吳蘇君， 冀恒濤， 彭夢樂

（1.河南省直第三人民醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000；2.鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，河南 鄭州 450000）

有流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，全球有超過3億人感染或攜帶乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV），我國為HBV感染高發(fā)國家，HBV感染者高達1.3億[1]。機體感染HBV后會產(chǎn)生抗病毒免疫應(yīng)答，一方面可清除病毒，使部分患者病情得到緩解，但抗病毒免疫應(yīng)答也可促進機體發(fā)生炎性反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟受到損傷或壞死，嚴重時可導(dǎo)致肝硬化或肝癌的發(fā)生[2]。有10%～30%的HBV感染者會發(fā)展為肝硬化或肝癌[3]。因此，尋找能有效診斷乙型肝炎（簡稱乙肝）相關(guān)肝硬化的指標具有重要意義。肝臟固有免疫參與了肝硬化的發(fā)生、發(fā)展[4]，固有免疫細胞主要為自然殺傷（natural killer，NK）細胞和樹突狀細胞（dendritic cell，DC）。在慢性HBV感染中，NK細胞可通過溶細胞途徑或非溶細胞途徑發(fā)揮抗病毒作用，而DC主要通過分泌Ⅰ型干擾素或細胞因子在固有免疫中發(fā)揮作用[5]。NK細胞與DC之間可通過相互作用來調(diào)節(jié)機體的免疫功能。固有免疫細胞的大量聚集會導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[6]。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor 3，NLRP3）作為機體固有免疫的主要成分，在自身免疫性疾病、慢性炎癥性疾病等病理過程中起重要作用[7]。NLRP3的活化可介導(dǎo)其下游因子白細胞介素18（interleukin-18 ，IL-18）、白細胞介素37（interleukin-37，IL-37）等的表達。本研究擬探討IL-18、IL-37、NLRP3水平及外周血NK/DC比值在乙肝相關(guān)肝硬化中的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2017年5月—2019年5月河南省直第三人民醫(yī)院乙肝相關(guān)肝硬化的初診患者129例（乙肝相關(guān)肝硬化組），其中男69例、女60例，年齡（41.5±5.6）歲；ChildPugh分級[8]為A級49例、B級47例、C級33例。根據(jù)病情進展將129例患者進一步分為肝硬化組（98例）和原發(fā)性肝癌組（31例）。另選取同期河南省直第三人民醫(yī)院乙肝患者129例（乙肝組），其中男72例、女57例，年齡（41.1±5.2）歲。以同期河南省直第三人民醫(yī)院體檢健康者129名作為正常對照組，其中男67名、女62名，年齡（42.2±6.1）歲。本研究經(jīng)河南省直第三人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有對象均知情同意。

1.2 納入和排除標準

1.2.1 納入標準 （1）乙肝和乙肝相關(guān)肝硬化依據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南（2015更新版）》[9]確診，原發(fā)性肝癌依據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[10]確診，健康體檢者近1個月內(nèi)體格檢查無異常，相關(guān)血液學(xué)指標均正常；（2）年齡≥18周歲；（3）所有研究對象或其家屬均知情同意。

1.2.2 排除標準 （1）有既往手術(shù)史；（2）非HBV因素所致的肝硬化；（3）合并其他心、腦血管疾病；（4）合并免疫功能障礙性疾??；（5）近6個月服用過免疫抑制劑等可能影響檢測結(jié)果的藥物；（6）精神狀態(tài)異?；蛞缽男圆?。

1.3 方法

收集所有對象的一般資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史。

采集所有對象入組次日清晨（未接受治療前）的空腹靜脈血5 mL×3管，其中2管采用枸櫞酸鈉抗凝，用于檢測NK細胞、DC及NLRP3基因；1管分離血清，用于檢測IL-18和IL-37。

采用 FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）及配套試劑檢測NK細胞、DC百分比，計算NK/DC比值。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-18和IL-37，試劑盒購自美國Abcam公司[IL-18試劑盒的檢出限為8.3 pg/mL，線性范圍為62.5～4 000.0 pg/mL，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）為2.7%，標準曲線r2=0.994；IL-37試劑盒的檢出限為10 pg/mL，線性范圍為15.6～1 000.0 pg/mL，CV為4.1%，標準曲線r2=0.991]，檢測儀器為Microlab STAR 多功能酶標儀（瑞士Hamilton公司）。

