曹藍，白玉芹，余萍，湯純，矯艷平*，閔祥博

（1.江西仁仁健康產(chǎn)業(yè)有限公司，江西樟樹 331200）

（2.漢臣氏（沈陽）兒童制品有限公司，遼寧沈陽 110000）

血脂是血漿中的膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）等中性脂肪和類脂的總稱，它是生存必須的代謝物質。血脂中TC 主要合成細胞漿膜、類固醇激素及膽汁酸，TG 主要參與體內(nèi)能量代謝[1,2]。隨著社會的進步，生活水平的逐漸提升，食品中營養(yǎng)的不斷增加，飲食中攝入膽固醇食品也在增長，現(xiàn)如今高血脂癥一躍成為威脅我國中老年人身體健康第一大隱患。關于高血脂引起的疾病逐漸增多，例如冠心病、心肌梗塞和動脈硬化等，此類疾病的發(fā)病率高，治愈率相對較低，因此需要正確的認識高血脂，并盡早進行預防[3-6]。高血脂癥是指脂肪代謝或者運轉異常使人體血液中的血脂含量超過正常范圍，其中人體血清中膽固醇過高，甘油三酯過高，高密度脂蛋白膽固醇過低都是高血脂的重要指標[7-10]。雖然降血脂的相關藥物也在不斷的研發(fā)且得到了大量的采用，但是關于降血脂的藥物或多或少會具有一定的副作用，而可以輔助降血脂的功能食品則不會有此影響。

現(xiàn)國內(nèi)外大量的研究人員致力利用益生菌改善血清中的血脂水平，研究結果表明，一部分益生菌對于降低血清中的血脂具有顯著的功效[11,12]。在認識了益生菌在對人體降低血脂有重要作用后，關于篩選降血脂的益生菌研究逐漸增多，但研究中多數(shù)對降血脂有作用的菌株都是來自于自然發(fā)酵食物中分離，對于來源于健康嬰幼兒腸道中的乳酸菌降血脂的試驗較少，因此本實驗篩選樣本來自于健康嬰兒的腸道，篩選出的菌株通過體外降膽固醇、甘油三酯試驗、膽鹽耐受性試驗得出較好的菌株，并進行形態(tài)鑒定、過氧化氫試驗、16S rDNA 序列分析及電鏡形態(tài)觀察鑒定，以期獲得降血脂性能較好的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品

實驗樣品為6 月齡順產(chǎn)健康的嬰兒糞便，確保嬰兒在采樣前沒有服用過任何藥物及乳酸菌產(chǎn)品，采樣工具全部進行滅菌處理，并將樣品采集好后套上厭氧袋并使用厭氧產(chǎn)氣包進行運輸。

1.1.2 試劑及培養(yǎng)基

膽固醇（C8667-1G）、牛膽鹽（T4009-5G），西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；鄰苯二甲醛（化學純CP）、硫代乙醇酸鈉（分析純AR），上海麥克林生化科技有限公司；正己烷（分析純AR），天津市恒興化學試劑制造有限公司；葵花籽油，中糧福臨門食品營銷有限公司；甘油三酯試劑盒（A110-1-1），南京建成生物試劑公司。

高膽固醇培養(yǎng)基（MRS-CHOL）：在根據(jù)王湘竹[13]研究所述方法配置MRS 培養(yǎng)基中加入0.3%牛膽鹽，0.2%硫代乙醇酸鈉，100 μg/mL 膽固醇溶液[14]。

甘油三酯培養(yǎng)基[15]：將2%的聚乙烯醇水溶液與植物油按體積比3:1 混合，用超聲波處理（控制參數(shù)每次超聲5 s，間隔時間5 s，共超聲70 次）后混合均勻制成植物油乳化液作為甘油三酯的來源。將上述制備的植物油乳化液按5%的比例加入到MRS 培養(yǎng)基中，調pH 至6.5±0.2，在115 ℃下，滅菌30 min，將制備的甘油三酯培養(yǎng)基于4 ℃冰箱冷卻備用。

1.1.3 儀器與設備

TGL-16M 型低溫高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；SCIENTZ-ⅡD型超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；Multiskan FC 酶標儀，賽默飛世爾科技公司；QL-861 旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；LDZX-50KBS 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；LAI-3DT 厭氧手套箱，上海龍躍儀器設備有限公司；PHS-25B 數(shù)字酸度計，上海大普儀器有限公司。

1.1.4 動物來源

金黃地鼠（許可證號：SCXK(遼)2020-0001），50只，雄性，90～110 g，購于遼寧長生生物技術有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離純化篩選及鑒定

