彭鳳翔，高蓉梅，李永春，葉小娟

(武警四川省總隊(duì)醫(yī)院，四川 樂山614000)

近年來食管狀細(xì)胞癌發(fā)生率有不斷增加的趨勢，其可劃分為鱗狀上皮細(xì)胞癌(ESCC)及腺癌兩種類型，ESCC發(fā)病率高達(dá)90%左右[1]。該疾病在滿足手術(shù)條件時(shí)應(yīng)該優(yōu)先選擇手術(shù)切除治療，可以切除病灶組織，但術(shù)后復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)比較高。尋找預(yù)后相關(guān)基因，預(yù)測ESCC術(shù)后復(fù)發(fā)的發(fā)生，成為了當(dāng)下研究的關(guān)注點(diǎn)[2]。微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)編碼蛋白可用于對細(xì)胞自噬進(jìn)行判斷，在腫瘤的病理變化具有重要的調(diào)控作用[3，4]。叉頭框蛋白Q1(FOXQ1)是結(jié)構(gòu)中有叉頭框結(jié)構(gòu)的高保守轉(zhuǎn)錄因子，其和腫瘤的生物活動(dòng)密切相關(guān)[5]。生存素(Survivin)在腫瘤細(xì)胞凋亡中可起到一定抑制作用，可促進(jìn)腫瘤生長[6]。本文基于蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3、FOXQ1、survuvin表達(dá)對患者行食管鱗癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值，為預(yù)后評(píng)估提供支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料2018年3月至2020年3月我院行手術(shù)治療的86例ESCC患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：①滿足食管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]； ②術(shù)前都沒有給予手術(shù)外的其他治療；③患者不存在精神障礙；④對相關(guān)研究情況知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①精神異常，無法正常交流; ②存在嚴(yán)重的心、腦相關(guān)臟器功能障礙；③同時(shí)進(jìn)行放化療。男62例，女24例，年齡45～80歲。病理組織低、中、高分化分別為30、24、32例；TNM分期Ⅰ～Ⅲ期分別為20、22、44例；腫瘤部位上段36例，中段27例，下段23例；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移56例。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2 方法主要試劑：兔抗人LC3、FOXQ1及Survivin相關(guān)的單抗全部來源于Abcam公司；GAPDH單克隆抗體(上海江萊公司)；對應(yīng)的特異性引物通過上海生工合成，相關(guān)情況見表1。Trizol試劑、DAB試劑盒(上海江萊公司)；BCA試劑盒(北京中科公司)。實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR：采集癌組織、癌旁組織作為樣本，-70 ℃保存。裂解法提取樣本中總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄獲得逆轉(zhuǎn)錄cDNA，條件如下：在 37 ℃培育15 min，85 ℃， 5 s。依據(jù)Direct PCR Kit規(guī)范進(jìn)行擴(kuò)增處理。采用2-△△Ct法測定LC3、FOXQ1、survuvin相對表達(dá)量。免疫印跡法檢測：裂解法提取樣本中總蛋白，經(jīng)凝膠電泳處理后轉(zhuǎn)膜，室溫下封閉1 h后，加入LC3、FOXQ1、survuvin一抗(均進(jìn)行千倍稀釋)后4 ℃搖床培育十二小時(shí)，加入標(biāo)記的二抗后接著根據(jù)要求培養(yǎng)1 h；洗膜，成像對所得影像結(jié)果通過Quantity-one工具處理，確定吸光度，然后把結(jié)果相除計(jì)算出其與GAPDH的比值為相對表達(dá)量。

表1 PT-PCR引物序列

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析；應(yīng)用ROC曲線分析LC3、FOXQ1、survuvin對術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ESCC癌組織中蛋白表達(dá)與癌旁組織相比，癌組織中的LC3 mRNA水平更低，其余兩個(gè)相對表達(dá)量高(P<0.05)。蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果表明，與癌旁組織相比，癌組織中的LC3水平低，而FOXQ1、survuvin兩種蛋白的表達(dá)水平高(P<0.05)。見圖1。腫瘤浸潤深度為T3～T4、分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中LC3蛋白表達(dá)水平低于腫瘤浸潤深度為T1～T2、分化程度為中高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，F(xiàn)OXQ1和survuvin蛋白表達(dá)水平高于腫瘤浸潤深度為T1～T2、分化程度為中高分化、TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期和無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)，見表2。

圖1 食管鱗癌根治術(shù)標(biāo)本LC3、FOXQ1和survuvin表達(dá) a:蛋白表達(dá)圖譜；b:mRNA相對表達(dá)量；c:蛋白相對表達(dá)量

表2 不同臨床病理特征患者癌組織中三種蛋白表達(dá)水平的比較

2.2 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表達(dá)水平比較術(shù)后隨訪12個(gè)月，復(fù)發(fā)患者26例(30.23%)，復(fù)發(fā)患者LC3蛋白水平低于未復(fù)發(fā)者，F(xiàn)OXQ1、survuvin蛋白表達(dá)水高于未復(fù)發(fā)者(P<0. 05)。見表 3。

