徐 敏 沈 磊 黃朝云 楊 英

1武漢大學(xué)中南醫(yī)院綜合醫(yī)療科 湖北 武漢 430071；2武漢大學(xué)第二臨床學(xué)院 湖北 武漢 430071；3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 廣東 廣州 510630

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性為病理特征的神經(jīng)退行性疾病。研究發(fā)現(xiàn)，α-突觸核蛋白的過(guò)度沉積和毒性是導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性的主要原因［1］。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示，約25%的初診PD 患者存在輕度認(rèn)知損害，80%的PD 患 者 最 終 發(fā) 展 為 癡 呆［2，3］。黑 質(zhì) 內(nèi)α-突觸核蛋白（α-synuclein）的沉積以運(yùn)動(dòng)障礙為主要表現(xiàn)，而黑質(zhì)外α-突觸核蛋白的聚集和沉積與PD 的非運(yùn)動(dòng)癥狀相關(guān)［4］。因此，減少α-突觸核蛋白的聚集與沉積可能是延緩和預(yù)防PD 相關(guān)認(rèn)知損害的重要靶點(diǎn)。

水通道蛋白-4（aquaporin-4，AQP4）是類淋巴通路清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)代謝廢物的重要通道蛋白［5-7］。睡眠對(duì)類淋巴通路清除神經(jīng)毒性蛋白如淀粉樣蛋白-β 的影響已在阿爾茨海默病動(dòng)物模型中得到證實(shí)，睡眠狀態(tài)下類淋巴通路的清除效率明顯高于覺(jué)醒狀態(tài)［5，8-10］。然而，睡眠與PD 相關(guān)認(rèn)知損害的關(guān)系尚不明確。既往研究中，快速眼動(dòng)（rapid eye movement，REM)睡眠剝奪（REM sleep deprivation，REMSD）對(duì)PD 患者認(rèn)知功能的影響結(jié)論不一［11-14］。本研究建立PD 大鼠模型及應(yīng)用REMSD干預(yù)，觀察REMSD 對(duì)PD 大鼠認(rèn)知功能的影響；并進(jìn)一步探討REMSD 與PD 大鼠海馬和皮層中α-突觸核蛋白及AQP4 蛋白表達(dá)的關(guān)系，旨在為PD 相關(guān)認(rèn)知損害的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重200～230 g 雄性Sprague-Dawley 大鼠，在室溫22～25 ℃，光照條件為黑暗12∶12（即晚8 點(diǎn)關(guān)燈至早8 點(diǎn)開(kāi)燈）的環(huán)境下飼養(yǎng)，大鼠籠內(nèi)自由獲取水和食物。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單側(cè)立體定向黑質(zhì)內(nèi)注射6-羥多巴 胺（6-OHDA）建 立PD 大 鼠 模 型［15］，假 手 術(shù) 組（sham）以同樣方法立體定向注射抗壞血酸鹽溶液。定向注射后4 周（第28 天），采用旋轉(zhuǎn)試驗(yàn)評(píng)估PD模型是否成功。第29 天，以REMSD 干預(yù)1 周或維持正常睡眠并分為4 組：（1）假手術(shù)組（sham，n=6）；（2）REMSD+假手術(shù)組（sham+REMSD，n=6）；（3）正常睡眠的PD 大鼠組（PD，n=6）；（4）REMSD干預(yù)的PD 大鼠組（PD+REMSD，n=6）。第35 天，所有大鼠進(jìn)行新物體識(shí)別（novel object recognition，NOR）實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取腦行蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光分析檢測(cè)大鼠海馬和皮層中α-突觸核蛋白及AQP4 蛋白的表達(dá)水平。

1.3PD 建模將大鼠以 10% 水合氯醛（350 mg/kg，i.p.）麻醉后固定于立體定位架，選擇左側(cè)黑質(zhì)致密物（SNc）為靶部位行立體定位注射（圖1），坐標(biāo)為前囟后（5.0±0.2）mm，矢狀線左側(cè)（1.7±0.1）mm，顱骨表面下（7.6±0.1）mm［16］。以1 μL/min 速 度 泵 控 注 射4 μL 6-OHDA 5 min（2 μg/μL，8 μg 6-OHDA 溶解于4 μL 0.02%抗壞血酸鹽溶液）（n=12），假手術(shù)以同樣方法注射4 μL 0.02%抗壞血酸鹽溶液（n=12）。