采用RNA提取試劑盒（美國Abcam公司）提取血細胞RNA，并用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Abcam公司）進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。根據(jù)SYBR RTPCR試劑盒（美國Abcam公司）說明書，采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）檢測NLRP3基因表達。引物序列：NLRP3上游引物為5'-GCTGGTCTTGAATTCCTCA-3'，下游引物為5'-GGCAACGGATGAGTCTTT-3'；β-actin上游引物為5'-ACTCTTCCAGCCTTCCTTCC-3'，下游引物為5'-CGTACAGGTCTTTGCGG-ATG-3'。反應(yīng)體系：10×擴增緩沖液10 μL、4種dNTP混合物（200 μmol/L）各0.5 μL、上游及下游引物（20 pmol/L）各1 μL，模板DNA 4.5 μL、1.5 mmol/L Mg2+3 μL，加雙蒸水至100 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 30 s，變性95 ℃ 5 s，退火60 ℃30 s，循環(huán)35次。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算各組NLRP3與β-actin基因的相對表達量。每份樣本重復(fù)檢測3次，取平均值。NLRP3的檢測結(jié)果以β-actin表達量的倍數(shù)表示。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析。呈正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析；兩兩比較，若方差齊性，采用LSD-t檢驗；若方差不齊，采用Dunnett-t3檢驗。計數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評價IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值單項檢測及聯(lián)合檢測鑒別診斷乙肝相關(guān)肝硬化與原發(fā)性肝癌的效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乙肝組、乙肝相關(guān)肝硬化組、正常對照組一般資料比較

乙肝組、乙肝相關(guān)肝硬化組及正常對照組年齡、性別、BMI、吸煙史、飲酒史、高血壓史、糖尿病史差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 乙肝組、乙肝相關(guān)肝硬化組、正常對照組一般資料比較

2.2 乙肝組、乙肝相關(guān)肝硬化組、正常對照組IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

正常對照組、乙肝組和乙肝相關(guān)肝硬化組IL-18、IL-37水平及NLRP3相對表達量依次升高，NK/DC比值依次降低（P<0.05），各組間4項指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表2。

表2 乙肝組、乙肝相關(guān)肝硬化組、正常對照組IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

2.3 不同ChildPugh分級患者IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

ChildPugh分級A級、B級和C級患者IL-18、IL-37水平及NLRP3相對表達量依次升高，NK/DC比值依次降低（P<0.05）；各分級間4項指標差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）。見表3。

表3 不同ChildPugh分級患者IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

2.4 肝硬化組與原發(fā)性肝癌組IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

原發(fā)性肝癌組IL-18、IL-37水平及NLRP3相對表達量高于肝硬化組（P<0.05），NK/DC比值低于肝硬化組（P<0.05）。見表4。

表4 肝硬化組與原發(fā)性肝癌組IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值比較

2.5 4項指標鑒別診斷乙肝相關(guān)肝硬化和原發(fā)性肝癌的效能

采用二元回歸分析法得出NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值的聯(lián)合檢測方程為：Logit（P）=-0.675+0.23×NLRP3+0.002×IL-18+0.001×IL-37-0.005×NK/DC比值。ROC曲線分析結(jié)果顯示，NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值單項檢測及4項指標聯(lián)合檢測鑒別診斷乙肝相關(guān)肝硬化與原發(fā)性肝癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.893、0.886、0.860、0.838、0.982。見表5、圖1。

表5 4項指標單獨及聯(lián)合檢測鑒別診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線性能參數(shù)

圖1 NLRP3、IL-18、IL-37和NK/DC比值鑒別診斷原發(fā)性肝癌的ROC曲線

3 討論

HBV可在患者體內(nèi)長期復(fù)制，導(dǎo)致機體持續(xù)處于“循環(huán)壞死和再生修復(fù)”這一病理過程中，誘使肝細胞發(fā)生纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化的發(fā)生，若未及時發(fā)現(xiàn)并進行有效治療，將發(fā)展為失代償期肝硬化，甚至是原發(fā)性肝癌[11]。目前，臨床上對肝硬化進行病情診斷及分期的金標準是肝臟活檢[12]。但肝臟活檢為有創(chuàng)檢查，患者依從性小，且存在取樣部位受病理醫(yī)生主觀影響大，無法長期監(jiān)測或評估患者病情進展等不足。因此，尋找肝硬化患者病情監(jiān)測及預(yù)后評估的特異性生物標志物具有十分重要的臨床意義。

