趙歐亞， 侯利敏， 孫世友， 茹淑華， 肖廣敏， 王 策， 王 凌， 劉 蕾， 張國印， 李瑞軍

(1.河北省農(nóng)林科學院農(nóng)業(yè)資源環(huán)境研究所/河北省肥料技術(shù)創(chuàng)新中心，河北石家莊 050051；2.河北省饒陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北饒陽 053900)

作為畜禽養(yǎng)殖大國，我國每年的畜禽糞便產(chǎn)生量約為18億t，然而綜合利用率不到60%，這嚴重制約了畜禽糞便資源化循環(huán)利用的步伐，同時糞污不恰當處理會造成嚴重的環(huán)境風險。好氧堆肥技術(shù)可以實現(xiàn)氮磷養(yǎng)分的高效循環(huán)，是有機廢棄物再利用的主要技術(shù)。已有研究發(fā)現(xiàn)，在畜禽糞便堆肥發(fā)酵過程中添加微生物菌劑，發(fā)酵效果明顯好于自然堆肥，可以有效減少糞便中的病原微生物，促進纖維素等難降解物質(zhì)的分解，且腐熟程度更好，同時不同菌劑對糞便堆肥具有不同的效果。也有研究發(fā)現(xiàn)，接種菌劑有利于堆肥中的有機質(zhì)分解、降低氨氣和二氧化碳的釋放濃度，減排作用顯著。目前，大多數(shù)研究集中于不同發(fā)酵菌種對堆肥過程中養(yǎng)分指標變化及大腸桿菌菌落數(shù)、蛔蟲卵數(shù)、發(fā)芽率等有機肥質(zhì)量限制指標的影響，基于高分子通量技術(shù)的畜禽糞便堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)的研究相對較少。徐瑩瑩等通過采用傳統(tǒng)培養(yǎng)與聚合酶鏈式反應(yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)相結(jié)合的方法，研究接種菌劑對牛糞堆肥反硝化細菌群落的影響，結(jié)果表明，接種菌劑后加快了反硝化細菌群落的演替速率，并且從接種菌劑堆肥中檢測到自然堆肥中不存在的反硝化細菌類群。許修宏等采用高通量測序技術(shù)研究牛糞自然堆肥過程中細菌群落的動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)堆肥過程中細菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度在堆肥前期和高溫期較高，酸桿菌門(Acidobacteria)的相對豐度在堆肥后期較高。目前，對接種不同商品發(fā)酵菌劑條件下牛糞堆肥中微生物群落結(jié)構(gòu)變化的研究尚未見報道。因此，本研究采用高通量測序技術(shù)，選取堆肥升溫慢、發(fā)酵周期長、降解難的牛糞作為堆肥原料，以奶牛養(yǎng)殖廠附近小米加工廠所產(chǎn)生的米糠為配料，研究牛糞發(fā)酵過程中添加不同發(fā)酵菌劑對堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，以期為牛糞快速發(fā)酵商品菌劑的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于河北省冀豐動物營養(yǎng)科技有限責任公司進行，牛糞為該公司產(chǎn)生的新鮮糞便，米糠購自該公司附近的小米加工廠。發(fā)酵菌劑編號如下：菌劑A為復合微生物產(chǎn)物，由北京航天恒豐科技股份有限公司生產(chǎn)，包含枯草芽孢桿菌、乳酸桿菌、畢赤酵母、赤熱鏈霉菌等菌種，有效活菌數(shù)≥200億CFU/g，用量為0.10%(質(zhì)量分數(shù))；菌劑B為復合微生物產(chǎn)品，由廣州微元生物科技有限公司生產(chǎn)，其中包含多種芽孢桿菌、酶制劑、酵母菌、絲狀真菌等，有效活菌數(shù)≥200億CFU/g，用量為0.01%(質(zhì)量分數(shù))；菌劑C為有機肥發(fā)酵菌劑，由滄州興業(yè)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，由多種功能性有益微生物組成，如細菌、真菌、放線菌、細黃鏈霉菌和酵母菌，有效活菌數(shù)≥80億CFU/g，用量為0.10%(質(zhì)量分數(shù))；菌劑D為有機肥發(fā)酵菌劑，由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司生產(chǎn)，包含枯草芽孢桿菌、放線菌酵母菌、巨大芽孢桿菌、膠凍芽孢桿菌、里氏木霉、纖維素酶等，有效活菌數(shù)≥100億CFU/g，用量為0.10%(質(zhì)量分數(shù))。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗共設(shè)5個處理，包括對照(不添加發(fā)酵菌劑)、菌劑A、菌劑B、菌劑C和菌劑D，詳見表1，菌種添加量均參照商品使用說明進行添加。每個處理設(shè)3次重復，各處理原料按質(zhì)量分數(shù)配比均為70%牛糞+30%谷糠，碳氮比調(diào)節(jié)在25～35，含水率為60%～65%，混合均勻后將物料進行條垛式堆肥，每個堆體長2～3 m，堆底寬1.5 m、高1.0 m，堆體間的間隔為2～3 m。發(fā)酵周期為60 d，每隔7 d翻堆1次。于2020年5月21日起堆，7月21日結(jié)束。各菌劑按照產(chǎn)品使用說明進行添加，具體用量如表1所示。