圖1 大鼠顱內(nèi)定位注射6-OHDA 部位示意圖

1.4 PD 模型評(píng)價(jià)立體定向注射6-OHDA 后4 周（第28 天），皮下注射阿撲嗎啡（0.1 mg/kg）誘導(dǎo)大鼠的旋轉(zhuǎn)行為，10 min 后待大鼠旋轉(zhuǎn)穩(wěn)定，記錄30 min 內(nèi)大鼠向毀損對(duì)側(cè)連續(xù)旋轉(zhuǎn)的次數(shù)。每周測(cè)定1 次共4 周，以平均轉(zhuǎn)數(shù)大于7 r/min 的SD 大鼠視為建模成功，同時(shí)觀察其是否伴有震顫、活動(dòng)遲緩、豎毛等異常行為。

1.5 REMSD采用改良多平臺(tái)法［17］進(jìn)行：在裝有15 個(gè)直徑6.5 cm 圓柱形平臺(tái)的水槽（127 cm×44 cm×45 cm）中加水至平臺(tái)高出水面約1 cm，將大鼠隨機(jī)置于平臺(tái)上，水和食物置于水箱頂部的網(wǎng)格上。大鼠在平臺(tái)上站立可進(jìn)入NREM 睡眠，當(dāng)進(jìn)入REM 睡眠時(shí)，全身骨骼肌張力顯著降低、頸部肌張力降低引起節(jié)律性低頭、觸水，從而無(wú)法進(jìn)入REM 睡眠，上述過(guò)程訓(xùn)練1 周。

1.6 NOR 實(shí)驗(yàn)立體定向注射5 周后（第35 天），采用NOR 實(shí)驗(yàn)評(píng)估大鼠的識(shí)別記憶，其特點(diǎn)是與熟悉的物體（樣本物體）相比，大鼠更傾向于與新物體互動(dòng)［18］（如圖2A）。NOR 實(shí)驗(yàn)在安靜的低亮度條件下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)裝置為白色敞口箱（50 cm×40 cm×40 cm），要辨別的物體是白色的斑點(diǎn)杯和彩色的玻璃瓶。正式測(cè)試前，讓所有大鼠熟悉裝置環(huán)境以減少它們對(duì)新環(huán)境（實(shí)驗(yàn)箱裝置環(huán)境）的壓力。適應(yīng)過(guò)程中，允許大鼠在裝置內(nèi)無(wú)物體的情況下自由探索周?chē)h(huán)境，每次10 min，連續(xù)2 d。第2 天熟悉環(huán)境結(jié)束后，裝置內(nèi)加入兩個(gè)相同的物體，再次將大鼠置于實(shí)驗(yàn)裝置中，允許其對(duì)這兩個(gè)相同的物體進(jìn)行10 min 探索。間隔1 h 后，將兩個(gè)樣本物體取出，將其中一個(gè)樣本物體清洗干凈后放回原處，另一相同位置處用一新物體替換。然后將大鼠放回裝置中進(jìn)行5 min 探索。用秒表測(cè)量探索每個(gè)物體的時(shí)間和探索兩個(gè)物體的總時(shí)間。每次試驗(yàn)后，這些物體都用70%的乙醇徹底清洗。安裝在測(cè)試箱上方天花板上的攝像機(jī)記錄大鼠的行為。大鼠在2 cm以內(nèi)的距離將鼻子指向物體和/或用鼻子觸摸物體被視為探索，辨別率定義為T(mén)N/（TN+TF），其中TN 為探索新物體的時(shí)間，TF 為探索樣本物體的時(shí)間。

1.7 組織準(zhǔn)備NOR 實(shí)驗(yàn)后，所有大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射進(jìn)行麻醉（350 mg/kg，i.p.）。斷頭取腦，分離出皮層和海馬組織并置于液氮中冷凍，并在-80 ℃保存用于免疫印跡分析。免疫組化分析時(shí)，大鼠麻醉后經(jīng)心臟快速灌注生理鹽水將血液從心臟血管中清除，然后用4%多聚甲醛（稀釋于0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖鹽水，pH 7.4）繼續(xù)灌注對(duì)腦組織進(jìn)行內(nèi)固定，取出腦組織并立即在4%多聚甲醛中固定至少24 h。然后將樣品脫水并包埋于石蠟中，最后進(jìn)行石蠟切片（從前到后冠狀面切片），切片厚度5 μm。

