高衛(wèi)衛(wèi) 鄧常文 朱曉萍

2020年10月14日，世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布了《2020年全球結核病報告》，全球結核菌潛伏感染人群接近20億，結核(tuberculosis, TB)病仍是全球前10位死因之一，是人類面臨的公共衛(wèi)生挑戰(zhàn)[1]。TB的重要病理特征是人感染結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, Mtb)后，在肺部形成結核性肉芽腫，結核性肉芽腫由先天性和適應性的宿主免疫細胞共同組成，其通常由壞死性酪蛋白為中心，周圍包繞失去吞噬能力的上皮樣細胞及多核巨細胞以及外圍由一層淋巴細胞、成纖維細胞、中心粒細胞和自然殺傷細胞圍繞組成[2]。CD4+T淋巴細胞是結核性肉芽腫參與獲得性免疫反應的主要細胞，在結核性肉芽腫的適應性免疫應答中處于核心地位，它通過不同的細胞亞群參與結核的免疫反應[3]。機體主要通過效應T細胞(effector T cell, Teff)發(fā)揮免疫防御作用，該防御反應在遏制Mtb的進一步擴散中起重要作用，但同時也會因較強的免疫防御反應對肉芽腫造成附帶損害[4]，因此，需要免疫調節(jié)細胞——調節(jié)性T(regulatory T cell, Treg)細胞參與的免疫抑制反應。Treg是具有免疫抑制功能的CD4+T細胞亞群，主要通過抑制Teff的功能發(fā)揮免疫調節(jié)作用。近年來，越來越多的研究結果表明Treg在調節(jié)結核性肉芽腫的免疫穩(wěn)態(tài)中起重要作用。因此，進一步認識Treg在結核性肉芽腫中的免疫調控作用，對闡述結核病的發(fā)病機制有重要作用。本文通過對Treg細胞的功能及其在結核性肉芽腫中的免疫調節(jié)作用進行總結與分析，闡述Treg細胞在TB發(fā)病機制中的研究進展，以期為結核病的發(fā)病機制和診療提供新的思路。

Treg細胞的簡述

受抗原及細胞因子的刺激，初始CD4+T細胞進一步分化為Th1、Th2、Th17與Treg細胞，從而發(fā)揮不同免疫功能。Treg是一種具有獨特免疫調節(jié)功能的T淋巴細胞亞群，它通過抑制Teff及抗原提呈細胞等多種免疫細胞的功能，發(fā)揮免疫抑制作用，盡管Treg細胞僅占外周血T細胞的3%～5%，但它的免疫抑制功能對維持機體的免疫平衡、調節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)和防止過度免疫損傷非常重要。根據(jù)其發(fā)育來源的不同，Treg可分為兩大類：胸腺Treg(tTreg)也經(jīng)常被稱為自然調節(jié)性T細胞(nTreg)，它們起源于胸腺，另一類是外周誘導Treg(pTreg/iTreg)，是由T細胞活化過程中在外周產(chǎn)生[4]。nTregs/tTregs可以全身性地維持耐受性和體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，但pTreg/iTregs則主要針對局部過度的炎癥反應。叉頭狀/翼狀螺旋轉錄因子P3(Foxp3)是Treg細胞最特異的標記物和主要的調節(jié)轉錄因子，是Treg實現(xiàn)其免疫調節(jié)作用的關鍵因子[2，5]。

Treg細胞在Mtb感染過程中的作用

Mtb感染機體的結局因宿主免疫反應的不同而不同。進入肉芽腫內(nèi)的Mtb一部分被單核巨噬細胞、NK細胞等天然免疫細胞識別及消滅，同時具有抗原提呈功能的細胞，如抗原提呈細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞將信號提呈給適應性免疫細胞(主要為T、B淋巴細胞)啟動適應性免疫反應殺滅Mtb，但也可能造成肉芽腫的自身免疫損傷。結核性肉芽腫怎樣調動較強的免疫反應來有效地控制Mtb播散，而又不會造成肉芽腫的自身免疫損傷，這就體現(xiàn)了免疫平衡的重要性。Treg細胞參與結核性肉芽腫的免疫調控，對維持結核肉芽腫免疫穩(wěn)態(tài)必不可少。

