彭伊玲，張在其，李明姣，余黃合,姚 旺，易剛強，李 斌*，王 煒

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 中醫(yī)藥民族醫(yī)藥國際聯(lián)合實驗室，長沙 410208；2湖南醫(yī)藥學(xué)院侗藥湖南省重點實驗室，懷化 418000

白毛烏蘞莓隸屬于葡萄科(Vitaceae)烏蘞莓屬(CayratiaJuss)，該屬約45種，廣泛分布于亞洲，非洲及大洋洲等世界各地，中國約有16種，主要分布在我國江西、浙江、福建、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、貴州、云南等地區(qū)，生于海拔300～2 000 m的山谷林中或山坡巖石上[1]。烏蘞莓屬植物通常具有清熱解毒，活血散瘀，利尿的功效，在民間多被用于咽喉腫痛、痢疾、癰腫、跌打腫痛、毒蛇咬傷等證的治療，也常被用于治療風(fēng)濕性疾病、泌尿系統(tǒng)感染、口腔皰疹等疾病[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示烏蘞莓屬植物具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗腫瘤活性，本屬植物主要含有黃酮類、甾體、脂類、萜類、揮發(fā)油等化學(xué)成分[3,4]。在湖南湘西北侗族聚居區(qū)，由于復(fù)雜的地勢環(huán)境和獨特的氣候環(huán)境，使得侗族人民在與自然環(huán)境和疾病的斗爭中積累了豐富的用藥經(jīng)驗，并形成了獨特的侗醫(yī)藥體系。白毛烏蘞莓作為常用侗藥，被稱為“教美姑”或“教眉庫”，其干燥地上部分被長期用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，療效確切，具有很大的開發(fā)前景，但目前尚未查到白毛烏蘞莓化學(xué)成分與現(xiàn)代藥理活性研究的相關(guān)報道。為了更合理地開發(fā)利用該植物資源，充分發(fā)揮其藥用價值，本實驗對其化學(xué)成分及體外抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活性作用開展了研究，以期為白毛烏蘞莓的進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供有利的科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

N-1300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)；6470LC/TQ型質(zhì)譜儀(安捷倫公司)；BRUKER-600超導(dǎo)核磁共振儀(Bruker公司)；HAD496酶標(biāo)儀(北京恒奧德儀器有限公司)；Micro17R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；AL204分析天平(瑞士蘇黎世的梅特勒-托利多集團)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司)。

薄層色譜硅膠G、GF254、柱色譜硅膠(100～200目，200～300目)(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠SephadexTMLH-20(瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司)；石油醚、環(huán)己烷、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、乙醇、甲醇(分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；二甲基亞砜、DMEM/F-12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、LPS、吲哚美辛(北京索萊寶科技有限公司)；胰酶細胞消化液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6炎癥因子Elisa試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；RAFLS細胞、RAW 264.7細胞(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究有限公司)。

1.2 植物材料

白毛烏蘞莓于2017年9月采集于湖南省懷化市通道侗族自治縣，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物學(xué)教研室王智鑒定為葡萄科烏蘞莓屬植物白毛烏蘞莓(CayratiaalbifoliaC.L.Li)。植物標(biāo)本(20170923)現(xiàn)存放在湖南醫(yī)藥學(xué)院侗藥湖南省重點實驗室。

1.3 提取與分離

白毛烏蘞莓干燥地上部分(1 500.00 g)經(jīng)粉碎后用75%的乙醇滲漉提取，在小于60 ℃的溫度下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓濃縮，得到460.00 g干燥浸膏。取其中235.00 g干燥浸膏于700 mL水中分散，依次用石油醚，二氯甲烷，乙酸乙酯，正丁醇萃取。萃取后浸膏分別干燥稱重得：石油醚層浸膏(12.86 g)，二氯甲烷層浸膏(12.04 g)，乙酸乙酯層浸膏(4.57 g)，正丁醇層浸膏(25.85 g)。