1.8 蛋白質(zhì)免疫印跡按蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，從海馬和皮層組織中提取蛋白質(zhì)。取蛋白質(zhì)樣品（約20 μg）用12%SDS-PAGE 凝膠電泳分離，在200 mA 下轉(zhuǎn)印到0.45 μm PVDF 膜上1 h，用麗春紅染色以確定轉(zhuǎn)膜效果。室溫下，將轉(zhuǎn)印后的PVDF 膜浸置于濃度為5% 的脫脂牛奶［用含0.1%Tween20 的Tris 緩沖鹽水（TBST）稀釋］中封閉1 h。隨后將膜與一抗在4 ℃下孵育過(guò)夜。一抗為 抗α-synuclein 抗 體（Abcam，Cambridge，MA，USA；1∶1 000 稀釋）和抗β-actin 抗體（Santa Cruz，Dallas，USA，TX，1∶2 000 稀釋）。之后在過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（抗小鼠抗體1∶10 000 TBST 稀釋，KPL，Gaithersburg，MD，USA）中孵育30 min 后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法觀察印跡，通過(guò)光學(xué)密度儀對(duì)膠片上的免疫反應(yīng)條帶進(jìn)行半定量分析。

1.9 免疫熒光石蠟切片經(jīng)3%H2O2室溫淬滅后，在45 ℃1 mol/L HCl 中 孵 育30 min 使DNA 變 性，置于10 mmol/L 檸檬酸鈉緩沖液（pH=6）中，92～98 ℃保存20 min，用于抗原提取。加入一抗（抗AQP4，Abcam，1∶200；或 抗α-synuclein，Abcam，1∶200）在4 ℃下孵育過(guò)夜，然后用過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗小鼠或山羊抗兔二抗（1∶200）在37 ℃下孵育30 min。切片暴露于DAB 和蘇木精染色，同時(shí)制備陰性和陽(yáng)性對(duì)照品，用光學(xué)和熒光顯微鏡觀察切片。采用Image J 圖像分析軟件獲得AQP4 或α-突觸核蛋白免疫染色陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度（IOD）值。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。采用雙因素方差分析評(píng)價(jià)NOR 實(shí)驗(yàn)中各組大鼠對(duì)樣本物體或新物體探索時(shí)間的差異，然后采用Bonferroni 法進(jìn)行多組比較。采用單樣本t檢驗(yàn)來(lái)確定辨別率是否與概率（50%）有顯著差異。所有其他數(shù)據(jù)均采用單向方差分析后再應(yīng)用Bonferroni 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 REMSD 對(duì)4 組大鼠識(shí)別記憶的影響4 組大鼠在訓(xùn)練結(jié)束1 h 內(nèi)探索新物體的時(shí)間均長(zhǎng)于探索樣本物體的時(shí)間，只有假手術(shù)組（sham）大鼠探索新物體和樣本物體時(shí)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（sham組，P＜0.01；PD+REMSD 組，P=0.076）（如圖2B）。4 組大鼠對(duì)新物體辨別率的差異如圖2C 所示，sham 組和PD+REMSD 組大鼠對(duì)新物體的辨別率顯著高于50%（sham 組和PD+REMSD 組，P＜0.05；sham+REMSD 組，P=0.07）。

圖2 REMSD 對(duì)各組大鼠識(shí)別記憶的影響

2.2 REMSD 對(duì)4 組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達(dá)的影響蛋白質(zhì)免疫印跡（圖3）和免疫熒光分析（圖4）結(jié)果顯示，PD 組大鼠皮層（cortex，圖3B 和4B）與海馬（hippocampus，圖3C&4C）中α-突觸核蛋白的表達(dá)水平均顯著高于sham 組（P＜0.01）。PD+REMSD 組大鼠皮層（cortex，圖3B，P＜0.01；圖4B，P＜0.05）和 海 馬（hippocampus，圖3C，P＜0.05；圖4C，P=0.052 3）中α-突觸核蛋白的表達(dá)水平明顯低于PD 大鼠；而sham 組與sham+REMSD 組大鼠皮層和海馬中α-突觸核蛋白的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖3 REMSD 對(duì)各組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

圖4 免疫熒光分析REMSD 對(duì)各組大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白表達(dá)的影響

2.3 REMSD 對(duì)4 組大鼠皮層與海馬中AQP4 表達(dá)的影響如圖5 所示，REMSD 干預(yù)后的PD 大鼠皮層（cortex）和海馬（hippocampus）中AQP4 蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常睡眠的PD 大鼠（圖5B 和5C，P＜0.05）；而sham 組 與sham+REMSD 組 大 鼠 的皮層和海馬中AQP4 蛋白的表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