表3 復(fù)發(fā)和未復(fù)發(fā)患者LC3、FOXQ1、survuvin蛋白表達(dá)水平比較

2.3 LC3、FOXQ1、survuvin對術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測價(jià)值分析LC3、FOXQ1、survuvin及其聯(lián)合檢測預(yù)測食管鱗狀細(xì)胞癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)的AUC分別為0.660、0.704、0.785、0.903，聯(lián)合檢測的AUC最高(P<0.05)。見圖2、表4。

圖2 LC3、FOXQ1、survuvin單獨(dú)應(yīng)用與聯(lián)合應(yīng)用的ROC曲線

表4 LC3、FOXQ1、survuvin三種指標(biāo)及聯(lián)合指標(biāo)的ROC曲線分析

3 討論

食管癌發(fā)生率有不斷增加趨勢，每年都有大量此類患者由于各種原因影響而死亡。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)可知這種疾病在發(fā)病初期階段沒有明顯的病癥，進(jìn)食過程中會(huì)產(chǎn)生異物感。在發(fā)現(xiàn)很明顯梗阻情況下，一般可判斷病情已經(jīng)很嚴(yán)重，進(jìn)入了中晚期[8]。在這種疾病的臨床治療領(lǐng)域，常用的方法為食管癌根治術(shù)，根據(jù)實(shí)際的經(jīng)驗(yàn)可知這種治療方法的優(yōu)勢為創(chuàng)傷小、恢復(fù)快，適用性強(qiáng)，患者接受度高。有的患者會(huì)出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)相關(guān)的問題，這對其療效產(chǎn)生不良影響[9]。近年來一些學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生機(jī)制很復(fù)雜，也受到自噬因素影響[10]。一些學(xué)者研究表明，食管癌腫瘤中自噬現(xiàn)象很普遍，有必要對此進(jìn)行研究[11]。LC3為一種重要的自噬相關(guān)的基因，在檢測自噬水平方面有很高應(yīng)用價(jià)值，也被當(dāng)做為主要的標(biāo)記物[12]。發(fā)生自噬情況下，LC3-Ⅰ被修飾和加工，且結(jié)合自噬膜表面特定的物質(zhì)而形成LC3-Ⅱ，因而可以將其當(dāng)做為一種特定的標(biāo)記蛋白[13]。FOXQ1是重要的轉(zhuǎn)錄因子，其可以通過識(shí)別并結(jié)合下游靶基因的啟動(dòng)子, 在此基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)基因調(diào)節(jié)目的。這種蛋白可利用Wnt/β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲活動(dòng)[14]。survuvin是由細(xì)胞蛋白受體-1cDNA分離出來的，存在于細(xì)胞周期的G2/M期，通過有絲分裂加速細(xì)胞增殖，對其凋亡起到抑制作用，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤病理過程[15]。由此可見，LC3、FOXQ1及survuvin均參與了腫瘤細(xì)胞的各方面病理活動(dòng)，且對病情進(jìn)展有直接決定作用。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，和癌旁組織相比，癌組織中LC3蛋白和mRNA水平下降，而FOXQ1和survuvin的提高。由此可判斷出這三種基因的表達(dá)與這種腫瘤的病理活動(dòng)有關(guān)。本研究分析了LC3、FOXQ1及survuvin表達(dá)水平與腫瘤病理特征的關(guān)系，結(jié)果表明，腫瘤浸潤深度為T3～T4、分化程度為低分化、TNM分期為Ⅲ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者癌組織中LC3蛋白表達(dá)水平明顯降低，F(xiàn)OXQ1和survuvin蛋白表達(dá)水平明顯升高。楊燕[16]對此進(jìn)行研究，其所得結(jié)果發(fā)現(xiàn)LC3蛋白在乳腺癌不同腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中表達(dá)水平存在顯著差異。崔曉海等[17]研究表明，胃癌組織中FOXQ1基因表達(dá)水平明顯提高，且其表達(dá)水平淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤體積、及 TNM 分期等有關(guān)。Shi等[18]研究表明，survuvin表達(dá)與鼻咽癌患者的腫瘤分期、分化和轉(zhuǎn)移等有關(guān)。本研究結(jié)果與上述研究類似，表明LC3、FOXQ1及survuvin表達(dá)水平可以反映食管癌的腫瘤進(jìn)展。在對患者進(jìn)行術(shù)后12個(gè)月隨訪發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)患者LC3蛋白表達(dá)水平明顯降低；FOXQ1、survuvin蛋白表達(dá)水平顯著高于未復(fù)發(fā)者。且通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，LC3、FOXQ1及survuvin三指聯(lián)合檢測靈敏度、特異度最高，對患者行食管鱗癌根治術(shù)后復(fù)發(fā)具有預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，食管鱗狀細(xì)胞癌組織中LC3低表達(dá)，F(xiàn)OXQ1、survuvin高表達(dá)，三者結(jié)合起來可更準(zhǔn)確的進(jìn)行術(shù)后復(fù)發(fā)率預(yù)測，為此類患者的治療提供支持。本研究納入的樣本量少，且未進(jìn)行隨訪研究觀察患者生存情況，進(jìn)行多中心大樣本分析，應(yīng)對這三種基因影響作用的具體分子機(jī)制做進(jìn)一步探究。