王達 馬異峰 馬尚 白萬秋 居文福 時廣利

肺癌是我國大中城市高發(fā)的癌癥之一，在各種惡性腫瘤中，肺癌的死亡率排在第一位，NSCLC大約占肺癌中85%[1-2]。大約75%的NSCLC患者確診時已經(jīng)是晚期(Ⅲ期或Ⅳ期)，其5年生存率不到20%。而早期NSCLC患者(I期或Ⅱ期)，尤其是Ⅰ期患者，其5年生存率可達到80%[3]。因此，目前降低NSCLC患者死亡率的關鍵是早診斷、早治療。微小RNA(miRNA)屬于非編碼RNA，調(diào)節(jié)著人類約三分之一基因的表達[4]。miRNA與癌癥的發(fā)生、發(fā)展相關聯(lián)，并且能夠非常穩(wěn)定地存在于人的血清中[5]。本課題組在前期的研究中發(fā)現(xiàn)血清miRNA-19b在NSCLC患者中異常表達。因此，本課題應用qRT-PCR法測定miRNA-19b在早期NSCLC患者血清中的表達水平，并與目前臨床常用的腫瘤標志物癌胚抗原(CEA)和細胞角蛋白(Cyfra21-1)比較，探討其在早期NSCLC輔助診斷中的臨床應用價值。

資料與方法

一、對象

病例組為2019年10月至2020年6月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院胸外科經(jīng)病理組織學確診的初治早期NSCLC(I期和Ⅱ期)患者100例，其中男性和女性患者各50例，男性患者年齡35～72歲(平均58.2歲)、女性患者年齡35～67歲(平均51.1歲)；其中腺癌患者82例、鱗癌患者18例、I期患者83例、Ⅱ期患者17例。根據(jù)國際癌癥聯(lián)合協(xié)會(UICC)制定的標準進行NSCLC分期。健康人對照組為首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院體檢健康職工50名，其中男性和女性各25名，男性年齡45～60歲(平均55.6歲)、女性年齡46～60歲(平均51.5歲)。所有研究對象無急性感染，無心臟病史，無高血糖、高血壓等疾病，所有NSCLC患者既往未經(jīng)過放療或化療。

二、標本采集和處理

抽取100例早期NSCLC患者和50名健康人空腹外靜脈血3mL(非抗凝)，室溫靜置30min，離心20分鐘(3000轉(zhuǎn)/分)。然后提取血清1.5mL, -80℃超低溫冰箱凍存。本研究經(jīng)北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所倫理委員會審核通過(倫理號：科研2020-20)。

三、研究方法

1.血清樣本miRNA的提?。菏褂肦NA提取試劑盒(北京天根公司，型號：DP430)提取血清中的總miRNA，并用紫外分光光度計檢測miRNA純度，具體操作方法參照試劑盒說明書。

2.逆轉(zhuǎn)錄：使用miRNA第一鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京天根公司，型號：KR118-02)進行提取后的miRNA逆轉(zhuǎn)錄，反應體系為20ul，具體操作方法參照試劑盒說明書。

3.qRT-PCR：采用SYBR Green熒光法，使用北京天根生化公司生產(chǎn)的qRT-PCR試劑盒(型號：FP205-02)。應用ABI7500PCR擴增儀進行qRT-PCR，反應體系為20ul，以U6作為內(nèi)參照。PCR反應擴增條件：94℃預變性2分鐘，然后94℃20秒、60℃34秒、共進行45個循環(huán)，miRNA-19b的相對表達量以2-ΔCt表示，反應體系(見表1)。

表1 qRT-PCR反應體系

4.血清CEA和Cyfra21-1的檢測：釆用流式熒光免疫法，應用血清CEA、Cyfra21-1測定試劑盒和流式點陣儀完成(上海透景公司，型號：TESMI)，具體操作方法參照試劑盒和儀器說明書。

四、統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以中位數(shù)(M)和四分位數(shù)間距(IQR)表示，采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。組間數(shù)據(jù)比較采用秩和檢驗，應用受ROC判斷miRNA-19b在早期NSCLC中的臨床應用價值，組間率的比較采用χ2檢驗，P<0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、血清miRNA-19b、CEA、Cyfra21-1在早期NSCLC中的相對表達量

如表2～4所示，血清miRNA-19b在早期NSCLC患者中的表達水平顯著高于健康人對照組，差異有顯著統(tǒng)計學意義(Z=9.532,P<0.001)；血清miRNA-19b在肺腺癌中的表達水平與肺鱗癌比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.920,P>0.05)；血清miRNA-19b在I期NSCLC中的表達水平高于Ⅱ期，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.418,P<0.05)。血清CEA在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.490,P>0.05)；血清CEA在肺腺癌中的表達水平高于肺鱗癌，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.221,P<0.05)；血清CEA在I期NSCLC中的表達水平與Ⅱ期比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=1.326,P>0.05)。血清Cyfra21-1在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(Z=0.157,P>0.05)；血清Cyfra21-1在肺鱗癌中的表達水平高于肺腺癌，差異有統(tǒng)計學意義(Z=3.158,P<0.01)；血清Cyfra21-1在Ⅱ期NSCLC中的表達水平高于I期，差異有統(tǒng)計學意義(Z=2.299,P<0.05)。