一、Mtb感染的動物模型Treg細胞的作用研究

大量Mtb感染的動物研究結果表明，與正常對照組相比，在Mtb感染的動物模型外周血中Treg水平明顯升高，同時，Treg細胞水平表達量及作用，因疾病感染時期的不同而不同。Liu等[6]分別通過M.bovis和BCG感染小鼠的體內(nèi)實驗研究結果顯示，BCG感染小鼠體內(nèi)Treg水平是空白對照組的2倍，而M.bovis感染的小鼠體內(nèi)Treg水平，相當于空白對照組的2.5倍。Ozeki等[7]通過單克隆抗體干預Treg細胞的小鼠研究發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，實驗組小鼠在Mtb感染的第3周，Mtb負荷量及肺部肉芽腫的形成最多，而在感染的第5周，Mtb負荷量及肺部肉芽腫的形成與對照組相仿，說明Treg在Mtb感染的早期對機體控制感染是不利的，但到后期，其免疫抑制作用逐漸消失。Shafiani等[8]通過李斯特菌感染的小鼠模型的研究結果支持Ozeki等的研究，他們發(fā)現(xiàn)，Mtb感染的小鼠外周血Tregs的增殖也是在Mtb感染后的第3周達到高峰。Cardona等[9]通過給C3HeB/FeJ小鼠口服接種熱滅活的M.manresensis(非結核分枝桿菌的一種類型)，2周后發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)Tregs水平明顯增加，而且Tregs通過在肺部產(chǎn)生IL-10從而降低肺部肉芽腫浸潤和促炎因子(TNF-α，IFN-γ，IL-6和IL-17)的產(chǎn)生從而減輕肺部炎癥反應。IL-35是一種抑制炎癥的細胞因子，主要由Treg細胞產(chǎn)生，Chen等[10]通過牛分枝桿菌BCG感染的小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，Mtb感染小鼠外周血、脾臟、骨髓和肺組織單核細胞中IL-35的Ebi3和p35(編碼IL-35的基因)的mRNA表達升高，并且IL-35的水平隨Th1/Th17的下調和Foxp3+Treg水平的增加而增加，從而間接說明Mtb感染可導致機體Treg細胞水平升高。Treg不產(chǎn)生IL-2，但IL-2在Treg的發(fā)育和增殖方面發(fā)揮重要的作用，補充IL-2能顯著增加Treg細胞水平[11]，Chen等[12]通過IL-2干預慢性Mtb感染期的獼猴動物實驗發(fā)現(xiàn)，實驗組動物體內(nèi)Tregs水平增加，同時肺部病理炎癥反應減輕，這表明在慢性Mtb感染過程中，高水平的Tregs有助于控制過度的Mtb引起的炎癥反應。上述大量的動物研究結果均表明，Treg細胞參與Mtb的體內(nèi)免疫反應，同時，Treg參與Mtb的免疫反應因感染的不同時期其發(fā)揮的免疫作用不同，主要表現(xiàn)為在Mtb感染早期，對機體免疫功能的抑制，這對控制Mtb播散是不利的，但該免疫抑制功能到感染后期，其作用逐漸消失。所以，通過檢測Tregs的表達量有望為結核病診斷以及評估結核病感染的不同時期提供依據(jù)。

