李晴晴 黃 菊 張小鳳 王月月 聶文虎 耿志軍 鮑云溪 宋 雪

1 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院中心實驗室，安徽省蚌埠市 233004；2 蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心組織移植安徽省重點實驗室； 3 蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科

髓母細(xì)胞瘤(Medulloblastoma，MB)是顱內(nèi)膠質(zhì)瘤的一種，惡性程度最高，多發(fā)于14歲以下的青少年，是死亡率較高的一類惡性腫瘤[1]。全反式維甲酸(Retinoic acid，RA)因其生物利用度高、低毒性而更適宜于兒童髓母細(xì)胞瘤的治療，但部分MB卻存在對RA敏感性不佳的問題[2]。根據(jù)生物學(xué)及遺傳學(xué)的異質(zhì)性，MB分為具有明顯特征性基因變化的4個亞型：SHH型、WNT型、G3型和G4型，其中G3型惡性程度最高，對抗腫瘤藥物的敏感差，易導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)甲基化抑制劑5-氮胞苷可以改善MB的腫瘤細(xì)胞對RA的敏感性[5]。傳統(tǒng)的甲基化抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷由于毒性較強(qiáng)而不適宜于兒童髓母細(xì)胞瘤的治療[6]。白藜蘆醇(Resveratrol，Res)是一種多酚類化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物學(xué)活性[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)Res在極低的藥物濃度下仍對抑癌基因有較強(qiáng)的去甲基化作用[9]。在此基礎(chǔ)上，本研究通過離體與在體實驗相結(jié)合，證實Res是否通過提升MB對RA的藥物敏感性，并揭示Res影響RA藥物敏感性的調(diào)控機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 以每毫升5.0×104個細(xì)胞的濃度在培養(yǎng)皿中(100mm)分別接種Med-3、UW228-2、UW228-3細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至對數(shù)期時，棄去原有的培養(yǎng)液，更換10ml新鮮培養(yǎng)液，同時按照分組加入相應(yīng)濃度的藥物，Res(Sigma,Cat#∶R5010)：25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L；RA(Sigma，Cat#∶R2625)：2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L；Res與RA；正常培養(yǎng)的細(xì)胞設(shè)為對照組(Control組)；輕輕搖勻后置于孵箱中培養(yǎng)。藥物持續(xù)作用72h后，收集各組細(xì)胞于Ep管中并保存在-80℃冰箱中。

1.2 MTT 通過3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基-四唑溴化物(MTT，Sigma，Cat#∶CT02)測定來確定藥物對細(xì)胞增殖的影響。處理后的細(xì)胞與MTT共孵育3h，使用DMSO(Sigma，Cat#∶D2650)溶解，酶聯(lián)免疫檢測儀在570nm波長處測定其OD值。

1.3 HE染色 利用細(xì)胞爬片或組織切片進(jìn)行HE染色，蘇木素染核5min，自來水洗滌；然后進(jìn)行分化數(shù)秒，自來水洗滌；再用伊紅染細(xì)胞質(zhì)5min，自來水洗滌，脫水固定。使用中性樹膠封片，自然晾干后使用顯微鏡觀察腫瘤細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量變化。

1.4 TUNEL檢測 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案脫蠟并水化組織切片，將載玻片置于含有檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)的塑料盒中，施加350W微波輻射5min。采用PBS沖洗載玻片2次，待樣品周圍干燥，在樣品上加入50μl TUNEL反應(yīng)混合物(Roche，Cat#∶11684795910)，37℃避光孵育60min，注意保持載玻片的濕潤。用PBS沖洗載玻片2次，滴加DAPI染色，在熒光顯微鏡下分析樣品。

1.5 動物模型 利用腦定位儀和顱骨鉆機(jī)在裸鼠顱骨垂直打孔(矢狀縫右側(cè)2mm，人字縫后2mm)，將UW228-2細(xì)胞(1×106個)移植入裸鼠的小腦右側(cè)半球，構(gòu)建裸鼠髓母細(xì)胞瘤原位移植模型。通過腹腔給藥：對照組(等量生理鹽水)、Res單獨給藥組(300μmol/L，0.1ml)和RA單獨給藥組(100μmol/L，0.1ml)及Res與RA聯(lián)合給藥組，聯(lián)合給藥的順序為：先進(jìn)行腹腔注射RA，5min后再給予Res。2d給藥1次，持續(xù)3周。在模型鼠出現(xiàn)發(fā)病特征(體重減輕，食欲不振，眼鼻黏膜出血，偏行或癱瘓)后密切觀察，于瀕死狀態(tài)立即麻醉、脫頸處死裸鼠，記錄生存時間。收集新鮮的組織樣本，一部分液氮(<-180℃)凍存以制備蛋白、DNA、RNA，剩余部分保存于4%福爾馬林溶液中，靜置過夜。

