梁梓健，方嘉沁，吳錦源，杜方敏，符樹勇，高向陽*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東廣州 510642）

（2.廣州酒家集團利口福食品有限公司廣州市廣式焙烤食品加工工程技術研究開發(fā)中心，廣東廣州 511442）

蓮蓉是傳統(tǒng)廣式點心餡料，多用于制作具有蓮蓉風味特征的食品，尤其是廣式蓮蓉餡月餅，備受人們喜愛。蓮蓉餡料主要由干蓮子、蔗糖和食用油為原料，經(jīng)浸泡、蒸煮、磨漿、炒制、冷卻等多項工序制作而成[1]。在蓮蓉餡料的炒制過程中，高溫會促使蓮蓉餡料發(fā)生美拉德反應、油脂逐級降解、風味化合物前體降解等化學反應，從而生成多種揮發(fā)性風味化合物，賦予蓮蓉餡料獨特的風味特征[2]。蓮蓉餡料的特征香味來源于其揮發(fā)性風味化合物，是評價蓮蓉餡料產(chǎn)品品質的重要依據(jù)[3]。但目前對于蓮蓉餡料的揮發(fā)性風味化合物及其呈香特征還未見相關報道。

固相微萃?。⊿PME）具有操作簡便、靈敏度高的優(yōu)勢，常與氣相色譜質譜（GC-MS）聯(lián)合應用于傳統(tǒng)食品風味化合物的研究中，王藤等[4]利用SPMEGC-MS 技術探究了不同腌制時間對傳統(tǒng)工藝制作的火腿中揮發(fā)性風味物質的影響，發(fā)現(xiàn)不同腌制時間的火腿揮發(fā)性物質呈現(xiàn)出顯著性差異。Yao 等[5]采用SPME-GC-MS 技術分析了不同年份四川冬菜的揮發(fā)性物質差異。Attchelouwa 等[6]結合SPME-GC-MS 技術和感官評價實驗研究了傳統(tǒng)高粱啤酒中與感官指標相關的揮發(fā)性化合物。

本研究采用了5 種不同加工工藝的蓮蓉餡料，利用頂空固相微萃取氣相色譜-串聯(lián)質譜法（HS-SPMEGC-MS/MS）結合相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）分析蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分及其風味貢獻程度；并利用多元化學計量方法對不同種類蓮蓉餡料的揮發(fā)性化合物進行差異性分析，尋找特征性呈香物質，有助于了解蓮蓉餡料在生產(chǎn)過程中香氣形成的機制，旨在為蓮蓉餡料的風味品質控制與改善提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

5 種蓮蓉餡料：廣州酒家集團利口福食品有限公司提供，編號分別為C1、C2、C3、C4、C5，其中C1 為純白蓮蓉，C2 為純紅蓮蓉，C3 為大師手作純白蓮蓉，C4 為綠色食品級純白蓮蓉，C5 為低糖純白蓮蓉；正己烷：色譜純，德國Meker 公司。

1.1.2 主要儀器設備

7890B-7000D GC-MS/MS，Agilent 公司；MM400球磨儀，Retsch 公司；MS105DU 電子天平，METTLER TOLEDO 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 頂空固相微萃取

將樣品于液氮速凍后研磨，再稱取1 g 于頂空瓶中，使用萃取頭于70 ℃下對揮發(fā)性物質進行萃取收集20 min。

1.2.2 GC-MS/MS 條件

萃取結束后，萃取頭插入色譜儀進樣口，解析時間為5 min，進樣口溫度為250 ℃。

氣相條件：氣相色譜柱為DB-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣為氦氣，柱流速為1 mL/min，柱箱升溫程序為40 ℃保持5 min，然后以6 ℃/min 的速度上升至280 ℃，并持續(xù)5 min。

質譜條件：傳輸線溫度為280 ℃，離子源溫度為230 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電離電壓為70 eV，溶劑延遲5 min。