二、人體Mtb感染研究中Treg細胞的作用

與動物實驗研究結果一致，大量的臨床研究結果顯示，Mtb感染可導致結核患者外周血Tregs水平明顯增加，同時，Tregs水平的表達量隨Mtb細菌負荷量增加而增加。Ritika等[13]通過流式細胞學技術檢測腸結核與克羅恩病患者外周血Treg細胞的對比研究結果顯示，腸結核患者外周血Tregs水平相當于克羅恩病患者外周血Tregs水平的2倍(40.9%vs.24.9%)，同時外周血Tregs水平比例>31.35%對腸結核的診斷敏感性和特異性分別為83%和82.6%。He等[14]的臨床研究發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，肺結核患者外周血中Tregs水平明顯增加，同時，痰培養(yǎng)或痰涂片陽性患者外周血Tregs明顯高于培養(yǎng)或涂片陰性的患者，而隨著抗結核治療、細菌負荷量減少，Tregs也隨之下降，說明Tregs水平隨Mtb細菌負荷量增加而增加。Semple等[15]的進一步研究結果顯示，活動性肺結核患者外周血及支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)中Tregs水平均高于潛伏結核病患者。Ahmed等[16]的研究結果發(fā)現(xiàn)，雖然肺結核患者和健康對照組外周血Tregs水平無差異，但肺結核患者Treg免疫抑制功能明顯強于對照組。高齡是罹患結核的高危因素之一，Namdeo等[17]通過老年肺結核的臨床研究表明，老年人易感肺結核是因其外周血Treg數(shù)量的增加后抑制Mtb特異性效應T(Th1)細胞的免疫功能而導致。以上人體研究均表明，Mtb感染可誘導外周血Treg細胞水平增加，從而參與結核的免疫調節(jié)，所以，通過檢測患者外周血Treg細胞水平可能成為結核病診斷與鑒別診斷的一種新方法[18]。Tregs水平不僅在結核患者的外周血中升高，有研究發(fā)現(xiàn)，在同一結核患者體內(nèi)，Tregs在結核靶病灶中的表達量的明顯高于外周血。大量的研究發(fā)現(xiàn)[19-20]，結核患者體內(nèi)靶病灶處(結核性胸膜炎患者的胸水和肺結核病灶處)Treg細胞水平，他們發(fā)現(xiàn)，相對于外周血，Tregs水平在結核性胸膜炎患者胸水和肺結核病灶處支氣管肺泡灌洗液中的表達量均高于外周血。Sahmoudi等[21]通過淋巴結結核患者的研究同樣支持上述觀點，他們發(fā)現(xiàn)淋巴結結核患者淋巴結中Tregs水平高于外周血，靶病灶中Treg的升高，進一步說明Treg在參與局部炎癥反應中具有重要作用。結核性肉芽腫是結核病的典型病理結果，也是機體在Mtb感染后各類細胞參與形成的免疫微環(huán)境，其主要的病理特征為滲出、增殖及壞死，不同的病理表現(xiàn)形式，其參與該肉芽腫的不同免疫細胞不同，Treg作為一類重要的免疫調節(jié)細胞，其最主要的機制是抑制效Teff的功能，所以，以Treg細胞在結核性肉芽腫局部微環(huán)境的免疫調控為突破口，針對結核性肉芽腫Treg表達量、Treg細胞功能以及Treg/Teff比例的研究有望為結核病發(fā)病機制的進一步研究提供思路。

Treg細胞參與結核免疫的具體機制

近幾年，Treg在抗TB作用的機制被廣泛研究，其中最主要的機制是抑制Teff的功能。在TB的免疫反應中，Teff及Treg細胞向病理部位的募集并參與TB的炎癥反應對TB的免疫調節(jié)至關重要，Treg/Teff的平衡決定局部處于促炎狀態(tài)或抑炎狀態(tài)，最終決定著感染的結局[22]。Sharma等[23]通過研究不同類型肺結核患者發(fā)現(xiàn)，Treg對Teff的抑制作用，可能決定結核的不同臨床表現(xiàn)，如局限型表現(xiàn)形式為主的結核性胸膜炎、淋巴結結核，播散型的表現(xiàn)形式的血行播散型肺結核。Treg對Teff的抑制作用可歸納為以下四類[2]：①促使Teff細胞凋亡；②通過釋放抑炎因子抑制Teff細胞功能；③直接接觸殺傷Teff細胞；④調節(jié)DC成熟和/或功能的改變間接殺傷Teff(見圖1)。