1.6 MRI 在細(xì)胞植入裸鼠小腦半球后的第2天進(jìn)行MRI監(jiān)測以明確腫瘤細(xì)胞在裸鼠顱內(nèi)的成瘤時間。待成瘤后將模型鼠平均隨機(jī)分為四組：正常組(不進(jìn)行任何處理)、Res治療組、RA治療組、Res聯(lián)合RA治療組。治療干預(yù)后的第3天繼續(xù)進(jìn)行MRI成像監(jiān)測(Bruker BioSpin MRI GmbH)，并PS軟件測算腫瘤的最大橫截面積。

1.7 免疫組化 對裸鼠原位瘤腦組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，使用Ki-67抗體(1∶100；Abcam，Cat#∶ab16667)以確定腫瘤細(xì)胞內(nèi)的增殖活性。經(jīng)過二甲苯脫蠟、抗原修復(fù)、孵育一抗過夜、二抗孵育、DAB顯色、染核、封片一系列操作，最后在顯微鏡下讀片分析結(jié)果。

1.8 Western blot Western blot 用于檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CRABP2及RAR/RXR蛋白水平的變化和凋亡信號通路的活化程度。使用的一抗為Bax、Bcl2、caspase3、c-caspase3、CRABP2、RAR/RXR和β-actin(Abcam；1∶100；Cat#∶ab 243140；ab 32124；ab 32351；ab 32150；ab 181255；ab 231610；ab 8226),稀釋比例為1∶800。

1.9 RT-qPCR RT-qPCR分析腫瘤組織的維甲酸代謝通路，提取腫瘤中的總RNA，通過擴(kuò)增CRABP2、RAR/RXR的相關(guān)引物,評估其mRNA水平的變化。引物序列見表1。

表1 引物序列(5’to 3’)

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS17.0軟件(SPSS Inc.，Chicago，IL)分析實驗數(shù)據(jù)。通過獨立樣本t檢驗評估兩組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)差異，并通過χ2檢驗評估分類數(shù)據(jù)。P<0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外研究

2.1.1 在體外白藜蘆醇能夠增強(qiáng)髓母細(xì)胞瘤對維甲酸的敏感性，抑制細(xì)胞增殖活性：MTT結(jié)果顯示，經(jīng)濃度10μmol/L的RA處理，Med-3細(xì)胞系顯示其本身就對RA具有高敏感性。在此濃度下，Med-3細(xì)胞的增殖活性降低，細(xì)胞數(shù)量相較對照組明顯減少(P<0.05)。而UW228-2、UW228-3細(xì)胞系在此濃度下(RA 10μmol/L)表現(xiàn)出對RA的低敏感性，細(xì)胞數(shù)量與對照組無明顯差異(P>0.05)。但是三種細(xì)胞系經(jīng)Res和RA聯(lián)合給藥處理后，細(xì)胞數(shù)量相對于單獨給藥組明顯減少(P<0.05)，這表明Res可能增強(qiáng)了MB對RA的敏感性，抑制細(xì)胞增殖活性(圖1a～c)。為了進(jìn)一步論證此結(jié)論，我們選取對照組、單獨給藥組Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)以及Res與RA聯(lián)合給藥組的細(xì)胞爬片進(jìn)行HE染色，結(jié)果顯示聯(lián)合給藥組與對照組相比腫瘤細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生神經(jīng)元樣改變，細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P<0.05)，見圖1d。以上結(jié)果均表明Res能夠明顯增強(qiáng)MB對RA的敏感性，抑制細(xì)胞增殖活性，有效減少了細(xì)胞數(shù)量。

圖1 白藜蘆醇增強(qiáng)髓母細(xì)胞瘤對維甲酸的敏感性

2.1.2 在體外白藜蘆醇能夠增強(qiáng)維甲酸誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡：為了驗證Res能否增強(qiáng)RA誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡，選取對照組、Res(12.5μmol/L)、RA(5μmol/L)和Res與RA聯(lián)合給藥組處理過的MB細(xì)胞系(Med-3、UW228-2、UW228-3)進(jìn)行TUNEL檢測，結(jié)果顯示單獨給藥處理組腫瘤細(xì)胞的凋亡數(shù)量較少，而聯(lián)合給藥組的腫瘤細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增多(P<0.05)，此結(jié)果表明Res能夠增強(qiáng)RA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(見圖2)。后續(xù)實驗考慮到低濃度Res對UW228-2細(xì)胞的增敏作用已然最佳，特選取低濃度Res和RA作為重點研究對象。這些實驗結(jié)果都證明了Res與RA聯(lián)合給藥處理可明顯誘導(dǎo)MB的凋亡。

