郭愛華

(呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西呂梁 033000)

苦菜(L.)為菊科(Compositae)苦苣菜屬()草本植物，是一種常在土壤休耕期間利用其儲(chǔ)存的寶貴水分進(jìn)行生長(zhǎng)的野生資源，原產(chǎn)于歐洲、非洲北部、亞洲，在我國(guó)大部地區(qū)均有分布?？嗖撕卸喾N活性成分(黃酮類槲皮素、芹菜素、蕓香苷、脂肪酸、酚酸、糖苷、倍半萜內(nèi)酯)及其苷類化合物、甾體，味甘略苦，既可作為蔬菜食用，又可作為中藥材治療疾病，具有較高的抗氧化及抑菌活性。研究發(fā)現(xiàn)，苦菜提取物對(duì)K562、HepG-2等腫瘤細(xì)胞有抑制作用，可防治癌癥，有顯著的鎮(zhèn)痛作用和良好的抗胃潰瘍、抗?jié)冃越Y(jié)腸炎活性。Su等研究發(fā)現(xiàn)，苦菜對(duì)臭氧較敏感，可作為臭氧的指示生物。由此可見，對(duì)苦菜資源的良好利用和開發(fā)是提高其經(jīng)濟(jì)收益的有效措施。

人為作用引起的鹽漬化，又稱為次生鹽漬化，對(duì)土壤有不同程度的影響。目前，土壤鹽漬化日益嚴(yán)重，已經(jīng)成為制約經(jīng)濟(jì)植物發(fā)展的瓶頸，植物體內(nèi)積聚鹽分后會(huì)影響植株形態(tài)建成，使光合作用降低、發(fā)生過氧化作用、膜系統(tǒng)損傷、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)失去平衡等，對(duì)其有效改善和緩解已成為眾多學(xué)者面臨的嚴(yán)峻課題。褪黑素(melatonine，MT)，又名-乙?；?5-甲氧基色胺(-acetyl-5-metoxytriptamine)，是一種重要的第二信使分子，在生物脅迫與非生物脅迫中起著各種作用。在甜瓜、番茄、甜葉菊等植物中，外源褪黑素能夠顯著促進(jìn)其種子萌發(fā)及植株生長(zhǎng)發(fā)育，通過修復(fù)線粒體，減輕活性氧、非生物和生物應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷，促進(jìn)光合作用，最終提高植物的抗逆性。本研究旨在研究外源褪黑素對(duì)鹽脅迫后苦菜幼苗在生長(zhǎng)發(fā)育、光合色素、膜質(zhì)、抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)等方面的作用，為解決鹽漬化及進(jìn)一步闡釋褪黑素的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

挑選籽粒飽滿的琪龍牌苦菜種子，浸種6 h后，擺放在鋪有2層濕紗布的培養(yǎng)皿中，每皿擺放30粒，在25 ℃培養(yǎng)箱中水培。

1.2 鹽脅迫處理

苦菜種子萌發(fā)后3 d，分別用0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液處理幼苗7 d，以清水處理為對(duì)照，根據(jù)根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、葉綠素含量，選擇脅迫較明顯的處理組的濃度作為后期鹽脅迫處理濃度。

1.3 褪黑素處理

幼苗鹽脅迫處理1周后加入0、25、50、75、100 μmol/L 外源褪黑素，處理5 d后檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 指標(biāo)的測(cè)定

選取長(zhǎng)勢(shì)一致的3株幼苗，測(cè)量平均葉長(zhǎng)、根長(zhǎng)、鮮質(zhì)量。

葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量的測(cè)定參考《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》。丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法(thiobarbituric acid，TBA)測(cè)定；電導(dǎo)率的測(cè)定參考Wang等的方法；過氧化物酶(POD)活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；SOD活性采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定；可溶性總糖含量采用蒽酮比色法進(jìn)行測(cè)定；脯氨酸含量采用酸性茚三酮法進(jìn)行測(cè)定。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用Excel 2010，作圖使用Origin 2019，數(shù)據(jù)分析用SAS 8e。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫處理對(duì)苦菜幼苗的影響