“炎癥小體”這一概念最早由TSCHOPP等[13]提出，主要用于描述免疫細胞激活或其胞質(zhì)中一類介導(dǎo)半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶1（cysteine-containing aspartate-specific protease-1，Caspase-1）活化的大分子復(fù)合物。近年來，關(guān)于炎癥小體在炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展中的作用已成為臨床研究的熱點。NLRP3作為炎性小體之一，其可通過促進機體內(nèi)炎癥信號的激活，誘導(dǎo)其下游炎癥因子，如IL-18等的表達，促進肝臟間質(zhì)細胞的纖維化。NLRP3過表達還可促進機體中性粒細胞和巨噬細胞的富集，進一步促進炎性細胞對肝臟上皮細胞的吞噬以及促凋亡作用[13]。此外，NLRP3水平升高還可導(dǎo)致肝臟上皮細胞線粒體的損傷及線粒體膜結(jié)構(gòu)功能的異常，進一步影響肝功能的惡化。有研究結(jié)果顯示，當(dāng)肝臟出現(xiàn)炎癥時，NLRP3炎癥小體水平顯著升高，且肝臟組織中NLRP3、Caspase-1表達顯著增加[14]。IL-18是NLRP3的下游因子，主要由肝臟Kupffer細胞及單核-巨噬細胞產(chǎn)生。IL-18可促進機體T細胞的表達，增強淋巴細胞的毒性[15]。IL-18可促進NK細胞凋亡相關(guān)因子配體（apoptosis related gene Fas ligand，F(xiàn)asL）的分泌，并可誘導(dǎo)輔助性T細胞（helper T cell，Th）1產(chǎn)生γ干擾素（interferon-gamma，IFN-γ）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）等細胞因子，刺激機體多種免疫細胞產(chǎn)生Fas，從而通過Fas/FasL信號通路發(fā)揮淋巴細胞的毒性作用[15]。IL-18還可促進肝細胞可溶性細胞間黏附分子1（soluble intercellular adhesion molecule-1，sICAM-1）的表達，通過sICAM-1與其配體淋巴細胞功能相關(guān)抗原-l（lymphocyte functionassociated antigen-1，LFA-1）結(jié)合，介導(dǎo)T細胞與其他相關(guān)細胞黏附，促進機體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致HBV感染者肝組織損傷的加重[15]。MERENDINO等[16]的研究結(jié)果顯示，IL-18可促進肝細胞的炎性損傷。本研究結(jié)果顯示，與正常對照者比較，乙肝患者及乙肝相關(guān)肝硬化患者IL-18水平及NLRP3相對表達量顯著升高（P<0.05），且隨肝硬化患者ChildPugh分級的升高而升高（P<0.05）；原發(fā)性肝癌患者IL-18水平及NLRP3相對表達量均高于乙肝相關(guān)肝硬化患者（P<0.05）。這提示NLRP3及其下游因子與HBV所致的肝炎及肝硬化的病理進程密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照者比較，乙肝患者及乙肝相關(guān)肝硬化患者IL-37水平升高（P<0.05），且隨肝硬化患者ChildPugh分級的升高而升高（P<0.05）；原發(fā)性肝癌患者IL-37水平均高于乙肝相關(guān)肝硬化患者（P<0.05）。IL-37主要表達于淋巴細胞、中性粒細胞、單核細胞等細胞，是固有免疫反應(yīng)的天然抑制因子，不僅可抑制炎癥因子的表達，還可對固有免疫產(chǎn)生抑制作用，其機制可能是通過DC抑制CD8+T細胞的產(chǎn)生，促進調(diào)節(jié)性T細胞的表達，從而抑制機體固有免疫，產(chǎn)生免疫耐受[14]。在HBV感染的過程中，CD8+T細胞可對感染HBV的肝細胞進行免疫攻擊，從而清除病毒，而調(diào)節(jié)性T細胞可抑制T細胞的表達，促進機體免疫耐受。因此，HBV感染患者IL-37水平上升可能會促進調(diào)節(jié)性T細胞的生成，抑制CD8+T細胞表達，從而加重患者肝臟損傷。

NK細胞及DC在機體固有免疫中發(fā)揮著重要作用。在HBV感染免疫清除期，患者外周血NK細胞數(shù)顯著低于免疫耐受期及健康對照者，而NK細胞的活化能力則有所增強，并與肝臟損傷呈正相關(guān)[17]。在HBV慢性感染的過程中，DC可分泌IFN-γ，并作為抗原提呈細胞提高T細胞的活性，進而發(fā)揮抗病毒作用。劉斌等[17]的研究結(jié)果顯示，NK/DC比值與NK細胞誘導(dǎo)DC分化發(fā)育密切相關(guān)，當(dāng)NK細胞與DC的比例低于1∶5時，NK細胞可促進DC成熟；而當(dāng)比例高于5∶1時，則會促進非成熟的DC凋亡，因此HBV感染患者NK/DC比值降低可能會促進DC成熟活化，進而增強T細胞的殺傷功能，導(dǎo)致肝損傷。本研究結(jié)果顯示，與正常對照者比較，乙肝患者及乙肝相關(guān)肝硬化患者NK/DC比值顯著下降（P<0.05），且隨肝硬化患者ChildPugh分級的升高而降低（P<0.05）；原發(fā)性肝癌患者NK/DC比值低于乙肝相關(guān)肝硬化患者（P<0.05）。

由于慢性肝炎常會隱匿發(fā)展為肝硬化，多數(shù)患者因出現(xiàn)肝硬化失代償期表現(xiàn)才得以被發(fā)現(xiàn)。目前，關(guān)于IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值在乙肝相關(guān)肝硬化預(yù)后評估中的價值的研究較少。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，NLRP3、IL-18、IL-37、NK/DC比值單項檢測及4項指標聯(lián)合檢測鑒別診斷乙肝相關(guān)肝硬化與原發(fā)性肝癌的AUC分別為0.893、0.886、0.860、0.838、0.982，敏感性為77.4%～96.8%，特異性為71.0%～95.9%。

綜上所述，IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值與乙肝相關(guān)肝硬化的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，在乙肝相關(guān)肝硬化與原發(fā)性肝癌的鑒別診斷中有一定的價值。但本研究為單中心研究，樣本量較小，因此結(jié)論尚需大樣本量、多中心的研究進一步驗證。另外，本研究未探討HBV DNA載量對IL-18、IL-37、NLRP3及NK/DC比值的影響及相關(guān)性，這也是后續(xù)研究的方向。