表1 不同組別的發(fā)酵菌劑添加量

1.3 測定指標

溫度的測定：將溫度計插入距離堆體頂部 50 cm 處測量溫度，每天10：00、16：00各測量1次，以2次測量的平均值作為當天的堆體溫度，同時記錄周圍環(huán)境溫度。堆肥結(jié)束時采集樣品，測定微生物指標，采樣深度為距堆體頂部50 cm處，采用5點取樣法取樣后混合均勻。委托上海派森諾有限公司進行微生物多樣性的測定，其中真菌群落結(jié)構(gòu)測序所用引物序列為：F，5′-G G A A G T A A A A G T C G T A A C A A G G-3′；R，5′-G C T G C G T T C T T C A T C G A T G C-3′，測序區(qū)域為ITS_V1，方法為DADA2。細菌放線菌測序所用引物序列為：F，5′-A C T C C T A C G G G A G G C A G C A-3′；R，5′-T C G G A C T A C H V G G G T W T C T A A T-3′，測序區(qū)域為16S V3～V4區(qū)，數(shù)據(jù)庫為silva_132，方法為DADA2。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel、SPSS V17.0進行分析，微生物多樣性分析用派森諾基因云軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)酵菌劑處理下牛糞堆肥溫度的變化

如圖1所示，添加發(fā)酵菌劑可以有效提高堆肥溫度。對堆肥過程中溫度變化規(guī)律的分析結(jié)果表明，添加菌劑A(T處理)、菌劑B(T處理)、菌劑C(T處理)、菌劑D(T處理)后，堆肥平均溫度分別較CK處理提高了5.70、2.84、6.33、5.36 ℃。在不同發(fā)酵菌劑處理下，堆肥溫度的增速不同，在CK處理下，堆肥進入高溫期(50 ℃以上)需要9 d；在T處理下，堆肥3 d進入高溫期；在T、T處理下，堆肥進入高溫期均需要5 d；在T處理下，堆肥進入高溫期所需的時間與CK一致。由此可見，在T處理下堆肥的增溫效果最好。

2.2 不同發(fā)酵菌劑處理堆肥中真菌群落結(jié)構(gòu)的變化

2.2.1 豐度與多樣性分析 由表2不同處理下真菌豐度與多樣性可以看出，在不同處理下，真菌高質(zhì)量序列數(shù)量為63 473～67 866條，將經(jīng)過處理的高質(zhì)量序列通過100%相似度的劃分，各處理得到214～285個特征序列(ASV)。在CK處理下，ASV數(shù)量為239個；T處理下的ASV數(shù)量與CK接近；在T處理下，ASV數(shù)量為214，較CK減少10.46%；在T、T處理下，ASV數(shù)量均為285個，比CK處理高19.25%。

表2 不同發(fā)酵菌劑處理堆肥中的真菌豐度與多樣性

Shannon指數(shù)是群落多樣性指標，其值越大，表明群落多樣性越高，反之表明群落多樣性越低。如圖2所示，在添加發(fā)酵菌劑B處理(T)下，真菌微生物多樣性指數(shù)(Shannon指數(shù))顯著低于對照處理、添加其他發(fā)酵菌種處理；同時在CK、T、T、T這4個處理下，真菌微生物多樣性指數(shù)間無顯著差異。

對不同發(fā)酵菌劑處理下堆肥中真菌ASV的組成進行樣本距離矩陣與主坐標分析(PCoA)的結(jié)果顯示，在T處理的樣品與CK最接近，表明添加發(fā)酵菌劑C處理(T)的真菌群落結(jié)構(gòu)與CK間的差異較小，而添加發(fā)酵菌劑A、B、C處理(T、T、T)的菌群落結(jié)構(gòu)與CK處理間的差異較大(圖3)。

2.2.2 分類學組成分析 相對豐度排名前五的真菌門類如圖4所示，分別為子囊菌門，相對豐度為59.35%；擔子菌門，相對豐度為16.48%；被孢霉門、油壺菌門，相對豐度分別為2.33%、2.15%；毛霉門，相對豐度為0.08%；其他門的相對豐度為19.60%。