石油醚層浸膏(12.86 g)拌入19.00 g硅膠(200～300目)，攪拌均勻干燥后，經(jīng)硅膠柱色譜(硅膠柱8 cm × 60 cm)用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(20∶1→15∶1→10∶1→4∶1→2∶1)梯度洗脫，以5%硫酸香草醛作為顯色劑在TLC上檢識，合并后得到14個流分，記為Fr. A～Fr. N。Fr. E流分(2.00 g)用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(9∶1)系統(tǒng)等度洗脫，得到8個流分Fr. E-1～Fr. E-8，F(xiàn)r. E-1通過硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復(fù)分離，從中分離得到化合物2(10.0 mg)和化合物19(143.8 mg)。Fr. F流分(814.9 mg)用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(6∶1→5∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，得到兩個流分Fr. F-1和Fr. F-2；Fr. F-1用硅膠柱色譜以石油醚-乙酸乙酯(10∶1)系統(tǒng)等度洗脫，得到化合物1(52.6 mg)；Fr. F-2用硅膠柱色譜以氯仿-乙酸乙酯(30∶1)系統(tǒng)等度洗脫，得到化合物3(348.6 mg)。Fr. H流分(99.1 mg)先經(jīng)硅膠柱色譜以氯仿-丙酮系統(tǒng)(10∶1)系統(tǒng)等度洗脫，再經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中分離得到化合物5(4.9 mg)和化合物15(2.7 mg)。Fr. L流分(209.6 mg)用硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶0→99∶1→19∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，從中分離得到化合物17(20.9 mg)。Fr. N流分(335.1 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以二氯甲烷-甲醇(1∶0→20∶1→10∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，得到三個流分Fr. N-1～Fr. N-3；Fr. N-2流分經(jīng)重結(jié)晶純化后得到化合物4(119.3 mg)，F(xiàn)r. N-3經(jīng)硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復(fù)分離，從中分離得化合物11(2.1 mg)。

乙酸乙酯層浸膏(4.57 g)拌入6.00 g硅膠(200～300目)，攪拌均勻干燥后，經(jīng)硅膠柱色譜(硅膠柱4 cm × 60 cm)用氯仿-甲醇系統(tǒng)(1∶0→19∶1→9∶1→17∶3→4∶1→3∶1)梯度洗脫，用5%硫酸香草醛作為顯色劑在TLC上檢識，合并得到12個流分，記為Fr. Y-A～Fr. Y-L。Fr. Y-A流分(173.1 mg)通過葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中得到化合物3(50.0 mg)。Fr. Y-B流分(93.3 mg)用硅膠柱色譜分離，純氯仿洗脫，從中分離得到化合物18(63.4 mg)。Fr. Y-D流分(45.0 mg)通過凝膠柱色譜分離，洗脫體系為石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)，從中分離得到化合物9(10.0 mg)。Fr. Y-E流分(126.7 mg)用硅膠柱色譜以環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1→1∶3)系統(tǒng)梯度洗脫，從中分離得到化合物16(28.1 mg)。Fr. Y-G流分(216.4 mg)用硅膠柱色譜以環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1→1∶3)系統(tǒng)梯度洗脫后，再經(jīng)硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠柱色譜反復(fù)分離，從中分離得到化合物6(3.3 mg)，化合物12(3.0 mg)和化合物14(50.7 mg)。Fr. Y-H流分(89.1 mg)經(jīng)硅膠柱色譜以環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶2→1∶4)系統(tǒng)梯度洗脫得到兩個流分Fr. Y-H-1和Fr. Y-H-2，其中Fr. Y-H-2經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜以石油醚-氯仿-甲醇(4∶5∶1)體系等度洗脫，從中分離得到化合物13(1.9 mg)。Fr. Y-L流分(147.3 mg)用硅膠柱色譜以乙酸乙酯-甲醇(1∶0→20∶1)系統(tǒng)梯度洗脫，再經(jīng)硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠柱色譜反復(fù)分離，從中分離得到化合物10(3.5 mg)和20(1.0 mg)。Fr. Y-O流分(127.6 mg)用硅膠柱色譜以乙酸乙酯-甲醇(10∶1)系統(tǒng)等度洗脫后，再經(jīng)硅膠柱色譜和葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱色譜反復(fù)分離，從中分離得到化合物7和化合物8(22.9 mg)。