用不同濃度的鹽對(duì)苦菜幼苗進(jìn)行脅迫處理，其根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量及光合色素含量見圖1。可以看出，與未經(jīng)鹽處理的幼苗相比，0.1、0.2 mol/L鹽處理可顯著提高幼苗根長(zhǎng)、葉高、鮮質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量。用0.3 mol/L鹽處理苦菜幼苗后，各項(xiàng)指標(biāo)均下降，除鮮質(zhì)量、葉綠素a含量外，包括類胡蘿卜素含量在內(nèi)的各指標(biāo)都與對(duì)照組間差異顯著，說明0.3 mol/L以上濃度的鹽會(huì)顯著影響苦菜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育，但又不至于使植株完全失活，因此選用0.3 mol/L鹽脅迫處理幼苗進(jìn)行后期試驗(yàn)。

2.2 褪黑素對(duì)苦菜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

用0.3 mol/L鹽脅迫處理幼苗后，再用不同濃度的褪黑素處理。由圖2可以看出，25～50 μmol/L外源褪黑素可顯著提高幼苗根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量，與0 μmol/L處理組相比，50 μmol/L處理組分別使幼苗根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量提高了77%、35%、24%。用大于50 μmol/L濃度的褪黑素處理后，幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)降低。由此可見，由于苦菜幼苗較弱小，低濃度的外源褪黑素即可顯著促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育。

2.3 褪黑素對(duì)苦菜光合色素含量的影響

對(duì)褪黑素處理后的苦菜幼苗中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素等光合作用色素的鮮質(zhì)量含量進(jìn)行測(cè)定。由圖3可見，幼苗中的葉綠素a、葉綠素b的鮮質(zhì)量含量有先升高后下降的趨勢(shì)，在 50 μmol/L 褪黑素處理下，葉綠素a的鮮質(zhì)量含量達(dá)到最大值(0.94 mg/g)，在75 μmol/L褪黑素處理下，葉綠素b的鮮質(zhì)量含量達(dá)到最大值(0.66 mg/g)，且與50 μmol/L褪黑素處理組間的差異不顯著。類胡蘿卜素含量隨著褪黑素濃度的增大而增加，尤其是當(dāng)褪黑素濃度大于50 μmol/L后，其含量顯著增加，與幼苗顯著變成黃色緊密相關(guān)。

2.4 褪黑素對(duì)苦菜膜質(zhì)的影響

對(duì)外源褪黑素處理后的苦菜幼苗中的丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率進(jìn)行測(cè)定。由圖4可見，二者均有先降低后升高的趨勢(shì)。較低濃度(如25 μmol/L)褪黑素處理即可顯著降低經(jīng)鹽脅迫處理后苦菜幼苗的丙二醛含量、相對(duì)電導(dǎo)率，分別較對(duì)照顯著降低了4.9%、14.3%。50 μmol/L 褪黑素處理組的幼苗丙二醛含量、電導(dǎo)率分別顯著降低了10.3%、20.5%。75 μmol/L褪黑素處理的幼苗丙二醛含量和相對(duì)電導(dǎo)率均升高，其電導(dǎo)率與0 μmol/L褪黑素處理組間差異顯著。由此可見，低濃度褪黑素處理即可顯著提升質(zhì)膜功能，以降低膜所受損傷。

2.5 褪黑素對(duì)苦菜抗氧化酶活性的影響

經(jīng)褪黑素處理后的苦菜幼苗POD、SOD活性見圖5。當(dāng)褪黑素濃度小于75 μmol/L時(shí)， POD、 SOD活性均顯著提高，其中當(dāng)褪黑素濃度為50 μmol/L時(shí)，POD、SOD活性達(dá)到最大值，分別較對(duì)照組提高了36.6%、20.5%，并且與對(duì)照組之間差異顯著。當(dāng)褪黑素濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，2種抗氧化酶活性反而降低。