在牛糞堆肥中添加不同發(fā)酵菌劑后，主要影響子囊菌門、擔子菌門真菌的相對豐度。與CK相比，T、T處理的子囊菌門相對豐度降低，擔子菌門的相對豐度升高；T處理的子囊菌門、擔子菌門的相對豐度均升高；T處理的子囊菌門的相對豐度升高，擔子菌門的相對豐度降低。此外，添加不同發(fā)酵菌劑后，毛霉門的相對豐度均有所升高，升高幅度為0.1～0.4百分點。

圖5為不同發(fā)酵菌劑處理下堆肥中屬分類水平上的真菌群落種組成，可以看出，相對豐度排前10位的屬分別為曲霉菌屬、畢赤酵母菌屬、馬拉色霉菌屬、鏈格孢菌屬、鐮刀菌屬、、節(jié)擔菌屬、、嗜熱子囊菌和被孢霉菌。在牛糞自然堆肥處理下，堆肥結(jié)束后樣品中曲霉菌屬的相對豐度最大，為1361，其次為畢赤酵母菌屬，相對豐度為997，而鏈格孢菌屬、鐮刀菌屬、、節(jié)擔菌屬、、被孢霉菌屬的相對豐度為2.23%～4.25%，馬拉色霉菌屬、嗜熱子囊菌屬的相對豐度均小于1%。

通過分析不同發(fā)酵菌劑處理對堆肥中微生物群落的影響發(fā)現(xiàn)，與CK相比，T處理的堆肥微生物群落結(jié)構(gòu)組成差異較??；在T處理下，堆肥馬拉色霉菌屬的相對豐度顯著增加，且節(jié)擔菌屬、這2個屬的相對豐度降低顯著；在T處理下，畢赤酵母菌屬、嗜熱子囊菌屬的相對豐度增加明顯，增幅為2.39～3.48百分點，且節(jié)擔菌屬的相對豐度下降顯著；在T處理下，各屬相對豐度變化規(guī)律與T處理基本一致，畢赤酵母菌屬、馬拉色霉菌屬、嗜熱子囊菌屬等3個屬的相對豐度增加，其余7個屬的相對豐度均有所下降。

2.3 不同發(fā)酵菌劑處理堆肥中細菌、放線菌群落結(jié)構(gòu)的變化

2.3.1 群落豐富度及多樣性 如表3所示，在各處理下，堆肥樣品通過高通量測序得到83 614～94 552 條細菌、放線菌序列。經(jīng)過處理的高質(zhì)量序列通過100%相似度劃分，得到181～285個特征序列。在未添加發(fā)酵菌劑的CK處理下，ASV數(shù)量為239；在T處理下，ASV數(shù)量與CK接近；在T、T處理下，ASV數(shù)量均低于CK，其中T處理的ASV數(shù)量下降24.27%；在T處理下，ASV數(shù)量為285，比CK處理高19.24%。

表3 不同發(fā)酵菌劑處理堆肥的細菌、放線菌豐度與多樣性

樣品中表示細菌、放線菌微生物群落多樣性的Shannon指數(shù)如圖6所示。與CK相比，T、T、T處理的細菌、放線菌微生物多樣性降低，T處理的細菌、放線菌微生物多樣性高于CK。

2.3.2 細菌、放線菌群落層次的聚類分析 在不同菌劑處理下，堆肥中細菌、放線菌群落層次的聚類分析結(jié)果見圖7?？梢钥闯?，在CK、T處理下，3次重復樣品之間細菌、放線菌微生物群落結(jié)構(gòu)聚類結(jié)果較為集中，重復效果較好，且T處理與CK的聚類分析距離較遠，表明在T處理下，微生物群落結(jié)構(gòu)與CK間的差異較大。此外，T、T、T這3個處理的聚類分析距離較近，且均接近CK，表明在T、T、T這3個處理下，細菌、放線菌微生物群均與CK處理的細菌、放線菌群落結(jié)構(gòu)接近。

2.3.3 分類學組成分析 圖8為不同發(fā)酵菌劑處理堆肥中細菌、放線菌在門分類水平上的群落種組成，選取相對豐度排名前五的門類。在常規(guī)堆肥(CK)處理下，厚壁菌門的相對豐度為67.46%，其次是變形菌門，相對豐度為8.48%，放線菌門、的相對豐度均約為7.6%，擬桿菌門的相對豐度為2.42%，其他菌門的相對豐度為6.31%。

與CK相比，在T處理下，堆肥中放線菌門的相對豐度顯著增加約8百分點，厚壁菌門的相對豐度顯著下降了約7百分點；在T處理下，堆肥中放線菌門的相對豐度顯著增加了約7百分點，同時的相對豐度顯著下降了約7百分點；在T處理下，厚壁菌門的相對豐度顯著下降了約18百分點，變形菌門、擬桿菌門的相對豐度增加了 4～5百分點；在T處理下，放線菌門、變形菌門的相對豐度分別增加了約9、2百分點，而子厚壁菌門、擬桿菌門、的相對豐度下降了1～5百分點。