將6 月齡順產(chǎn)健康的嬰兒糞便稀釋在平板上分離，37 ℃，48 h 后進行觀察，找到典型菌落后，對其反復劃線分離及純化后獲得純菌株。通過革蘭氏染色后鏡檢、過氧化氫酶試驗進行鑒定，將疑似乳酸菌接種于MRS 斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)并于4 ℃保存?zhèn)溆肹16,17]。

1.2.2 體外降膽固醇及降甘油三酯功能性篩選試驗

1.2.2.1 體外降膽固醇功能性篩選（1）乳酸菌的活化

菌株接種5 mL MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃，20±0.5 h，取培養(yǎng)物接種100 mL 上述培養(yǎng)基中，17 h 備用。

（2）膽固醇含量測定[18,19]

1 mg/mL 膽固醇溶液：用無水乙醇將0.1 g 膽固醇定容于100 mL 容量瓶中，0.22 μm 濾膜過濾除菌，4 ℃儲藏備用。

圖1 是膽固醇標準曲線，線性方程為y=0.0167x+0.0171，R2=0.9953，線性關系良好。

待用菌種接種于MRS-CHOL 培養(yǎng)基，以未接菌的MRS-CHOL 培養(yǎng)基作為對照。37 ℃培養(yǎng)24 h 后離心（6000 ×g，5 ℃，10 min），收集上清液，通過OPA法進行測定。

取上清液4.0 mL，加入2.0 mL 50% KOH，混和均勻后加入3.0 mL 95%乙醇，漩渦震蕩后，將反應物置于60 ℃皂化15 min，加入3.0 mL 正己烷，混勻并加入2.0 mL 蒸餾水，漩渦震蕩1 min，靜置15 min。取2.0 mL 正己烷層溶液于干凈離心管中，60 ℃氮吹揮發(fā)，加入2.0 mL 鄰苯二甲醛溶液復溶，加入1.0 mL濃硫酸，漩渦震蕩，測定OD550。

根據(jù)標準曲線測定樣品中膽固醇含量

式中：

C0——未接種上清液中膽固醇實測濃度，μg/mL；

C——接種后發(fā)酵液上清液中膽固醇實測濃度，μg/mL。

1.2.2.2 菌株體外降甘油三酯功能性篩選

（1）乳酸菌的活化

菌株接種于5 mL 培養(yǎng)基中，37 ℃，培養(yǎng)20 h，取5 mL 培養(yǎng)物接至100 mL 培養(yǎng)基中，繼續(xù)以適宜溫度培養(yǎng)17 h，最后將菌液以3%接種量接種至100 mL適宜甘油三酯培養(yǎng)基及未接種菌液的適宜甘油三酯培養(yǎng)基中，37 ℃下培養(yǎng)24 h，待后續(xù)試驗。

（2）單試劑法甘油三酯含量測定[20]

將培養(yǎng)后的菌液及未接種菌液的適宜甘油三酯培養(yǎng)基分別取10 mL，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清液。用96 孔板把樣本、校準品、蒸餾水取2.5 μL分別加入樣本空、校準孔和空白孔中，然后再加250 μL 工作液混合，37 ℃孵育，用酶標儀測定OD510值。

以如下計算公式計算未接種乳酸菌的甘油三酯培養(yǎng)基中甘油三酯TG 含量和接種乳酸菌的甘油三酯培養(yǎng)基中殘留TG 含量。

用總TG 含量和殘留TG 含量以如下公式計算乳酸菌的TG 降解率。

1.2.3 菌株的膽鹽耐受性及耐酸性試驗

將傳代三次的菌液按照10%分別接種于空白對照和不同膽鹽濃度及不同pH 的MRS 培養(yǎng)基中，37 ℃，17 h 培養(yǎng)，進行一系列的稀釋，分別取適宜稀釋度的菌液1000 μL 進行活菌計數(shù)操作，每個稀釋度2 次重復，37 ℃靜置培養(yǎng)36～48 h 后測定活菌數(shù)。

不同條件處理，取樣計數(shù)測得的活菌數(shù)（用N 表示）；空白對照試驗中不同時間取樣測得的活菌數(shù)（用N0表示）；

1.2.4 降血脂功能菌株的鑒定

通過SH-QO01-004-2019 生物學檢測微生物菌種掃描電鏡方法觀察形態(tài)學特征、16S rDNA 基因序列測序及BLAST 程序進行同源性對比鑒定篩選出的降膽固醇及甘油三酯能力強且具有較高耐酸耐膽鹽能力的菌株。掃描電鏡檢測委托中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心完成，16S rDNA 基因序列測序鑒定委托中國科學院微生物研究所完成。