2.1.3 白藜蘆醇和維甲酸聯(lián)合給藥能夠激活凋亡通路：為了探究Res是如何增強(qiáng)RA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，我們提取了藥物處理后的細(xì)胞，利用Westerrn Blot檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路的改變。選取MB細(xì)胞系(UW228-2)為重點研究對象，以β-actin為內(nèi)參檢測Bax、Bcl2、c-caspase3和caspase3蛋白。結(jié)果顯示對照組與單獨給藥組的抗凋亡蛋白Bax表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，而聯(lián)合給藥組的Bax蛋白表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，約為其他組的2.6倍；對于抗凋亡蛋白Bcl2的檢測結(jié)果顯示對照組與單獨給藥組的表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，而聯(lián)合給藥組的表達(dá)量相對于其他組卻顯著降低(P<0.05)；另外，對照組和聯(lián)合給藥組的c-caspase3蛋白表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，相對于聯(lián)合給藥組表達(dá)量明顯降低，而聯(lián)合給藥組的c-caspase3蛋白表達(dá)量卻顯著上調(diào)(P<0.05)，見圖3。以上結(jié)果均表明Res與RA聯(lián)合給藥能夠激活凋亡通路，進(jìn)而增強(qiáng)RA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

圖3 聯(lián)合給藥激活凋亡通路

2.1.4 白藜蘆醇通過激活RA代謝通路增強(qiáng)維甲酸敏感性：我們的研究表明在體外Res與RA聯(lián)合給藥能夠激活凋亡通路，那么Res是否凋亡激活RA代謝通路來增強(qiáng)其對RA的敏感性？于是我們通過Western Blot和RT-qPCR檢測腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CRABP2及RAR/RXR的變化。Western Blot結(jié)果顯示對照組與RA組相比，腫瘤細(xì)胞內(nèi)的CRABP2表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，而Res組與聯(lián)合給藥組相比，CRABP2的表達(dá)雖無明顯差異(P>0.05)，但這兩組比對照組和RA組的CRABP2蛋白表達(dá)量增加(P<0.05)，這提示Res能夠激活RA代謝通路(圖4a～b)。此外，Western Blot檢測結(jié)果還顯示對照組與RA組細(xì)胞內(nèi)的RAR/RXR表達(dá)量無明顯差異(P>0.05)，而Res組和聯(lián)合給藥組與其他兩組相比RAR/RXR的表達(dá)量均顯著增多(P<0.05)，此結(jié)果提示Res增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對RA的敏感性(圖4c)。為了進(jìn)一步證明此結(jié)論，我們進(jìn)行RT-qPCR檢測CRABP2及RAR/RXR的mRNA水平，其結(jié)果驗證了Western Blot的趨勢(圖4d～e)。以上結(jié)果均表明在體外Res通過激活RA代謝通路增強(qiáng)RA敏感性。

2.2 體內(nèi)研究

2.2.1 聯(lián)合給藥抑制了裸鼠顱內(nèi)腫瘤的生長并延長生存時間：體外細(xì)胞實驗結(jié)果已證明Res可能通過激活RA代謝通路增強(qiáng)RA敏感性，進(jìn)而抑制細(xì)胞活性，減少了細(xì)胞腫瘤細(xì)胞數(shù)量。因此，我們構(gòu)建裸鼠原位瘤模型來進(jìn)一步證明Res對RA具有增敏作用。建模10d后對裸鼠的腦部進(jìn)行核磁共振掃描，結(jié)果顯示對照組、Res組和RA組小鼠的顱內(nèi)腫瘤面積無明顯差異(P>0.05)；而聯(lián)合給藥組腫瘤面積相對于其他組裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長較慢，腫瘤面積明顯減少(P<0.05)，這些結(jié)果提示聯(lián)合給藥可能抑制了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞生長(圖5a～b)。此外，我們還進(jìn)行了組織病理學(xué)評估，對腦組織進(jìn)行HE染色，結(jié)果表明對照組和單獨給藥組腫瘤細(xì)胞無明顯的形態(tài)學(xué)變化，而聯(lián)合給藥組腫瘤內(nèi)的壞死細(xì)胞較多(圖5c)。同時，我們還對裸鼠原位瘤模型進(jìn)行了生存時間分析，結(jié)果顯示聯(lián)合給藥組的生存時間與其他組相比明顯延長(圖5d)。以上實驗結(jié)果均表明聯(lián)合給藥通過抑制腫瘤生長進(jìn)而改善模型小鼠的生存狀況，延長裸鼠的生存時間。