1.4 化合物抗RAFLS增殖

取對數(shù)生長期生長良好的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜(rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes，RAFLS)細胞，移除原培養(yǎng)基，用1 × PBS清洗2次，每個培養(yǎng)皿加入含0.02% EDTA的胰酶消化液500 μL于5% CO2，37 ℃的培養(yǎng)箱中消化2 min，再加入500 μL 10% FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基終止消化，充分混勻后，轉(zhuǎn)移至1 mL EP管中，以800 r/min離心5 min，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度為1 × 104個/mL種植于96孔板，100 μL/孔恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。化合物1～20用DMSO 5 mM濃度的母液，再加DMEM培養(yǎng)基分別稀釋至500 μmol/L備用。除對照組(吲哚美辛)及空白孔外，其余各組加入各化合物使其在100 μL體系終濃度為0、1、2、4、6、8、16、20 μmol/L，處理48 h后，每孔加入含有10% MTT的DMEM溶液(5 mg/mL)100 μL，37 ℃繼續(xù)孵育4 h后，小心移除孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加入100 μL DMSO在搖床上避光震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。選擇490 nm波長，在酶標(biāo)儀上測定各孔光吸收值(OD)。記錄各組的OD值，并按公式(1)計算各化合物對RAFLS細胞的IC50值。

(1)

1.5 化合物抗LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞炎癥因子生成

取對數(shù)生長期生長良好的RAW 264.7細胞，移除原培養(yǎng)基，用1 × PBS清洗2次，每個培養(yǎng)皿加入含0.02% EDTA的胰酶消化液500 μL，于5% CO237 ℃的培養(yǎng)箱中消化2 min，再加入500 μL 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，充分混勻后，轉(zhuǎn)移至1 mL EP管中，以800 r/min離心5 min，計數(shù)，調(diào)節(jié)細胞密度為1 × 104個/mL種植于96孔板，100 μL/孔恒溫箱中37 ℃培養(yǎng)24 h。除對照組(吲哚美辛)及空白孔外，其余各組加入各化合物使其在100 μL體系終濃度為0、1、2、4、6、8、16、20 μmol/L，藥物處理后的第44 h，每孔加入LPS，使其在100 μL體系終濃度為100 ng/mL，繼續(xù)放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，得到細胞上清液待測。用ELISA試劑盒嚴(yán)格按照說明書檢測各孔上清液中含有的炎性因子濃度。最后在450 nm波長條件下依序讀取各孔的OD值。根據(jù)公式(2)進行計算出各個化合物對各種炎性因子的IC50值。

(2)

2 結(jié)果

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z451 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：0.96(3H，s，H-19)，0.93(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86(3H，s，H-29)，0.84(3H，d，J=8.2 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=8.2 Hz，H-27)，0.69(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.3(C-1)，39.5(C-2)，209.3(C-3)，37.2(C-4)，57.7(C-5)，211.5(C-6)，46.8(C-7)，37.6(C-8)，53.6(C-9)，41.4(C-10)，21.8(C-11)，38.2(C-12)，43.2(C-13)，56.2(C-14)，24.2(C-15)，28.2(C-16)，56.8(C-17)，12.7(C-18)，12.2(C-19)，36.2(C-20)，18.9(C-21)，34.0(C-22)，26.2(C-23)，45.9(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.1(C-28)，12.1(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻[5]報道基本一致，故鑒定該化合物為豆甾-3,6-二酮。

化合物2無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z413 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.72(1H，br s，H-4)，1.18(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.84(3H，d，J=7.0 Hz，H-29)，0.83(3H，d，J=6.5 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.71(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：35.8(C-1)，34.1(C-2)，199.8(C-3)，123.9(C-4)，171.9(C-5)，33.1(C-6)，32.2(C-7)，35.8(C-8)，54.0(C-9)，38.7(C-10)，21.2(C-11)，39.8(C-12)，42.5(C-13)，56.0(C-14)，24.3(C-15)，28.3(C-16)，56.1(C-17)，12.1(C-18)，17.5(C-19)，36.3(C-20)，18.8(C-21)，34.0(C-22)，26.2(C-23)，46.0(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.2(C-28)，12.1(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻[6]報道基本一致，故鑒定該化合物為豆甾-4-烯-3-酮。