2.6 褪黑素對(duì)苦菜滲透調(diào)節(jié)的影響

從圖6可以看出，25、50 μmol/L褪黑素均可顯著提高可溶性蛋白含量，分別較0 μmol/L處理組增加了25.4%、34.1%。當(dāng)褪黑素濃度大于75 μmol/L時(shí)，顯著降低了可溶性蛋白含量。當(dāng)褪黑素濃度小于75 μmol/L時(shí)，顯著增加了苦菜幼苗的可溶性糖含量，其增幅在4.0%～29.5%之間。不同濃度褪黑素對(duì)苦菜幼苗脯氨酸含量的影響呈現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)，濃度小于75 μmol/L的褪黑素處理均提高了脯氨酸含量，并且不同處理組之間差異顯著。當(dāng)褪黑素濃度達(dá)到100 μmol/L時(shí)，不僅顯著降低了可溶性蛋白、可溶性糖含量，并且顯著降低了脯氨酸含量。

2.7 不同濃度褪黑素對(duì)各測(cè)定指標(biāo)影響的相關(guān)性

由表1可以看出，植物生長(zhǎng)指標(biāo)根長(zhǎng)與葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、葉綠素a含量、葉綠素b含量均呈顯著正相關(guān)；類胡蘿卜素、丙二醛、電導(dǎo)率與生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)呈較大的負(fù)相關(guān)；抗氧化酶活性及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量基本與生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)呈顯著正相關(guān)。

表1 各檢測(cè)指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

3 討論

苦菜作為藥食同源的野生植物資源，具有綠色、天然、環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)，而且其商業(yè)開發(fā)價(jià)值較高，種子萌發(fā)時(shí)對(duì)溫度范圍的要求廣泛，在5～35 ℃均可萌發(fā)，其生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境條件的要求不高，春、夏、秋季均可獲取，而且可作為環(huán)境指示生物之一?？嗖嗽谥兴幉姆矫娴膽?yīng)用已有2 000多年的歷史，由于其含有低分子抗氧化劑(萜類、黃酮、酚酸、甾體等)中草藥成分，因此相關(guān)臨床研究逐漸增多，為揭示其分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

用0.1、0.2、0.3、0.4 mol/L NaCl溶液處理苦菜幼苗后，通過對(duì)其根長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、鮮質(zhì)量、葉綠a含量、葉綠素b含量、類胡蘿卜素含量等指標(biāo)的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)低濃度鹽可促進(jìn)植株生長(zhǎng)，大于0.3 mol/L濃度的NaCl溶液對(duì)苦菜幼苗的脅迫作用較顯著。植物響應(yīng)鹽脅迫可通過多種生化和分子機(jī)制，在植株上表現(xiàn)為控制離子運(yùn)輸、光合途徑以及抗氧化酶活性、植物激素水平、膜質(zhì)成分等方面的變化。緩解鹽脅迫是提高經(jīng)濟(jì)植物產(chǎn)量、進(jìn)行有效開發(fā)利用的前提和保證。

大量研究發(fā)現(xiàn)，褪黑激素在植物對(duì)鹽脅迫的反應(yīng)中起著重要作用。本研究使用不同濃度褪黑素對(duì)鹽脅迫后的苦菜幼苗進(jìn)行處理，發(fā)現(xiàn)在生長(zhǎng)發(fā)育及生理方面，褪黑素可有效緩解幼苗遭受的鹽脅迫；25 μmol/L褪黑素即可調(diào)節(jié)膜質(zhì)物丙二醛及其相對(duì)電導(dǎo)率，增強(qiáng)其抵抗力，降低膜損傷；上調(diào)抗氧化酶活性，以消除活性氧物質(zhì)；增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)功能，有效改善滲透不平衡現(xiàn)象，防止細(xì)胞脫水。這與外源褪黑素處理提高鹽脅迫后玉米幼苗的結(jié)果相似，此外，褪黑素還可有效抵抗多種生物及非生物脅迫，如重金屬、干旱脅迫等。褪黑激素主要通過2種途徑增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫的抗性，一種是通過直接途徑，如直接清除活性氧，另一種是通過間接途徑提高抗氧化酶活性、光合效率和代謝物含量，以及調(diào)節(jié)與脅迫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子。