fā)酵結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組醬油的pH下降至4.50、總酸、氨基酸態(tài)氮含量分別增加36.71%、12.37%；游離氨基酸的總含量降低，主要呈鮮味的谷氨酸含量下降。該研究可為外源酸性蛋白酶在工業(yè)化釀造醬油中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

在高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵初期，額外添加酸性蛋白酶，能夠加快蛋白質(zhì)的分解速率、提高蛋白質(zhì)的利用率、縮短發(fā)酵周期。但是過(guò)量的蛋白酶也可能豐富醬醪的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使耐鹽細(xì)菌、耐鹽酵母等微生物生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，打破醬醪原本的微生態(tài)平衡，導(dǎo)致醬醪的目標(biāo)產(chǎn)物被大量消耗而影響生醬油產(chǎn)品的質(zhì)量。此外，發(fā)酵周期過(guò)短，也不利于醬油風(fēng)味的形成。通過(guò)分析不同階段添加酸性蛋白酶對(duì)高鹽稀態(tài)醬油發(fā)酵的影響以提高原料利用率，降低對(duì)醬油滋味的影響。