化合物3白色針狀結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z437 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.38(1H，br s，H-6)，1.03(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.89(3H，m，H-26)，0.88～0.86(3H，m，H-29)，0.83(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.70(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：37.4(C-1)，31.8(C-2)，72.0(C-3)，42.5(C-4)，140.9(C-5)，121.9(C-6)，32.1(C-7)，32.1(C-8)，50.3(C-9)，36.7(C-10)，21.2(C-11)，39.9(C-12)，42.5(C-13)，56.9(C-14)，24.5(C-15)，28.4(C-16)，56.2(C-17)，12.0(C-18)，19.6(C-19)，36.3(C-20)，18.9(C-21)，34.1(C-22)，26.2(C-23)，46.0(C-24)，29.3(C-25)，20.0(C-26)，19.2(C-27)，23.2(C-28)，12.1(C-29)。以上數(shù)據(jù)與文獻[7]報道基本一致，故鑒定該化合物為β-谷甾醇。

化合物4白色無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z599 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：5.37(1H，br s，H-6)，5.08(1H，d，J=7.7 Hz，H-1′)，1.01(3H，s，H-19)，0.95(3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.93～0.91(3H，m，H-29)，0.90(3H，m，H-26)，0.88(3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.68(3H，s，H-18)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：37.9(C-1)，30.7(C-2)，78.5(C-3)，39.7(C-4)，141.3(C-5)，122.3(C-6)，32.6(C-7)，32.5(C-8)，50.7(C-9)，37.3(C-10)，21.7(C-11)，40.4(C-12)，42.9(C-13)，57.2(C-14)，24.9(C-15)，29.0(C-16)，56.6(C-17)，12.4(C-18)，19.4(C-19)，36.8(C-20)，19.6(C-21)，34.6(C-22)，26.8(C-23)，46.4(C-24)，29.9(C-25)，19.8(C-26)，20.4(C-27)，23.8(C-28)，12.6(C-29)，103.0(C-1′)，75.8(C-2′)，79.0(C-3′)，72.1(C-4′)，78.9(C-5′)，63.2(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[8]報道基本一致，故鑒定該化合物為β-D-胡蘿卜苷。

化合物5無定型粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z479 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，DMSO-d6)δ：4.68(1H，s，H-29α)，4.58(1H，br s，H-29β)，1.64(3H，s，H-30)，0.93(3H，s，H-24)，0.87(3H，s，H-27)，0.86(3H，s，H-26)，0.76(3H，s，H-23)，0.64(3H，s，H-25)；13C NMR(150 MHz，DMSO-d6)δ：38.0(C-1)，26.9(C-2)，76.5(C-3)，38.2(C-4)，54.6(C-5)，17.7(C-6)，33.6(C-7)，40.0(C-8)，49.6(C-9)，36.4(C-10)，20.2(C-11)，24.8(C-12)，37.3(C-13)，41.7(C-14)，29.8(C-15)，31.4(C-16)，55.1(C-17)，46.3(C-18)，48.2(C-19)，150.0(C-20)，28.9(C-21)，36.0(C-22)，27.8(C-23)，15.4(C-24)，15.5(C-25)，15.7(C-26)，14.1(C-27)，176.9(C-28)，109.4(C-29)，18.7(C-30)。以上數(shù)據(jù)與文獻[9]報道基本一致，故鑒定該化合物為白樺脂酸。

化合物6無色針狀結(jié)晶(MeOH)；ESI-MS：m/z227 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.97(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，6.81(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.77(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.44(2H，d，J=2.1 Hz，H-2，6)，6.16(1H，t，J=2.1 Hz，H-4)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.3(C-1)，105.7(C-2)，159.7(C-3)，102.6(C-4)，159.7(C-5)，105.7(C-6)，127.0(C-7)，129.4(C-8),130.4(C-1′)，128.8(C-2′)，116.5(C-3′)，158.4(C-4′)，116.5(C-5′)，128.8(C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[10]報道基本一致，故鑒定該化合物為白藜蘆醇。

化合物7白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z413 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.35(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，7.02(1H，d，J=16.2 Hz，H-8)，6.85(1H，d，J=16.2 Hz，H-7)，6.79(1H，t，J=2.1 Hz，H-2)，6.76(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.61(1H，t，J=2.1 Hz，H-6)，6.44(1H，t，J=2.1 Hz，H-4)，4.88(1H，d，J=7.2 Hz，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.5(C-1)，108.4(C-2)，160.5(C-3)，104.1(C-4)，159.6(C-5)，107.0(C-6)，126.7(C-7)，130.0(C-8)，130.4(C-1′)，128.9(C-2′，6′)，116.5(C-3′，5′)，158.5(C-4′)，102.5(C-1′′)，75.0(C-2′′)，78.1(C-3′′)，71.5(C-4′′)，78.3(C-5′′)，62.6(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[11]報道基本一致，故鑒定該化合物為反式白藜蘆醇苷。