1.2.5 體內(nèi)降血脂試驗

1.2.5.1 動物造模

選取金黃地鼠50 只，平衡飼養(yǎng)3 d 后，按體重隨機分為5 組，每組10 只，5 組分別為：溶劑對照組，模型對照組，樣品的低、中、高劑量組[21]。溶劑對照組采用基礎飼料喂養(yǎng)，模型對照組、鼠李糖乳桿菌HCS01-013劑量組給予高脂飼料喂養(yǎng)7 d造模成功后，HCS01-013（6.5×1010CFU/g）劑量組按照1 g/k..g、2 g/k.g、4 g/k..g 劑量，灌胃喂養(yǎng)28 d，溶劑對照組與模型對照組每天灌胃等體積生理鹽水。試驗期間，各組實驗動物自由攝.食、飲水，同時，密切觀察動物體重生長情況以及給樣對動物的影響[22]。

1.2.5.2 指標檢測

給樣結束后，各組試驗動物禁食12 h，于眼眶后靜脈叢取血，（6000 ×g，5 ℃，10 min）收集上清，應用甘油三酯試劑盒測定各組實驗動物血清中甘油三酯含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

應用軟件SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)處理分析。每組試驗重復3 次，試驗結果以平均值±標準差表示，采用t檢驗進行差異分析，p＜0.05 認為差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離

從嬰兒糞便樣品中篩選分離出6 株純菌株，革蘭氏染色陽性，菌落圓形，乳白色或白色，表面凸起，呈桿狀，接觸酶陰性，初步判斷為乳酸菌[23]。

2.2 體外降膽固醇及降甘油三酯功能性的測定

2.2.1 體外降膽固醇功能性的測定

經(jīng)鄰苯二甲醛測定的6 株乳桿菌膽固醇降解試驗（圖2），由圖中可知，各菌株對膽固醇降解率差異較大，其中3 株菌的體外降膽固醇能力較強，分別為B02-09、D05-08、HCS01-013，降解率分別為49.32%，35.93%，35.40%，其降解機制可能是通過吸附或共沉淀的方式達到的，比現(xiàn)有研究如王歡等[24]用鄰苯二甲醛法篩選出的1 株具有降膽固醇功能的植物乳桿菌（降解率為24.95%）及王今雨等[25]用鄰苯二甲醛法篩選出的乳桿菌（膽固醇的降解率32.87%）降解率均高。

2.2.2 體外降甘油三酯功能的測定

經(jīng)單試劑法（GPO-PAP）甘油三酯含量測定試驗（圖3），由圖可知，各菌株對甘油三酯的降解率差異較大，菌株B02-09 為19.21%，C03-07 為35.73%、D05-08 為17.64%、E06-11 為13.29%、F08-04 為15.06%，HCS01-013 明顯高于其他菌株（p＜0.05），降解率為44.20%。阿依米熱·毛拉木等用甘油三脂試劑盒測定含量，篩選出具有降甘油三酯功能的植物乳桿菌[14]，其降解率為39.38%，干酪乳桿菌，降解率為28.43%，盧海鵬用甘油三酯試劑盒篩選出12 株具有降甘油三酯能力的鼠李糖乳桿菌，其中降解率最高的為22.4%[26]。菌株HCS01-013 的甘油三脂降解能力水平較高，可能也是通過吸附或共沉淀的方式降解，有待進一步研究，也可進一步用于在降血脂保健藥品及功能保健食品的應用研究。

2.3 菌株的膽鹽耐受性及耐酸性的測定

2.3.1 菌株的耐膽鹽能力測定結果

正常人體的小腸分泌的膽汁酸濃度一般在0.3%左右，所以菌株需要在高膽鹽環(huán)境下發(fā)揮作用，本實驗選擇4 個梯度（0.3%、0.5%、1.0%、1.5%）進行篩選，結果如表1。由表1 可見，在0.3%的膽鹽濃度環(huán)境下，6 株菌的存活率達到95.00%以上，膽鹽濃度提升到1.5%的環(huán)境下，活菌.數(shù)均有下降，僅有2 株菌存活率高于95.00%，其中HCS01-013 的存活率最高為96.79%。

表1 各菌株不同膽鹽濃度中的活菌數(shù)及存活率Table 1 The number of viable bacteria and survival rate in different bile salt concentrations of each strain

2.3.2 菌株的耐酸環(huán)境能力測定結果

菌體進入到體內(nèi)需要對相應較低酸環(huán)境，人體的胃酸pH 3.5～2.0 左右，所以菌株需要在低酸環(huán)境下發(fā)揮作用，本實驗選擇2 個梯度（pH 2.0 和pH 3.0）進行篩選，結果如表2。由表2 可見，在pH 3.0 的條件下，6 株菌的存活率達到85.00%以上，當降低到pH 2.0的條件下，活菌.數(shù)均有下降，僅有2 株菌存活率高于50.00%，綜上所述，HCS01-013 對膽鹽的耐受性及耐酸性較好。

