勞海黎 孫義軍 趙新惠 陳子芳

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的危害人類健康的慢性傳染病，結(jié)核病已成為嚴(yán)重的社會公共衛(wèi)生問題，我國是結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家，年發(fā)病患者居全球前列[1]。早期診斷是結(jié)核病控制的重要環(huán)節(jié)。臨床上細(xì)菌學(xué)陽性是診斷肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但實驗室傳統(tǒng)的痰涂片和培養(yǎng)方法敏感性較低，菌陽率<30%[2-3]，為此其檢測結(jié)果報告對臨床參考價值存在一定的局限性。本文收集277例肺結(jié)核，同時通過 TBAb、TB-SA抗體、T-SPOT.TB和MPB64方法檢測，比較其陽性檢出率，以評價4種免疫學(xué)方法對輔助診斷肺結(jié)核的價值。

資料與方法

一、研究對象

收集2020年1月至2020年12月濱州市結(jié)核病防治院住院肺結(jié)核患者277例(菌陽患者127例，菌陰患者150例)為實驗室組；其中，男性187例，女性90例，年齡18歲—89歲，平均年齡46.32±13.57歲。非結(jié)核肺部疾病患者96例(肺癌36例，肺炎27例，支氣管擴張19例，支氣管哮喘14例)作為對照組，其中，男性62例，女性34例，年齡21歲—76歲，平均年齡41.74±11.62歲。入選的研究對象均知情同意。

二、菌陽和菌陰肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)

菌陽肺結(jié)核為痰涂片或痰培養(yǎng)陽性的肺結(jié)核。菌陰肺結(jié)核為三次痰涂片及一次培養(yǎng)均陰性的肺結(jié)核，①典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X線表現(xiàn)；②抗結(jié)核治療有效；③臨床可排除其它非結(jié)核性肺部疾患；④PPD(5U)強陽性，血清抗結(jié)核抗體陽性；⑤痰結(jié)核菌PCR和探針檢測呈陽性；⑥肺外組織病理證實結(jié)核病變；⑦BALF檢出抗酸分支桿菌；⑧支氣管或肺部組織病理證實結(jié)核病變；具備①～⑥中3項或⑦～⑧條中任何1項可確診菌陰肺結(jié)核。

三、標(biāo)本采集

TBAb、TB-SA抗體和T-SPOT.TB檢測標(biāo)本，由護師分別采集患者的血液約5mL于對應(yīng)的試管中，MPB64方法檢測標(biāo)本，由護師分別采集患者的晨痰約2mL，并及時送檢實驗室檢測。

四、 檢測方法

TBAb、TB-SA抗體檢測血樣，經(jīng)離心半徑10cm，3000r/min離心10min，吸取血清采用酶聯(lián)免疫法檢測，操作方法按試劑盒說明書進行，主要儀器為ALisei免疫分析儀。各T-SPOT.TB檢測血樣分別與RPMl-1640培養(yǎng)液等體積混合稀釋，再輕緩加入Ficoll淋巴液上層，按稀釋后血樣：Ficoll淋巴分離液為2：1，隨后在室溫下(18～25℃)，1000g水平離心22分鐘，再吸取中間層白色、云霧狀外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)并轉(zhuǎn)移至無菌15mL尖底離心管中進行后續(xù)操作。T-SPOT.TB檢測通過酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)，操作按《結(jié)核病實驗室檢測技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化操作示意圖集》[4]。MPB64膠體金檢測，吸取痰液約0.5mL加入等量處理液，消化15分鐘后，直接將膠體金試紙條垂直插入，待標(biāo)本虹吸到C線后，取出15分鐘后判定結(jié)果，實驗操作和結(jié)果判定按試劑盒說明書進行。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

建立Excel數(shù)據(jù)庫收集數(shù)據(jù)，運用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理分析，敏感度、特異度、準(zhǔn)確度((結(jié)核組陽性例數(shù)+對照組陰性例數(shù))/實驗總例數(shù)、陽性預(yù)測值(結(jié)核組陽性例數(shù)/實驗總陽性例數(shù)))和陰性預(yù)測值(對照組陰性例數(shù)/實驗總陰性例數(shù)))，采用(n，%)表示。組間結(jié)果比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4種免疫學(xué)方法檢測結(jié)果比較

