利用HRM 功能標(biāo)記檢測黑龍江省水稻種質(zhì)資源抗稻瘟病基因Pi2 的基因型分布

2022-07-28 08:25:28郭震華

北方水稻 2022年3期

郭震華

（1 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所，黑龍江佳木斯 154026；2 國家植物航天育種工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

稻瘟病作為影響最為嚴(yán)重的一種世界性稻作病害，每年可造成水稻減產(chǎn)11%～30%[1]，嚴(yán)重制約著水稻的安全生產(chǎn)。黑龍江省作為北方稻區(qū)的第一水稻大省，水稻的面積和總產(chǎn)均超過全國水稻面積和總產(chǎn)的10%，是全國糧食安全的“壓艙石”和“穩(wěn)壓器”。而黑龍江地區(qū)稻瘟病時有發(fā)生，危害嚴(yán)重，嚴(yán)重時可造成減產(chǎn)15%～20%。稻瘟病在水稻整個生育期內(nèi)及各個部位均可發(fā)生，其中尤以葉瘟影響最為嚴(yán)重。因為稻瘟病復(fù)雜的遺傳背景，快速變異的生理小種，一個新品種在推廣3～5 年左右就可能失去抗性[2]。將生物技術(shù)（分子標(biāo)記輔助選擇及轉(zhuǎn)基因技術(shù)等）應(yīng)用于抗稻瘟病育種中，可以將優(yōu)勢基因聚合到一起，縮短育種年限，加快育種進程。

日本于20 世紀(jì)60 年代最先開始水稻抗稻瘟病基因的分析工作。截至2013 年5 月，共有64 個抗稻瘟病位點，78 個主效基因被報道。其中，Pi2，Piz-t，Pi9，Pia，Pib，Pita，Pid2，pi21，Pi36，Pi37，Pish，Pik，Pikm，Pi5，Pid3，Pb1，Pit，Pikp 等基因均被克隆，并且這些基因成簇的分布在除3 號染色體以外的其它染色體上。

Pi2 最初被定位在6 號染色體的標(biāo)記RG64與RZ612 間[3，4]，繼續(xù)精細定位，通過RG64 和AP22 將遺傳距離定位在0.9 cM 和1.2 cM[5]。由于Pi2 的廣譜抗性，在792 個從中國收集的稻瘟小種中，接近92.45%的小種不能侵染含有Pi2 的資源材料C101A51[6]。同時，C101A51 還抗13 個國家中的36 個稻瘟小種[7]。作為NBS-LRR 一類基因，Pi2 包含3839 bp 和116 bp 兩個內(nèi)含子，cDNA 全長為3332 bp，編碼1032 個氨基酸。在3個LRRs 區(qū)域中，Pi2 與Pi-zt 的編碼氨基酸中存在8 個位點的差異，并且其中僅存在1 個位于xxLxLxx 基序中[8]。

高分辨率熔解曲線（HRM，high-resolution melting curve）技術(shù)是新興的一種基因分型技術(shù)，通過配套的軟硬件系統(tǒng)，可以快速自動監(jiān)測DNA熔解曲線的變化，實現(xiàn)基因分型，分辨率可達單堿基差異，對SSR、SNP 及Indel 等不同類型變異有很好的區(qū)分效果[8]。由于不需要凝膠電泳等步驟，從而真正實現(xiàn)了閉管操作[9]，避免污染的可能。該方法目前已在玉米[10]、大麥[11]及水稻[12]等農(nóng)作物中得到很好的應(yīng)用。筆者擬利用與抗稻瘟病基因Pi2 緊密連鎖的HRM 分子標(biāo)記[13]，對黑龍江水稻種質(zhì)資源進行基因分型，以期明確Pi2 基因在黑龍江水稻中的分布情況，為抗稻瘟病品種的合理利用及選育提供參考，為寒地水稻分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

選取67 份黑龍江省水稻主栽品種及優(yōu)異種質(zhì)資源為本研究供試水稻材料（表1），由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所提供，于2014 年種植于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院佳木斯水稻研究所試驗地中。

表1 實驗所需品種（系）及其來源

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA 提取苗期分別取各試驗材料的新鮮葉片，等量混合，按照McCouch[14]提供的方法進行DNA 的提取。

1.2.2 用于HRM 分析的多重巢式PCR 擴增多重巢式PCR 共包括以下兩輪擴增反應(yīng)：

第一輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液5 μl，外引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，基因組DNA0.5 μl，總體積10 μl，ddH2O 補足。PCR 程序：95 ℃預(yù)變性5 min，35 個循環(huán)，20sec 95 ℃變性，20sec 57 ℃退火，10sec 72 ℃延伸；5 min 72 ℃延伸。擴增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進行。

反應(yīng)結(jié)束后PCR 管加200 μl 雙蒸水，稀釋第一輪產(chǎn)物。

第二輪PCR：2×Power Taq PCR Master Mix母液4 μl，內(nèi)引物F/R（10 μmoL-1）各0.3 μl，第一輪稀釋PCR 產(chǎn)物0.5 μl，20×EvaGreen 染料（Biotium, USA）0.5 μl，內(nèi)外標(biāo)樣各1 μl，最后ddH2O 補足10 μl。擴增程序在Gene-Amp9700 型PCR 儀（Applied Biosystems, USA）上進行。PCR程序：95 ℃預(yù)變性2 min，22 個循環(huán)95 ℃變性20 s，59 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s；最后95 ℃延伸2 min。