表2 各菌株不同pH 中的活菌數(shù)及存活率Table 2 Number and viable rate in different pH of each strain

表3 菌株HCS01-013 的16S rDNA 序列同源性分析Table 3 16S rDNA sequence homology analysis of strain HCS01-013

2.4 功能菌株鑒定結果

根據(jù)降膽固醇、降甘油三酯及膽鹽耐受性試驗結果，菌株HCS01-013 具有較強的降血脂能力及膽鹽耐受能力，因此將其作為目標菌株進行鑒定。電鏡掃描顯示菌株HCS01-013 菌體呈桿狀，0.4～0.5 μm×0.7～1.3 μm，單個或成對排列，菌落呈圓形，表面凸起，白色，濕潤且邊緣整齊。結合BLAST 程序比對序列同源性分析及16s rDNA 基因序列測序鑒定結果，發(fā)現(xiàn)菌株HCS01-013 的基因序列與鼠李糖乳桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）的同源性為100%，在MEGA-X 圖形界面下構建系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株HCS01-013 在系統(tǒng)發(fā)育樹上Lactobacillus rhamnosusstrain JCM1136 在一個分支上（圖5），因此鑒定菌株HCS01-013 為一株鼠李糖乳桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）。

2.5 HCS01-013 對高血脂癥地鼠血脂影響

由表4 可知，造模第28 d，模型組與溶劑對照組相比，血清TG 含量顯著升高，說明在本實驗條件下，高血脂模型造模成功。經(jīng)過28 d 小鼠灌胃處理，低、中、高劑量組血清TG 含量均明顯下降，這說明在此劑量下鼠李糖乳桿菌對TG 有一定的調節(jié)能力。

表4 動物血清中甘油三酯含量（TG，mmol/L）Table 4 Serum triglyceride content of experimental animals in each group (TG,mmol/L)

3 結論

3.1 本實驗從健康嬰兒腸道中篩選乳酸菌，并對膽固醇與甘油三酯的降解率進行研究，首先將6 株菌株用鄰苯二甲醛法進行膽固醇降解率測定，其中有3 株菌對膽固醇降解率高于35%，分別為B02-09，D05-08，HCS01-013。經(jīng)單試劑法（GPO-PAP 法）測定6 株乳酸菌株的甘油三酯降解能力，結果菌株HCS01-013 甘油三酯降解能力最強，其降解率為44.20%，在耐酸試驗中，菌株HCS01-013 耐酸能力最強，在pH 3.0 和pH 2.0 酸性條件下培養(yǎng)17 h，存活率能達到88.76%和71.34%。在膽鹽耐受性的實驗中，通過研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過17 h 高濃度膽鹽培養(yǎng)下各菌株的活菌數(shù)和存活率都有所下降，但是各菌株的存活率都能達到60%以上，均具有較強的耐膽鹽的能力，其中HCS01-013 的膽鹽耐受能力較為突出，在1.5%的膽鹽濃度下存活率達96.79%。

3.2 盡管本次試驗在降低膽固醇、降甘油三酯作用得到實驗支持，但其機理尚未定論，目前通過實驗能夠看出在降血脂的兩項體外試驗中HCS01-013 的降解率相對較好，同時又具有較強的耐受酸及膽鹽的能力。在對高血脂癥地鼠試驗結果表明，在高脂飼料的誘導下，血液中TG 含量可明顯升高，經(jīng)過28 d 的鼠李糖乳桿菌HCS01-013 喂養(yǎng)后，金黃地鼠血清TG 含量明顯下降，這說明鼠李糖乳桿菌HCS01-013 表現(xiàn)出了有一定的體內(nèi)降甘油三酯的能力。

3.3 在降膽固醇與降甘油三酯試驗過程中所使用的為離心過后的上清液，在之后的實驗中可考慮菌體吸收是否對試驗有影響，并對其進行研究；在HCS01-013對高血脂癥地鼠血脂影響中發(fā)現(xiàn)各劑量組之間沒有表現(xiàn)出明顯的降甘油三酯量效關系，這可能與該株菌降解甘油三酯機理或者給樣時間較短有關。由于試驗條件所限，本次試驗僅對給樣后金黃地鼠血清中甘油三酯含量進行了測定，之后可增加檢測如低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等指標，考察鼠李糖乳桿菌HCS01-013對膽固醇轉化的作用，以期更全面的了解該株菌株降血脂的機理，為后續(xù)的開發(fā)和應用提供數(shù)據(jù)支持。