圖1 Treg抑制Teff功能的具體機制

Treg對Teff的抑制作用可歸納為以下四類：①促使Teff細胞凋亡；②通過釋放抑炎因子抑制Teff細胞功能；③直接接觸殺傷Teff細胞；④調節(jié)DC成熟和/或功能的改變間接殺傷Teff。

一、促使Teff細胞凋亡

抗凋亡細胞因子誘導的Akt1信號通路是細胞抗凋亡的重要機制[24]，Treg通過促使凋亡蛋白Bad活性增強從而促使Teff細胞凋亡。正常情況下，Teff的程序性凋亡受其細胞內(nèi)凋亡蛋白Bad控制，磷酸化的Akt1能有效地使凋亡蛋白Bad失活從而保持細胞存活。Pandiyan等[25]的體外細胞實驗結果顯示，體外共培養(yǎng)Treg與Teff細胞后72小時后，通過電子顯微鏡觀察到Teff細胞大量凋亡(細胞核濃縮和細胞膜“起泡”現(xiàn)象)及細胞免疫學功能的改變(Teff細胞表面活性蛋白CD25+表達量減少)，說明，Treg可促使Teff細胞凋亡，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Treg通過促使凋亡蛋白Bad的活性增強從而促使Teff細胞凋亡。Gao等[26]通過體外肝癌細胞試驗發(fā)現(xiàn)，Treg通過競爭性消耗Teff細胞生長因子IL-2而導致Teff凋亡，Treg細胞不產(chǎn)生IL-2，但它可通過高表達IL-2受體α競爭性消耗Teff細胞生長因子IL-2而使Teff因缺乏生長因子而凋亡。因此，進一步研究結核性肉芽腫免疫微環(huán)境中Treg與Teff的相互作用、Treg/Teff平衡狀態(tài)，以及共培養(yǎng)中Treg與Teff功能的變化，可能為進一步研究Treg在結核的免疫微環(huán)境中的作用提供研究方向。

二、通過釋放抑炎因子抑制Teff細胞功能

Treg細胞在參與TB的免疫反應中，能分泌大量的抑制性細胞因子，主要包括白細胞介素10(interleukin 10, IL-10)、IL-35和轉化生長因子β(transforming growth factor β, TGFβ)等[2,16,27]。該三類炎癥因子均具有維持Treg內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的作用。IL-10主要通過抑制促炎因子IFN-γ和TNF-α，下調抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)MHC-Ⅱ表達從而減少APC提呈給Teff的信號來抑制Teff的免疫反應。所以，Cardona等[28]的研究提出，可通過調節(jié)體內(nèi)IL-10來調整機體的免疫平衡。Foxp3是Treg實現(xiàn)其免疫功能的重要胞內(nèi)抑制性分子，F(xiàn)oxp3與其表面的抑制性蛋白NFATs形成復合體是Treg調控免疫抑制功能的關鍵。Giri等[29]等通過分離白癜風患者的T淋巴細胞，在體外與Treg細胞共培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)，Treg是通過表達其抑制性蛋白NFATs與Foxp3來抑制CD4+與CD8+T淋巴細胞的功能。Zhang等[30]的研究結果顯示，在Mtb抗原刺激下，F(xiàn)oxp3+Treg細胞在局部肉芽腫組織的高表達同時促使產(chǎn)生IL-35的B細胞浸潤參與肉芽腫的免疫調控。不僅如此，Treg還可表達抑制性分子CD39和CD73參與Teff的抑制功能。CD39是一種外切核酸酶，它將ATP或ADP轉化為AMP，它通過消除炎癥介質ATP和增加腺苷的產(chǎn)生，從而抑制Teff抗炎癥反應中所需要的ATP或ADP從而抑制Teff的功能[31]。Gu等[32]通過分離體內(nèi)CD39hiTregs和CD39lowTregs發(fā)現(xiàn)，CD39hiTregs可以保持穩(wěn)定的Foxp3表達分泌較多的IL-10(TGF-β無變化)而具有較強的抑制活性，而CD4CD39lowTreg失去Foxp3表達并轉分化為Th1或Th17細胞。CD73可上調Teff相應受體-嘌呤能腺苷受體(adenosine-purinergic adenosine receptor, A2A)的表達并與其結合來實現(xiàn)其免疫抑制功能，但具體機制目前仍不清楚。因此，來自CD39敲除小鼠的Treg細胞在體外表現(xiàn)出受損的抑制特性[33]。Treg與Teff在分子水平上的相互作用較為復雜，這也為研究它們在結核分子免疫調控中提供研究空間，通過對上述細胞分子層面上的進一步研究，將為結核分子免疫探究提供理論依據(jù)。