1.2.3 揮發(fā)性化合物定量定性

在MassHunter 軟件（Agilent）中獲得特征峰荷質比、保留時間和峰面積等信息，對單個峰進行過濾，只保留單組空值不多于50%或所有組中空值不多于50%的峰面積數(shù)據(jù)?；贛WGC 數(shù)據(jù)庫，對檢測到的揮發(fā)性化合物進行定性分析，以峰面積歸一法進行相對定量分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

用R 軟件（版本）進行PCA 分析；采用SIMCA-P14.1 進行PLS-DA 建模；利用IBM SPSS 25、Excel軟件和Origin 2019b 64Bit進行數(shù)據(jù)處理及作圖。

2 結果與討論

2.1 5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質分析

基于HS-SPME-GC-MS/MS 的檢測結果（5 種蓮蓉餡料總離子流圖見圖1～圖5），利用MWGC 數(shù)據(jù)庫對5種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質進行定性定量分析，結果如表1 所示，共檢測到了29 種揮發(fā)性物質，包括2 種醇類、7 種醛類、6 種酯類、4 種吡嗪類、3 種烷烴類、2 種呋喃類、2 種酮類、1 種萜類、1 種噻吩類、1 種其他類?？傠x子流圖，并對各類別揮發(fā)性成分進行顯著性差異分析（p＜0.05），以不同類別的揮發(fā)性成分為橫坐標，相對百分比含量為縱坐標繪制柱形圖，如圖6 所示。

表1 5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性物質相對百分含量Table 1 Relative percentage of volatile components in 5 kinds of lotus seed paste fillings

續(xù)表1

結果顯示，5 種蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分組成類似，其中醛類（18.38%～36.45%）、酯類（9.97%～23.88%）和吡嗪類（19.07%～29.38%）的化合物含量較多，是主要的揮發(fā)性物質。醛類化合物多來源于脂質的自動氧化、β-氧化和氨基酸的降解[7]。由于蓮蓉餡料的制備加入了大量的花生油，在加工過程中油脂發(fā)生氧化反應降解生成醛類物質。蓮蓉餡料中檢測到的醛類化合物有己醛、糠醛、(Z)-2-庚烯醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛和3-甲基苯甲醛，其中糠醛只有在C2 中檢測到。酯類物質是由醇類化合物和游離脂肪酸反應而成，大多酯類化合物的呈味閾值較高，由長鏈脂肪酸生成的酯類化合物主要呈現(xiàn)為油脂的香味，而短鏈脂肪酸生成的酯類化合物則呈現(xiàn)花、果香味的氣味特征[8]。被檢測到的酯類物質有苯甲酸甲酯、庚酸乙酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、環(huán)丁烷羧酸3-甲基丁酯和乙酸(二乙氧基)甲酯。吡嗪類和呋喃類化合物都是雜環(huán)類化合物，其有著較低的呈味閾值，是食品中常見的風味化合物，主要來源于食品加工過程中糖和氨基酸的美拉德反應，以及硫胺素和氨基酸的自身的降解，多數(shù)具有典型的烘烤香味[9,10]。被檢測到的吡嗪類化合物有2,6-二甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5,-三甲基吡嗪和3-乙基2,5-二甲基吡嗪。由此可知，蓮蓉餡料的呈香物質主要來源于生產(chǎn)工藝中的脂肪氧化、美拉德反應和風味前體物質降解等化學反應，構成了蓮蓉餡料的特征風味。

2.2 揮發(fā)性成分主成分分析

PCA 能對多維度的復雜數(shù)據(jù)進行降維處理，以少數(shù)變量的數(shù)據(jù)表達出原始數(shù)據(jù)的大部分信息[11]。對5種蓮蓉餡料揮發(fā)性成分的峰強進行PCA 分析，其二維空間分布圖如圖7。