1.2.3 利用LightScanner96 系統(tǒng)HRM 分析第二輪PCR 產(chǎn)物中加入20 μL 礦物油（SIGMA公司），將PCR 產(chǎn)物離心轉(zhuǎn)移至HRM檢測板中，2000 rpm 離心2 min，檢查無氣泡，放入LightScanner96 高分辨率熔解曲線分析系統(tǒng)（Idaho Technology Inc, USA）進行HRM檢測，起點溫度為60 ℃，終點溫度為95 ℃，平均15 min 一板PCR 反應(yīng)。反應(yīng)完成后，通過配套的LightScanner Call-IT、Small Amplicon 及LightScanner 分析系統(tǒng)分別進行基因型分析、自動化分析及HRM檢測。

用于PCR 擴增反應(yīng)的引物名稱、序列、位置及片段大小等詳細信息見表2。

表2 檢測Pi2 基因的HRM 標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

對黑龍江水稻種質(zhì)資源進行基因分型。通過兩輪的PCR 反應(yīng)，擴增終產(chǎn)物由于DNA 雙鏈上突變位點的退火溫度（Tm 值）不同，產(chǎn)生不同的峰值，從而區(qū)分不同基因型。

基于Pi2 基因?qū)?yīng)的HRM 標(biāo)記檢測可以看出，灰色曲線為堿基為G 的稻瘟病感性基因Pi2，而紅色曲線為堿基為T 的稻瘟病抗性基因pi2?？梢钥闯?，pi2 因T 堿基氫鍵多于pi2 的G 堿基，其溶解溫度（Tm 值）為79～79.5 ℃，而Pi2 的溶解溫度（Tm 值）為78.5 ℃，明顯低于pi2 的，從而產(chǎn)生不同的峰值，可以清晰的區(qū)分不同基因型（圖1）。由圖2 可以看出，67 份材料的基因型通過不同顏色表示出，其中紅色的為抗性基因pi2 的種質(zhì)資源材料，灰色的為感性基因Pi2 的種質(zhì)資源材料。通過分析比對，67 份種質(zhì)資源中，共有9 份含資源抗性基因pi2，分別為，龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1，僅占參試種質(zhì)資源的13.43%，其余58份為含感性基因Pi2 資源?？梢姡琾i2 抗稻瘟病基因在黑龍江省分布相對較少，需要加強該基因在黑龍江省抗稻瘟病育種的應(yīng)用。

圖1 Pi2 基因的HRM 溶解曲線峰值

圖2 Pi2 基因的HRM 標(biāo)記分型

3 結(jié)論與討論

隨著分子標(biāo)記輔助選擇在育種中的廣泛應(yīng)用，各類分子標(biāo)記不斷出現(xiàn)，而最為準(zhǔn)確的是基于抗性基因本身的序列差異開發(fā)的分子標(biāo)記，稱為功能標(biāo)記（FMs），此類標(biāo)記可以對目標(biāo)性狀表型進行直接反映，對通過重組可能引起遺傳信息的丟失實現(xiàn)有效減少，實現(xiàn)FMs 與目標(biāo)性狀直接關(guān)聯(lián)[15-17]。HRM技術(shù)與常規(guī)PCR 技術(shù)區(qū)別主要在于不再需要凝膠電泳步驟，直接對PCR 產(chǎn)物在管中進行分析，減少實驗步驟，大大縮短實驗時間，提高實驗效率，同時降低了實驗可能存在的污染率。利用該技術(shù)開發(fā)的功能標(biāo)記已在玉米[10]、小麥[18]、大麥[11]及水稻[12]等農(nóng)作物中成功應(yīng)用。本研究所用到的HRM 標(biāo)記是針對基因本身內(nèi)部SNP 位點，利用HRM技術(shù)開發(fā)得到的，一方面作為功能基因標(biāo)記，可以準(zhǔn)確的發(fā)現(xiàn)種質(zhì)間存在的基因差異，同時，基于HRM技術(shù)，又實現(xiàn)了高效快速的優(yōu)點，可以進行大規(guī)模的基因分型及篩查，大大提高了基因檢測及標(biāo)記輔助選擇的效率。

目前已定位的主效抗稻瘟病基因中，一半以上是以基因簇的形式存在于水稻各染色體上。Pi2，Pi9，Pi50，Pigm，Pizh，Piz，Piz-t 與Piz 都是復(fù)等位基因。小粒野生稻含有Pi9，F(xiàn)ukunishiki 含有Pi2/Piz5，二八占含有Pi50。在抗稻瘟病植株中，Pi9 表達不受稻瘟病侵染誘導(dǎo)，并且作為一個廣譜抗稻瘟病基因，已報道Pi9 抗21 個生理小種。據(jù)推測，Pi9 的廣譜抗瘟病性的分子機制的原因是，Pi9 能識別各生理小種的保守分子或不同分子。作為一個廣譜抗稻瘟病基因，Pi2 的親本為C101A51，該品種對來自13 個國家的43 個稻瘟病菌株中的36 個表現(xiàn)高抗[7]。同時，當(dāng)Pi2 基因與Pi1 及Pi4 等其他抗稻瘟病基因聚合時，在不改變后代材料的農(nóng)藝性狀前提下，可以顯著地提高水稻抗稻瘟病頻率，不但可以提高葉瘟的抗性，還可以提高抗穗頸瘟的能力[18-20]。

針對水稻品種稻瘟病抗性而言，單個基因的抗性可能會隨著病原菌生理小種的變化在幾年內(nèi)逐漸喪失，因此通過聚合育種的方法將多個稻瘟病抗性基因?qū)胪黄贩N中，即可抵抗多種生理小種的侵害，從而達到廣譜抗性的目的。本研究中龍粳12、哈99774、龍粳31、龍粳39、龍粳54、龍交10-989、龍粳53、彩及zlm55-1 共9 份種質(zhì)含有pi2 抗性基因，對稻瘟病各生理小種有著較為廣泛的抗性，為抗稻瘟病育種研究提供了有利的種質(zhì)資源。