圖5 聯(lián)合給藥抑制裸鼠顱內(nèi)腫瘤生長

2.2.2 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)了裸鼠顱內(nèi)腫瘤的凋亡并抑制增殖活性：為了驗證聯(lián)合給藥是否誘導(dǎo)了裸鼠顱內(nèi)腫瘤的凋亡并抑制增殖活性，我們對各實驗組進(jìn)行TUNEL檢測，結(jié)果顯示正常組和單獨給藥組凋亡細(xì)胞數(shù)量無顯著差異(P>0.05)，而聯(lián)合給藥組與其他組相比凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.05)，這表明聯(lián)合給藥誘導(dǎo)了裸鼠顱內(nèi)腫瘤的凋亡(圖6a～b)。此外，對腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色來評估反映增殖活性的Ki67蛋白表達(dá)，結(jié)果表明正常組和單獨給藥組Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)，細(xì)胞增殖活性強(qiáng)；聯(lián)合給藥組與其他組相比Ki67的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，提示腫瘤細(xì)胞增殖活性減弱(圖6c～d)。通過以上實驗證明了聯(lián)合給藥不僅誘導(dǎo)了裸鼠顱內(nèi)腫瘤的凋亡并且還抑制腫瘤細(xì)胞的增殖活性。

圖6 聯(lián)合給藥誘導(dǎo)顱內(nèi)腫瘤凋亡

2.2.3 白藜蘆醇可體內(nèi)激活CRABP2通路增強(qiáng)維甲酸敏感性：由于體外細(xì)胞實驗結(jié)果已證明Res可激活RA代謝通路增強(qiáng)RA的敏感性，而在體內(nèi)是否與體外結(jié)果一致，為此我們選取對照組、單獨給藥組和聯(lián)合給藥組中的裸鼠顱內(nèi)腫瘤組織，提取蛋白進(jìn)行Western Blot和RT-qPCR實驗，檢測裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞CRABP2及RAR/RXR的蛋白表達(dá)及mRNA水平。實驗結(jié)果表明相對于對照組和單獨給藥組，聯(lián)合給藥組中的裸鼠顱內(nèi)腫瘤細(xì)胞的CRABP2及RAR/RXR的表達(dá)均出現(xiàn)增強(qiáng)(P<0.05)，與體外結(jié)果一致，提示Res增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對RA的敏感性(圖7)。由此可以說明Res可在體內(nèi)激活RA代謝通路進(jìn)而增強(qiáng)RA的敏感性。

3 討論

Res已被研究證實具有抗腫瘤的作用，是近年來的研究熱點[7-8]。目前研究表明Res通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤的作用：抑制細(xì)胞色素酶、誘導(dǎo)解毒酶、抑制環(huán)氧合酶、抑制蛋白激酶、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、促細(xì)胞凋亡等，并且Res的抗腫瘤機(jī)制十分復(fù)雜，可能是幾種途徑聯(lián)合發(fā)揮抗腫瘤作用[10]。同時，研究發(fā)現(xiàn)Res針對不同的腫瘤細(xì)胞類型發(fā)揮作用的時間、濃度也有差異，即不同類型的腫瘤細(xì)胞對Res的敏感性各不相同[8,11]。有研究表明Res能夠上調(diào)CRABP2及RAR/RXR的表達(dá)，證明了Res具有通過上調(diào)CRABP2，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對RA敏感度的潛力[12-13]。此外，由于Res具有多種生物學(xué)功能，并且已有研究證明其無毒性，在人體測試劑量范圍內(nèi)對人體沒有毒害[14-15]。因此，在多種疾病的治療中Res作為治療藥物或輔助治療藥物均得到廣泛應(yīng)用。

RA作為促分化劑在臨床已廣泛應(yīng)用，可激活下游維甲酸反應(yīng)元件，啟動凋亡通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，繼而引發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡[16]。于是我們基于Res具有抗腫瘤的功能及安全性較高兩個特性，設(shè)想Res與RA聯(lián)合給藥的方式在MB的治療中是否能起到提高腫瘤細(xì)胞對RA敏感性的效果。對此，我們進(jìn)行實驗研究并發(fā)現(xiàn)了Res對RA敏感性的調(diào)控。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Res可增加低敏感型髓母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(UW228-3、UW228-2)對RA的敏感性。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，UW228-2、UW228-3經(jīng)低劑量Res處理72h后，腫瘤細(xì)胞內(nèi)CRABP2及其胞內(nèi)受體RAR/RXR的表達(dá)出現(xiàn)增強(qiáng)。Res可能通過增加MB對RA的敏感性從而提高抗腫瘤效果，而Res通過激活RA代謝通路進(jìn)而增強(qiáng)RA的敏感性是其可能作用的途徑。

雖然我們的研究初步證明了Res通過激活CRABP2凋亡通路進(jìn)而增強(qiáng)RA的敏感性，促使RA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但Res是否作用于其他信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而增強(qiáng)了RA的敏感性并抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這是我們值得繼續(xù)深入探究的問題。后期對Res與RA聯(lián)合給藥對抗髓母細(xì)胞瘤的作用途徑需進(jìn)一步闡明，為MB的臨床治療方案選擇以及為改善患者的生存質(zhì)量提供理論依據(jù)。