由于厚壁菌門、擬桿菌門為產(chǎn)甲烷過程的優(yōu)勢群落，因此對這2種細菌的相對豐度之和進行分析。結(jié)果(圖9)表明，在CK處理下，產(chǎn)甲烷菌的相對豐度之和最大，為69.88%；在T處理下，產(chǎn)甲烷菌的相對豐度和與CK基本一致；而在T、T、T處理下，產(chǎn)甲烷菌的相對豐度均低于CK，并以T處理下產(chǎn)甲烷菌的相對豐度之和最低，與對照處理相比顯著降低了13.56百分點。由此可見，在牛糞堆肥過程中添加發(fā)酵菌劑C可使產(chǎn)甲烷菌的相對豐度之和顯著降低約14百分點，從而有效降低堆肥過程中甲烷排放的風險。

3 討論與結(jié)論

溫度是決定微生物種群相對優(yōu)勢、評價堆肥效果的重要指標。本研究中，通過添加4種不同發(fā)酵菌劑均能有效提高牛糞堆肥過程中的溫度，平均發(fā)酵溫度較CK增加2.84～6.33 ℃；在添加發(fā)酵菌劑A、C、D處理下，堆肥溫度升高至50 ℃以上所需時間分別為5、3、5 d，分別較CK提前4、6、4 d。堆肥溫度上升至50 ℃后，持續(xù)高溫時間超過 5 d，符合國家糞便無害化衛(wèi)生標準。本研究結(jié)果與王信等得出的在牛糞堆肥后2～3 d進入高溫期的結(jié)果存在差異，但與金香琴等通過微生物菌劑對畜禽糞便堆肥影響的研究得出的牛糞堆肥在 4～12 d 后溫度上升到 50 ℃進入高溫期的研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果與張玉鳳等得出的接種發(fā)酵菌劑處理下堆肥溫度達到 50 ℃的時間比不接種處理提前 4 d、高溫持續(xù)24 d的研究結(jié)果基本一致。此外，高云航等的研究結(jié)果表明，在環(huán)境溫度較低時進行牛糞堆肥，接種發(fā)酵菌劑堆肥處理下11 d進入高溫期。由此可見，堆肥發(fā)酵菌劑的升溫時長還受環(huán)境溫度影響。

在本研究中，不同菌劑處理堆肥的真菌優(yōu)勢群落(相對豐度大于5%)為子囊菌門、擔子菌門，相對豐度分別為59.35%、16.48%，這與許修宏關(guān)于牛糞好氧堆肥中真菌群落組成研究得出的降溫期優(yōu)勢菌為類子囊菌門的研究結(jié)果基本一致。不同發(fā)酵菌劑的添加均可促進馬拉色霉菌屬、嗜熱子囊菌屬、毛霉菌屬菌株繁殖，增加其相對豐度；并對鐮刀菌、、節(jié)擔菌屬、菌株繁殖產(chǎn)生抑制，降低其相對豐度，以節(jié)擔菌屬的抑制作用最為顯著。不同菌劑處理堆肥中牛糞堆肥細菌的優(yōu)勢菌門為厚壁菌門、放線菌門、變形菌門、，相對豐度總和約為91.14%。與CK相比，在T、T、T處理下，細菌、放線菌的微生物多樣降低，在T處理下，細菌、放線菌的微生物多樣性高于CK。本研究結(jié)果與王秀紅等得出的牛糞與秸稈好氧堆肥優(yōu)勢菌門有厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、綠彎菌門、放線菌門和浮霉菌門，其相對豐度總和為77.61%～94.26%的研究結(jié)果基本一致。

盧洋洋研究發(fā)現(xiàn)，添加外源微生物菌劑可以顯著降低氨氣、二氧化碳的釋放濃度，溫室氣體減排效果顯著，在堆肥的第5天，氨氣濃度釋放量峰值較CK下降14%～31%。在本研究中，在牛糞堆肥發(fā)酵過程中添加不同發(fā)酵菌劑主要會影響厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門的相對豐度。而厚壁菌門、擬桿菌門為產(chǎn)甲烷過程中的優(yōu)勢群落，甲烷的增溫勢更是為二氧化碳的25倍，具有極大的環(huán)境風險。在牛糞自然堆肥處理下，2種細菌的相對豐度之和達69.88%，添加發(fā)酵菌劑C可以顯著降低厚壁菌門、擬桿菌門的相對豐度。與對照相比，2種細菌的相對豐度之和下降了14百分點，有助于降低牛糞發(fā)酵過程中甲烷的排放。綜上可見，不同發(fā)酵菌劑產(chǎn)品的甲烷減排效果存在差別。關(guān)于提高添加發(fā)酵菌劑的環(huán)境效益、實現(xiàn)養(yǎng)殖廢物氨減排、降低溫室氣體排放等方面的工作有待進一步研究。