化合物8白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z413 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.08(2H，d，J=8.5 Hz，H-2′，6′)，6.64(2H，d，J=8.5 Hz，H-3′，5′)，6.52(1H，br s，H-2)，6.46(1H，d，J=12.2 Hz，H-8)，6.39～6.37(2H，m，H-4，6)，6.35(1H，d，J=12.2 Hz，H-7)，4.68(1H，d，J=7.2 Hz，H-1′′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：141.1(C-1)，109.2(C-2)，160.1(C-3)，103.9(C-4)，159.4(C-5)，111.1(C-6)，129.1(C-7)，131.4(C-8)，129.9(C-1′)，131.4(C-2′，6′)，116.1(C-3′，5′)，157.8(C-4′)，102.3(C-1′′)，74.8(C-2′′)，78.0(C-3′′)，71.1(C-4′′)，77.8(C-5′′)，62.2(C-6′′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[12]報道基本一致，故鑒定該化合物為順式白藜蘆醇苷。

化合物9淡黃色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z160 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：13.03(1H，s，-COOH)，8.91(1H，d，J=7.9 Hz，H-4)，8.55(1H，d，J=2.8 Hz，H-2)，7.65(1H，br d，J=8.1 Hz，H-7)，7.45(1H，ddd，J=8.1，7.0，1.1 Hz，H-5)，7.36(1H，td，J=8.1，7.0，1.1 Hz，H-6)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：168.2(COOH)，133.2(C-2)，110.2(C-3)，122.5(C-4)，122.1(C-5)，123.2(C-6)，113.0(C-7)，138.2(C-8)，128.1(C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻[13]報道基本一致，故鑒定該化合物為1H-吲哚-3-羧酸。

化合物10白色粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z245 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：6.86(1H，dd，J=15.9，0.9 Hz，H-7)，6.53(1H，dd，J=15.9，6.1 Hz，H-8)，4.93(1H，ddd，J=15.7，10.2，4.3 Hz，H-3)，4.79(1H，p，J=6.1 Hz，H-9)，2.61(1H，t，J=11.9 Hz，H-2β)，2.51(1H，ddd，J=12.2，4.2，2.0 Hz，H-4α)，2.49(1H，t，J=11.9 Hz，H-2α)，2.07(1H，ddd，J=12.2，4.2，2.0 Hz，H-4β)，1.69(3H，s，H-12)，1.69(3H，s，H-13)，1.52(3H，d，J=6.4 Hz，H-10)，1.29(3H，s，H-11)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：40.3(C-1)，47.1(C-2)，64.1(C-3)，46.9(C-4)，76.9(C-5)，78.4(C-6)，130.4(C-7)，136.4(C-8)，68.2(C-9)，24.9(C-10)，27.7(C-11)，26.3(C-12)，27.7(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻[14]報道基本一致，故鑒定該化合物為 (3S,5R,6S,7E)-megastigma-7-ene-3,5,6,9-tetrol。

化合物11無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z231 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：4.83(1H，d，J=7.8 Hz，H-1)，4.05(1H，t，J=8.2 Hz，H-2)，4.26～4.29(1H，m，overlap，H-3)，4.23～4.26(1H，m，overlap，H-4)，3.96(1H，m，H-5)，4.57(1H，dd，J=11.8，2.1 Hz，H-6α)，4.39(1H，dd，J=11.8，5.5 Hz，H-6β)，3.69(1H，dq，J=9.4，7.0 Hz，H-1′α)，4.10(1H，dq，J=9.4，7.0 Hz，H-1′β)，1.19(3H，t，J=7.1 Hz，H-2′)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：105.9(C-1)，75.4(C-2)，78.8(C-3)，71.9(C-4)，78.7(C-5)，63.0(C-6)，65.2(C-1′)，15.8(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[15]報道基本一致，故鑒定該化合物為乙基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物12無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z241 [M+K]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：6.23(1H，s，H-2)，2.77(1H，m，H-4α)，3.76(1H，d，J=12.3 Hz，H-6)，2.46(1H，m，H-4β)，2.42(3H，s，3-CH3)，2.13(1H，m，H-5α)，1.86(1H，m，H-5β)，1.52(1H，s，H-8)，1.48(3H，s，7-CH3)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：169.7(C-1)，117.9(C-2)，159.8(C-3)，39.1(C-4)，30.7(C-5)，78.5(C-6)，72.9(C-7)，26.4(C-8)，19.2(3-CH3)，26.2(7-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[16]報道基本一致，故鑒定該化合物為6,7-二羥基-3,7-二甲基-2-辛烯酸。