PCA 分析中提取了2 個主成分，其方差貢獻率分別為44.83%和21.12%，累計方差貢獻率達65.95%，說明原始數(shù)據(jù)的大部分信息能夠被這兩個主成分解釋，可反映出不同蓮蓉餡料揮發(fā)性成分的組間與組內(nèi)關系。上述樣品的組內(nèi)距離接近，說明同類樣品的不同批次間的揮發(fā)性物質組成類似，產(chǎn)品品質穩(wěn)定性高，試驗重復性較好?？傮w上，5 種蓮蓉餡料在PCA 二維圖中能明顯區(qū)分，C1、C2、C4 和C5 在第一主成分中的距離較分散，表明這4 種蓮蓉餡料的差異主要體現(xiàn)在PC1 中，C3 與其他樣品差異主要體現(xiàn)在PC2 中。C2 和C3 有局部的重疊，說明兩種蓮蓉餡料的揮發(fā)性成分存在一定的相似性。

2.3 5 種蓮蓉餡料揮發(fā)性成分差異分析

偏最小二乘判別分析（PLS-DA）能夠將X 矩陣信息分解成與Y 相關和不相關的兩類信息，通過去除不相關的差異來篩選差異變量，找到不同蓮蓉餡料的揮發(fā)性差異代謝物[12]。利用SIMCA 軟件對不同蓮蓉餡料揮發(fā)性成分建立PLS-DA 模型進行分析。模型中R2 表示模型的擬合程度，Q2 表示模型對新數(shù)據(jù)的預測能力。一般來說，R2 和Q2 越接近1 說明模型越好。本實驗所構建的PLS-DA 模型里，Q2 為0.97，R2X為0.97，R2Y 為0.98，模型穩(wěn)定且預測能力高。用置換檢驗法評估模型的有效性，如圖3 所示。所建模型的Q2 始終大于隨機模型的Q2，且截距＜0，說明模型沒有過擬合的情況，可以作為評價不同蓮蓉餡料揮發(fā)性物質差異的模型。

如圖9 所示，PLS-DA 模型中的變量投影重要性值（VIP）可以表示為各揮發(fā)性物質對于5 種蓮蓉餡料的差異貢獻度，物質VIP 值越大，對蓮蓉餡料的差異貢獻程度越大。選取VIP 值＞1 的揮發(fā)性物質作為主要差異物質（圖9 中紅色部分），分別為糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、乙酸(二乙氧基)甲酯、2-氯-2-硝基-丙烷、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷，共10 種揮發(fā)性物質。

對上述VIP＞1 的10 種物質進行單因素方差分析，保留具有顯著性差異（p＜0.01）的揮發(fā)性物質，進一步在不同種蓮蓉餡料樣品中篩選出8 種重要差異物質，分別為：糠醛、E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。如圖10 所示，利用聚類熱圖對上述重要差異物質進行可視化分析，得出C1 蓮蓉餡料的標志揮發(fā)性物質為(±)-3-蒈烯-2,5-二酮，C2 為糠醛，C3 為E,E-2,4-癸二烯醛和苯甲醛、C4 為正壬醛、C5 為十四烷。

2.4 5 種蓮蓉餡料主要揮發(fā)性化合物香氣特征分析

揮發(fā)性化合物對風味的影響由物質含量與呈味閾值共同決定，相對氣味活度值（ROAV）能相對反映出風味成分在產(chǎn)品中的風味貢獻程度，一般認為ROAV＞1 的風味成分為關鍵風味物質，而ROAV＞0.1的風味成分為輔助修飾風味物質[11]。查閱文獻獲得蓮蓉餡料中各風味化合物的呈味閾值，并計算出ROAV值[11]。定義E,E-2,4-癸二烯醛的相對氣味活度值為100，其余風味物質的ROVA 值如表2 所示。

表2 不同蓮蓉餡料主要揮發(fā)性風味成分的相對風味活度值Table 2 Relative odor activity value of main volatile flavor components in different lotus seed paste fillings