三、直接接觸殺傷Teff

也有少數(shù)研究顯示，Treg可通過直接接觸殺傷Teff細胞來實現(xiàn)其免疫抑制作用。顆粒酶屬于細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞質顆粒中的絲氨酸蛋白酶家族，它們通過穿孔素孔進入靶細胞，裂解并激活細胞內(nèi)胱天蛋白酶，導致靶細胞凋亡。穿孔素是溶酶顆粒的一種成分，參與質膜的透化作用，促使顆粒酶和其他細胞毒性成分進入靶細胞。Gondek等[34]通過體外共培養(yǎng)Treg與Teff實驗發(fā)現(xiàn)，Treg可通過依賴顆粒酶A、顆粒酶B和穿孔素而直接殺傷Teff細胞。Sun等[35]通過在大腸癌的腫瘤微環(huán)境的研究發(fā)現(xiàn)，浸潤于腫瘤微環(huán)境中的Foxp3+Treg除了表達抑制性細胞因子之外，還可高表達顆粒酶B，來減弱促炎細胞的免疫功能從而減輕腫瘤組織的炎癥反映。

四、調節(jié)DC成熟和/或功能的改變間接抑制Teff的功能

樹突狀細胞(dendritic cell，DC)是專業(yè)的抗原提呈細胞 (Antigen-presenting cells, APC)，是調節(jié)先天免疫和適應性免疫反應之間的橋梁細胞，它在啟動和調節(jié)抗原特異性T細胞的免疫反應中起關鍵作用[6]。Treg通過表達共刺激分子如淋巴細胞激活基因-3(LAG3)、細胞毒T淋巴細胞抗原4(CTLA4)、CD80、CD86介導DC誘導吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO)(IDO是一種抑制分子，可以從色氨酸的分解代謝中誘導促凋亡代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生促使細胞凋亡)的產(chǎn)生來調節(jié)DC的成熟和功能的改變間接抑制Teff的功能[36-37]。Oderup等[38]通過使用CTLA4特異性阻斷抗體或缺乏CTLA4的Treg細胞株實驗研究表明，缺乏CTLA4的Treg細胞，DC產(chǎn)生IDO量明顯減少，由DC介導的Teff抑制作用也隨之降低。但Treg的該間接抑制Teff的功能研究較少，可能因Treg該2方面的功能相對較弱，也可能是目前Treg在該方面的研究較少。

綜上所述，大量體外細胞實驗、體內(nèi)動物及臨床研究結果均表明，Treg參與Mtb感染的免疫調控，同時，結合臨床中的一個重要發(fā)現(xiàn)—Treg在靶病灶中表達量明顯高于外周血，我們相信，將結核性肉芽腫的免疫微環(huán)境作為研究對象，通過對該免疫微環(huán)境中Treg的表達量、細胞功能以及Treg/Teff免疫平衡的進一步研究有望為結核病發(fā)病機制研究提供思路。