化合物13無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z155 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：5.00(1H，m，H-4)，4.91(1H，m，H-5)，4.13(1H，dd，J=12.2，3.4 Hz，H-6α)，4.03(1H，dd，J=12.2，3.2 Hz，H-6β)，3.33(1H，dd，J=17.5，6.7 Hz，H-3α)，2.86(1H，dd，J=17.5，2.5 Hz，H-3β)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：177.0(C-2)，39.5(C-3)，69.2(C-4)，89.8(C-5)，62.1(C-6)。以上數(shù)據(jù)與文獻[17]報道基本一致，故鑒定該化合物為D-(+)-核糖酸-γ-內(nèi)酯。

化合物14無定型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z153 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，C5D5N)δ：8.37(1H，d，J=1.9 Hz，H-2)，8.10(1H，dd，J=8.2，1.8 Hz，H-6)，7.33(1H，d，J=8.2 Hz，H-5)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：123.3(C-1)，117.9(C-2)，146.7(C-3)，151.8(C-4)，115.9(C-5)，123.5(C-6)，169.1(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻[18]報道基本一致，故鑒定該化合物為3,4-二羥基苯甲酸。

化合物15無色結(jié)晶(CHCl3)；ESI-MS：m/z133 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.77～6.74(1H，m，H-4，5)，6.67～6.64(1H，m，H-3，6)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：146.3(C-1，2)，116.4(C-3，6)，120.9(C-4，5)。以上數(shù)據(jù)與文獻[19]報道基本一致，故鑒定該化合物為鄰苯二酚。

化合物16白色結(jié)晶型粉末(MeOH)；ESI-MS：m/z141[M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.87(2H，d，J=8.7 Hz，H-3，4)，6.80(2H，d，J=8.7 Hz，H-2，5)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：163.3(C-1，6)，116.0(C-2，5)，133.0(C-3，4)。以上數(shù)據(jù)與文獻[20]報道基本一致，故鑒定該化合物為己二烯二酸。

化合物17白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z355 [M+H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：5.41～5.31(4H，m，H-9,10,11,12,13)，4.21(1H，dd，J=11.7，4.5 Hz，H-1′α)，4.15(1H，dd，J=11.7，6.2 Hz，H-1′β)，3.93(1H，br s，H-2′)，3.70(1H，dd，J=11.4，3.5 Hz，H-3′α)，3.62(1H，dd，J=11.4，5.7 Hz，H-3′β)，2.79(2H，t，J=6.8 Hz，H-11)，2.37(2H，t，J=7.6 Hz，H-2)，2.09～2.01(4H，m，H-8，14)，1.66～1.61(2H，m，H-3)，1.38～1.25(14H，m，H-4～7，15，17)，0.91(3H，t，J=6.9 Hz，H-18)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：174.5(C-1)，34.3(C-2)，25.1(C-3)，29.2～29.7(C-4～7，15)，27.4(C-8)，128.2(C-9)，130.4(C-10)，25.8(C-11)，130.2(C-12)，128.0(C-13)，27.3(C-14)，31.7(C-16)，22.7(C-17)，14.2(C-18)，65.3(C-1′)，70.4(C-2′)，63.5(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻[21]報道基本一致，故鑒定該化合物為9,12-亞油酸-2′,3′-二羥基丙酯。