圖5 REMSD 對(duì)各組大鼠皮層與海馬中AQP4 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，REMSD 干預(yù)后的PD 大鼠其識(shí)別記憶優(yōu)于正常睡眠的PD 大鼠；REMSD 干預(yù)后的PD 大鼠皮層和海馬中α-突觸核蛋白的沉積明顯少于正常睡眠的PD 大鼠。同時(shí)，REMSD 干預(yù)后的PD 大鼠皮層和海馬中AQP4 蛋白的表達(dá)水平明顯高于正常睡眠的PD 大鼠。

α-突觸核蛋白是分子質(zhì)量約14～20 kU 的內(nèi)源性蛋白，定位于突觸前多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)［1］。研究顯示，α-突觸核蛋白的聚集與沉積可致多巴胺能神經(jīng)變性［1］，PD 相關(guān)的認(rèn)知損害與黑質(zhì)外α-突觸核蛋白的聚集與沉積有關(guān)［4］。本研究中，6-OHDA 處理后的大鼠皮層與海馬中α-突觸核蛋白的表達(dá)水平明顯高于假手術(shù)組，提示PD 大鼠建模成功。同時(shí)，PD 大鼠的識(shí)別記憶明顯差于假手術(shù)組，與既往研究的結(jié)果一致［19］，表明α-突觸核蛋白的過(guò)度聚集與沉積與PD 相關(guān)的認(rèn)知損害有關(guān)。

睡眠可調(diào)節(jié)海馬區(qū)神經(jīng)元的可塑性與神經(jīng)發(fā)生，與記憶的編碼和鞏固密切相關(guān)［20，21］。本研究中，REMSD 干預(yù)后的健康大鼠的識(shí)別記憶較正常睡眠的健康大鼠差，但該差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而REMSD干預(yù)后的PD 大鼠的識(shí)別記憶優(yōu)于正常睡眠的PD大鼠。睡眠對(duì)認(rèn)知的影響在阿爾茨海默病動(dòng)物模型中已得到證實(shí)，但REM 睡眠與PD 相關(guān)認(rèn)知損害的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議。有研究［11］報(bào)道，REMSD 和多巴胺D2 受體可調(diào)節(jié)和改善PD 大鼠的識(shí)別記憶；也有研究報(bào)道，REMSD 通過(guò)阻斷多巴胺D2 受體導(dǎo)致PD 動(dòng)物模型產(chǎn)生認(rèn)知損害［12，14］。本研究的結(jié)果提示，REMSD 對(duì)PD 和健康腦認(rèn)知功能的影響可能存在差異，REMSD 對(duì)PD 認(rèn)知功能的影響程度可能與不同的認(rèn)知任務(wù)有關(guān)。

本研究中REMSD 干預(yù)后的PD 大鼠的識(shí)別記憶損害程度輕于正常睡眠的PD 大鼠，與皮層和海馬中α-突觸核蛋白的沉積減少、AQP4 蛋白的表達(dá)增加有關(guān)。如前所述，α-突觸核蛋白的過(guò)度聚集與沉積與PD 相關(guān)的認(rèn)知損害有關(guān)。研究證實(shí)，睡眠可影響類淋巴通路對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)毒性代謝產(chǎn)物的清除［5-10］。睡眠對(duì)類淋巴系統(tǒng)清除神經(jīng)毒性蛋白聚集（如淀粉樣蛋白-β）的影響，在阿爾茨海默病動(dòng)物模型中已得到證實(shí)。AQP4 表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞終足，是類淋巴通路中清除神經(jīng)系統(tǒng)毒性產(chǎn)物（如淀粉 樣 蛋 白-β，tau 蛋 白）的 重 要 通 道 蛋 白［5-7，9，10］。REMSD 是否通過(guò)AQP4 啟動(dòng)類淋巴通路清除α-突觸核蛋白改善PD 相關(guān)的認(rèn)知損害尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，REMSD 可降低PD 相關(guān)認(rèn)知損害，與皮層和海馬中α-突觸核蛋白表達(dá)減少及AQP4 蛋白表達(dá)增加相關(guān)。REM 睡眠及AQP4 蛋白表達(dá)的調(diào)控對(duì)改善PD 相關(guān)認(rèn)知損害的作用與機(jī)制有待進(jìn)一步研究闡明，可能為延緩PD 相關(guān)認(rèn)知損害的進(jìn)展提供新的治療靶點(diǎn)。