277例肺結(jié)核患者，經(jīng)TBAb 、TB-SA抗體、T-SPOT.TB 和MPB64檢測，其敏感度MPB64最高，4種方法敏感度和特異度分別為58.84%，75.0%；72.20%，82.29%；82.67%，88.54%和89.17%、100%。菌陽肺結(jié)核組敏感度均高于菌陰肺結(jié)核組。4種方法敏感度比較，MPB64分別與TBAb、TB-SA抗體和T-SPOT.TB之間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=66.210，P<0.001；χ2=25.587，P<0.001和χ2=4.834，P<0.05)。127例菌陽肺結(jié)核MPB64分別與TBAb、TB-SA抗體和T-SPOT.TB之間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=47.477，P<0.001；χ2=32.738，P<0.001和χ2=24.086，P<0.001)；150例菌陰肺結(jié)核MPB64與TBAb之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.246，P<0.001)，MPB64分別與TB-SA抗體和T-SPOT.TB之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=2.807，P>0.05和χ2=0.176，P>0.05)(見表1、2)。

表1 4種免疫學(xué)方法檢測肺結(jié)核結(jié)果對比分析[n(%)]

二、4種免疫學(xué)方法敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較

4種方法比較， MPB64檢測肺結(jié)核具有較高的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值(見表3)。

表2 4種免疫學(xué)方法檢測菌陽和菌陰肺結(jié)核結(jié)果對比分析[n(%)]

表3 4種免疫學(xué)方法檢測肺結(jié)核5種指標(biāo)結(jié)果對比分析(%)

討 論

多年來，我國結(jié)核病控制工作取得了較大的成效，但疫情下降較為緩慢，發(fā)現(xiàn)率較低是其重要的原因之一。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，結(jié)核病免疫學(xué)檢測技術(shù)已取得較大進展，免疫學(xué)技術(shù)具備了快速、簡便和敏感等優(yōu)點，但由于免疫學(xué)檢測方法被檢測的抗原或抗體不同，以及患者個體免疫功能的不同，導(dǎo)致了各種免疫學(xué)檢測方法的特異度和敏感度存在較大的差異。

國內(nèi)資料報道，TBAb 檢測菌陰肺結(jié)核的敏感度為42.16%～64%，菌陽肺結(jié)核的靈敏度為66.13%～77.8%，特異度為89.06%[5-6]。T-SPOT.TB檢測肺結(jié)核的敏感度為53.0%～77.84%，特異度為79.80%～90%[5,7-8]。TB-SA抗體檢測特異度為74.6%，檢測菌陽和菌陰患者的敏感度分別為91.5%和68.1%[9]。MPB64檢測肺結(jié)核的陽性檢出率為90.0%，鑒定結(jié)核分枝桿菌的敏感性97.86%,特異度為73.91%[10]，報道資料中結(jié)果存在一定差異，可能與選取的研究對象和研究例數(shù)的不同有關(guān)。本研究277例肺結(jié)核患者TBAb 、TB-SA抗體、T-SPOT.TB 和MPB64檢測的敏感度和特異度分別為58.84%，75.0%；72.20%，82.29%；82.67%，88.54%和89.17%、100%，本研究結(jié)果與以上報道的敏感度和特異度較高的結(jié)果相近。MPB64與TBAb 、TB-SA抗體和T-SPOT.TB檢測方法比較具有較高的敏感度和特異度。

目前，結(jié)核病實驗室診斷常用的免疫學(xué)檢測方法，主要為TBAb 、TB-SA抗體、T-SPOT.TB 和MPB64檢測。TBAb和TB-SA抗體檢查，均是將結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白抗原分離純化，點樣并固化在硝酸纖維素膜上，膜上TB抗原捕獲人血清樣品中相應(yīng)的抗體。T-SPOT.TB是以特異性抗原為刺激源，應(yīng)用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)診斷結(jié)核菌感染，結(jié)核菌感染后體內(nèi)長期存在抗原特異性的記憶性T 細(xì)胞, 淋巴細(xì)胞受到抗原刺激分泌細(xì)胞因子(IFN-γ)，此細(xì)胞因子被預(yù)包被的ELISPOT板底PVDF膜上的特異性抗體捕獲，加底物顯色，檢測斑點的形成。TBAb 和TB-SA抗體方法均是檢測患者血樣中的抗體，T-SPOT.TB檢測患者血樣中的抗原，檢測陽性時只能說明機體曾經(jīng)感染或正在感染結(jié)核分枝桿菌，對篩查結(jié)核有一定的價值，但不能診斷為活動性結(jié)核病[11-12]。MPB64是結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原，具有高度免疫原性，是許多應(yīng)用于結(jié)核診斷檢測所使用的特異性抗原，MPB64抗原檢測直接用于檢測來自患者病灶的痰標(biāo)本，具有較高敏感性和特異性[13-14]。

綜上所述，MPB64方法檢測肺結(jié)核的敏感度和特異度較高，對診斷肺結(jié)核具有較大的臨床價值。