化合物18白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z321 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.36(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.65(2H，p，J=7.5 Hz，H-3)，1.38～1.27(30H，m，H-4～18)，0.90(3H，t，J=7.0 Hz，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.9(C-1)，34.2(C-2)，24.8(C-3)，29.2～29.9(C-4～16)，32.1(C-17)，22.9(C-18)，14.3(C-19)。以上數(shù)據(jù)與文獻[22]報道基本一致，故鑒定該化合物為正十九烷酸。

化合物19白色粉末(CHCl3)；ESI-MS：m/z255 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：2.35(2H，t，J=7.5 Hz，H-2)，1.66～1.61(2H，p，J=7.5 Hz，H-3)，1.35～1.25(24H，m，H-4～15)，0.88(3H，t，J=7.0 Hz，H-16)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：179.9(C-1)，34.1(C-2)，24.8(C-3)，29.2～29.8(C-4～13)，32.1(C-14)，22.9(C-15)，14.3(C-16)。以上數(shù)據(jù)與文獻[23]報道基本一致，故鑒定該化合物為正十六烷酸。

化合物20白色粉末(CHCl3)；HRESI-MS：m/z295 [M-H]-；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.97(1H，d，J=16.0 Hz，H-4)，6.38(1H，d，J=16.0 Hz，H-5)，5.86(1H，br s，H-2)，3.84(1H，tt，J=10.8，7.1 Hz，H-3′)，2.27(1H，ddd，J=14.2，7.0，1.5 Hz，H-2′α)，2.07(3H，s，3-CH3)，1.90(1H，ddd，J=13.5，7.0，1.5 Hz，H-4′α)，1.85(1H，dd，J=14.2，10.1 Hz，H-2′β)，1.73(1H，dd，J=13.5，11.1 Hz，H-4′β)，1.35(3H，s，1′-CH3)，1.09(3H，s，5′-CH3)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：171.0(C-1)，122.7(C-2)，147.5(C-3)，133.5(C-4)，131.1(C-5)，89.9(C-1′)，42.3(C-2′)，65.2(C-3′)，41.0(C-4′)，53.5(C-5′)，181.1(C-6′)，82.8(C-7′)，20.9(3-CH3)，18.5(1′-CH3)，14.5(5′-CH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻[24]報道基本一致，故鑒定該化合物為rel-5-(3S,8S-dihydroxy-1R,5S-dimethyl-7-oxa-6-oxobicyclo[3,2,1]oct-8-yl)-3-methyl-2Z,4E-pentadienoic acid。

2.2 化合物抗RAFLS增殖活性

MTT法測試20個單體化合物對RA-FLS細胞增殖抑制活性結(jié)果顯示，化合物1、15、19和20對RA-FLS的增殖具有一定的抑制活性，但小于陽性對照藥物吲哚美辛，其IC50值分別為23.07、26.92、23.59及19.22 μmol/L。

2.3 化合物抗LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞炎癥因子生成活性

化合物抗LPS誘導(dǎo)的RAW 264.7細胞炎癥因子生成的影響結(jié)果顯示，化合物1、15、19和20均能抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞中炎性因子TNF-α生成，IC50值分別為13.58、18.51、13.45及9.58 μmol/L，化合物15和20能抑制LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞中炎性因子IL-1β、IL-6的生成，其IC50值分別為13.56、17.30和14.42、8.71 μmol/L。

3 結(jié)論

侗藥“教美姑”在湖南湘西北侗族聚居區(qū)被長期用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，療效確切，為了更合理地開發(fā)利用該植物資源，本文對其化學(xué)成分開展了研究，綜合運用多種色譜分離方法，從白毛烏蘞莓地上部分75%乙醇提取物中首次分離得到了20個化合物，并鑒定了它們的結(jié)構(gòu)。其中除化合物3和4外，其他化合物均為首次從烏蘞莓屬植物中分離得到，進一步明確了白毛烏蘞莓的物質(zhì)基礎(chǔ)。評價了各化合物對RAFLS細胞體外增殖抑制活性，及對LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細胞中炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6生成的影響，發(fā)現(xiàn)部分化合物具有中等強度的抗炎活性，其活性可能與其抑制炎性因子的生成有關(guān)，但白毛烏蘞莓抗類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制還需通過系統(tǒng)的體內(nèi)外實驗進一步深入研究。本文的研究結(jié)果可為白毛烏蘞莓的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升、進一步開發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定的實驗依據(jù)。