表2 血清miR-19b在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

二、血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性和特異性

表3 血清CEA在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

表4 血清Cyfra21-1在早期NSCLC中的相對表達量M(IQR)

如表5所示，血清miRNA-19b在早期NSCLC中的敏感性(63.0%)顯著高于CEA和Cyfra21-1的敏感性(4.0%和9.0%)，差異均具有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)，特異性無明顯差異。

表5 血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性和特異性

三、血清miRNA-19b、CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的診斷價值

如圖1～3所示，ROC曲線分析顯示，miRNA-19b在早期NSCLC中的診斷價值明顯好于CEA和Cyfra21-1。血清miRNA-19b的曲線下面積(AUC)為0.978,95%置信區(qū)間(CI)：0.95～1.000；CEA的AUC為0.525,95%CI：0.421～0.628；Cyfra21-1的AUC為0.492,95%CI：0.386～0.598。

圖1 血清miRNA-19b在早期NSCLC中的ROC曲線

討 論

目前, 肺部CT檢查大大提高了肺癌篩查的陽性率，但是螺旋CT在區(qū)分良性和惡性微結(jié)節(jié)方面準確率不高[6-7]。肺癌相關血液腫瘤標志物的檢測相比其它方法(肺部CT、支氣管鏡等)具有取材方便、創(chuàng)傷性小、成本低廉的優(yōu)勢。我國制定的肺癌診療規(guī)范建議CEA、SCC、Cyfra21-1可用于NSCLC的診斷、療效監(jiān)測和預后判斷[8]。但是，這些腫瘤標志物在早期NSCLC診斷中的敏感性比較低，只有10～20%[9]。因此，目前迫切需要尋找敏感性和特異性都比較好的肺癌腫瘤標志物來發(fā)現(xiàn)更多的早期NSCLC患者，從而降低肺癌的死亡率。

圖2 血清CEA在早期NSCLC中的ROC曲線

圖3 血清Cyfra21-1在早期NSCLC中的ROC曲線

miRNA屬于單鏈非編碼小RNA的一種，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有致癌和抑癌的不同作用，miRNA有可能成為新的與肺癌早期進程相關的腫瘤標志物[10-11]。關于血清中miRNA的來源，目前認為主要是由壞死或凋亡的細胞釋放入血，或者來自于腫瘤細胞釋放的內(nèi)源性miRNA進入外周血[5]。有研究顯示，NSCLC患者血清miRNA-133b的相對表達量低于健康人對照組(P<0.05)，而血清miRNA-150的相對表達量高于對照組(P<0.05)，這2個指標聯(lián)合在肺癌檢測中的敏感性為76.6%、特異性為73.3%[12]。張幫林等[13]的研究結(jié)果也表明，NSCLC患者血清miRNA-145的相對表達量低于健康人對照組(P <0.01)，而血清miRNA-21和miRNA-197的相對表達量高于對照組(P<0.01)，聯(lián)合這3個指標在肺癌檢測中的敏感性為91.58%、特異性為79.86%。安志杰等[14]的研究結(jié)果顯示，miRNA-155和miRNA-625在NSCLC患者血漿中異常表達，其敏感性為75.51%和73.47%。目前的這些外周血miRNA與肺癌的相關研究提示，血清中miRNA的表達水平與肺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，并且在肺癌的早期形成階段，miRNA有可能就參與其中，發(fā)揮著關鍵性的作用。但是目前這些研究的主要研究對象是晚期NSCLC(Ⅲ期和Ⅳ期)患者，而早期NSCLC(I期和Ⅱ期)患者較少，并且未發(fā)現(xiàn)有血清miRNA-19b與早期NSCLC相關研究的報道。

本研究的實驗結(jié)果顯示，血清CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC患者中的表達水平與健康人對照組比較無顯著差異(P>0.05)，并且CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的敏感性只有4.0%和9.0%，說明CEA和Cyfra21-1在早期NSCLC中的診斷價值不高。而血清miRNA-19b在早期NSCLC患者中的表達水平顯著高于健康人對照組(P<0.001)。血清miRNA-19b在早期NSCLC中的敏感性為63.0%、特異性為98%，顯著高于CEA和Cyfra21-1的敏感性(P<0.001)。ROC曲線分析顯示，血清miRNA-19b的AUC達到了0.978，明顯高于CEA(AUC：0.525)和Cyfra21-1(AUC：0.492)，說明血清miRNA-19b在早期NSCLC中的診斷價值明顯好于CEA和Cyfra21-1。以上研究結(jié)果表明，血清miRNA-19b在早期NSCLC輔助診斷中的價值顯著優(yōu)于CEA和Cyfra21-1，有可能成為早期NSCLC篩查的參考指標，具有非常大的潛在臨床應用價值。