蓮蓉餡料中醛類化合物的累積香氣值為100.24～100.96，酯類為7.11～54.07、噻吩類為0.22～4.59，其中關鍵性風味物質有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙?；绶裕於松徣氐闹饕L味基調(diào)。而苯乙醇、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯則起到了輔助修飾蓮蓉餡料風味的作用。據(jù)報道，E,E-2,4-癸二烯醛具有雞肉香味和油脂香味，是亞油酸降解的主要產(chǎn)物[26]。其在熱反應體系中能降解生成醛類化合物，如蓮蓉餡料中的己醛和苯甲醛，這些醛類物質可以繼續(xù)與蓮蓉餡料中美拉德中間產(chǎn)物發(fā)生反應，生成愉悅的呈香物質；辛酸乙酯在C1 中的ROAV 值為53.71，明顯高于其他4 種蓮蓉餡料。其具有類似菠蘿、蘋果和雪梨等氣味的呈味特征，常被報道存在于多種水果和酒類中，是菠蘿、啤酒的主要風味物質之一[27]。也有報道稱辛酸乙酯能提升玫瑰精油的整體香氣[28]；2-乙?；绶允且环N具有核桃、硫磺氣味特征的含硫化合物，由核糖和半胱氨酸發(fā)生美拉德反應產(chǎn)生。有報道它也是肉類食品中風味貢獻物質之一[29]。

糠醛只有在C2 中被檢測出，是一種由美拉德反應生成的風味物質，具有烤面包、焦香和辛香的氣味特征[30]?？赡苁怯捎贑2 蓮蓉餡料在制備過程中添加了焦糖，從而引入了戊糖發(fā)生美拉德反應生成糠醛。據(jù)報道，蓮蓉餡料中的正辛醇、苯乙醇、己醛、糠醛、苯甲醛、正壬醛、E,E-2,4-癸二烯醛、2-乙基-5-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、3-乙基2,5-二甲基吡嗪和2-庚酮在花生油中被檢測出，這些化合物共同賦予了蓮蓉餡料類似于花生油的香氣特征[31,32]。而正辛醇、苯乙醇、己醛、苯甲醛和十四烷則在蓮子芯中檢測到[33]。

由于5 種蓮蓉餡料中的揮發(fā)性物質有著不一樣的呈味貢獻，導致每一種蓮蓉都有著獨特的香氣特征?；谏徣仞W料的呈香物質（ROVA＞0.01）和重要差異物質，兩者的共有部分可被認為是影響蓮蓉餡料呈香特性的關鍵物質（圖11），分別是E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛?？梢姡绊懮徣仞W料風味的主要風味物質是醛類化合物。

3 結論

研究采用HS-SPME-GC-MS/MS技術比較分析了5種常見蓮蓉餡料產(chǎn)品的揮發(fā)性成分，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)性物質的種類相似，主要差異物質是糠醛，E,E-2,4-癸二烯醛、(±)-3-蒈烯-2,5-二酮、苯甲醛、正壬醛、2,6-二甲基吡嗪、3-甲基苯甲醛和十四烷。由蓮蓉餡料揮發(fā)性成分的ROVA值可知，其關鍵性風味物質有E,E-2,4-癸二烯醛、辛酸乙酯和2-乙?；绶裕揭掖?、己醛、正壬醛、乙酸苯乙酯則起到了輔助修飾蓮蓉餡料呈味的作用。通過繪制主要差異物質與呈味物質的韋恩圖，發(fā)現(xiàn)E,E-2,4-癸二烯醛、正壬醛和苯甲醛的相對含量差異是影響蓮蓉餡料呈香差異的主要原因。本研究從揮發(fā)性物質的角度，分析了不同蓮蓉餡料香氣差異的來源，為蓮蓉餡料的風味特征研究和品質評價標準建立提供參考數(shù)據(jù)。