焦思宇，姚先超，史永桂，林春燕，唐潘露，林日輝*

（廣西民族大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，廣西多糖材料與改性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，林產(chǎn)化學(xué)與工程國(guó)家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西林產(chǎn)化學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530006）

原花青素（procyanidins，PC）又稱為縮合單寧，是一類由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素通過(guò)CüC鍵縮合而形成的聚合物，廣泛存在于自然界許多植物當(dāng)中。具有較強(qiáng)的抗氧化活性、抗癌性、抗菌或病毒，以及心臟保護(hù)作用。因此被廣泛應(yīng)用在藥品、食品、化妝品等領(lǐng)域。PC最早由Joslyn等在1967年發(fā)現(xiàn)，他們從葡萄皮和葡萄籽提取物中分離出4 種多酚類化合物，它們?cè)谒嵝约訜釛l件下可產(chǎn)生紅色的花青素，這類多酚類化合物統(tǒng)稱為前花青素或原花青素。迄今為止對(duì)PC的研究已有50多年的歷史，近幾年P(guān)C已成為癌癥和炎癥管理的治療劑。據(jù)報(bào)道，PC還可以保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。方健等研究秀麗莓PC對(duì)糖尿病小鼠胰腺組織的保護(hù)作用，研究結(jié)果表明秀麗莓PC通過(guò)激活PI3K/AKT/Nrf2信號(hào)通路，減輕糖尿病小鼠的胰島細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，從而使糖尿病小鼠損傷的胰腺組織得到改善。Zhang Zhifeng等向經(jīng)過(guò)HO處理的成骨細(xì)胞MC3T3-E1中加入原花青素，并以不加原花青素作為對(duì)照組，探討PC是否通過(guò)其抗氧化活性在成骨細(xì)胞MC3T3-E1中發(fā)揮抗凋亡作用，其結(jié)果表明PC通過(guò)改善線粒體功能和抑制p53信號(hào)的激活，保護(hù)MC3T3-E1成骨細(xì)胞免受HO誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和凋亡。然而PC極易被氧化、生物利用率低、半衰期短，此外，PC在堿性和中性條件下不穩(wěn)定，而在人類胃轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中穩(wěn)定，這些限制了其在給藥領(lǐng)域的應(yīng)用。Jiang Suwei等通過(guò)制備殼聚糖改性多孔淀粉負(fù)載PC，其負(fù)載量為53 mg/g左右，并證明了殼聚糖改性多孔淀粉對(duì)PC的吸附是化學(xué)吸附或者強(qiáng)表面絡(luò)合作用而不是傳質(zhì)，但沒(méi)有考慮負(fù)載后PC的抗氧化性。Chen Rencai等通過(guò)離子交聯(lián)法以海藻酸鈉、氯化鈣和殼聚糖為原料制備了包油漂珠，并成功對(duì)PC進(jìn)行包埋，包封率為88.84%，且包埋后的PC在模擬胃液緩釋時(shí)間超過(guò)12 h，從而延長(zhǎng)原花青素的胃滯留給藥時(shí)間。因此開(kāi)發(fā)新的材料負(fù)載PC，在提高其負(fù)載量的同時(shí)又能提高其穩(wěn)定性成為了研究的熱點(diǎn)。

殼聚糖（chitosan，CS）具有良好的可降解性、抗菌性、生物相容性等特性故被廣泛研究與應(yīng)用在醫(yī)藥、食品、抗菌劑等方面。基于其優(yōu)良的性能、來(lái)源廣泛和成本低廉等特點(diǎn)，已成為一種優(yōu)良的藥物載體。將CS進(jìn)行微米化、納米化改性，從而提高其負(fù)載各種藥物的能力。Luo Chao等采用離子交聯(lián)法制備出殼聚糖/磷酸鈣花狀微粒，以槲皮素為模型藥物進(jìn)行包埋，包封率為80%，并在pH 5.8和pH 7.4條件下進(jìn)行體外緩釋實(shí)驗(yàn)，其結(jié)果表明這種殼聚糖負(fù)載基材不僅具有緩釋作用，還具有pH值敏感釋藥特性，其累計(jì)釋藥時(shí)間可達(dá)24 h以上，并證明藥物釋放機(jī)制均符合Korsmeyer-Peppas模型。此外劉向陽(yáng)等采用離子交聯(lián)法制備了多肽殼聚糖川芎嗪納米粒，通過(guò)納米多肽對(duì)殼聚糖進(jìn)行修飾，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞的靶向治療，為CS供藥載體的靶向治療提供依據(jù)。因此，CS作為藥物載體方面被廣泛研究。

為了提高PC的穩(wěn)定性，并基于CS的良好生物特性以及來(lái)源廣泛等特點(diǎn)，本研究采用離子交聯(lián)法制備具有較大比表面積的殼聚糖微花（chitosan microflowers，CSMF），以PC作為模型藥物，從而對(duì)其進(jìn)行高效負(fù)載。研究原花青素殼聚糖微花（procyanidins chitosan microflowers，PC-CSMF）的負(fù)載效果、緩釋性能和藥物保護(hù)作用，為CS用于負(fù)載多酚類藥物提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CS（脫乙酰度≥95%）、三聚磷酸鈉（sodium tripolyphosphate，TPP，分析純） 上海麥克林生化有限公司；PC（生物試劑）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH，生物試劑）上海源葉生物科技有限公司；冰醋酸（分析純） 上海阿拉丁生化技術(shù)有限公司；過(guò)氧化氫（分析純） 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水乙醇（分析純） 成都市科隆化學(xué)品有限公司；胰蛋白酶（生物試劑） 北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；FD-A10N-50冷凍干燥機(jī) 上海皓莊儀器有限公司；TG1650-WS型臺(tái)式高速離心機(jī) 上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；MQL-61R立式振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；SUPRA 55 Sapphire型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國(guó)卡爾蔡司公司；MiniFlex600 X射線衍射儀日本理學(xué)公司；K-Alpha X射線光電子能譜 賽默飛世爾科技公司；TGA55熱重分析儀 美國(guó)TA儀器。

1.3 方法

1.3.1 CSMF的制備

采用改進(jìn)離子交聯(lián)法制備CSMF。用HO和超聲對(duì)CS冰醋酸溶液進(jìn)行預(yù)處理。并在超聲條件下加入TPP溶液，從而得到CSMF懸濁液，將懸濁液離心凍干后得到樣品。

1.3.2 PC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參考李書(shū)藝等的方法，將PC溶于水中，并稀釋為不同的質(zhì)量濃度梯度PC溶液，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量波長(zhǎng)280 nm處吸光度。以PC質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/mL），吸光度為縱坐標(biāo)。得到PC的標(biāo)準(zhǔn)曲線為=11.94＋0.003 67，=0.999 8。

1.3.3 PC-CSMF的制備及負(fù)載量的測(cè)定

參照史永桂等的負(fù)載方法，取0.05 g CSMF為吸附劑放入10 mL的離心管中，并向管中加入5 mL的PC溶液，將離心管用錫紙包裹放在血液混勻器進(jìn)行吸附，并以不加CSMF的同質(zhì)量濃度PC溶液作為對(duì)照。

將負(fù)載后的PC-CSMF于6 500 r/min離心5 min，并取50 μL上清液于10 mL的棕色比色管中，并用去離子水將其稀釋200 倍。搖勻后在紫外分光光度計(jì)下測(cè)量吸光度，PC吸附量按式（1）計(jì)算：

式中：為吸附載藥量/（mg/g）；為PC溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為吸附后的PC溶液質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為PC溶液體積/mL；為CSMF吸附劑用量/g。

1.3.4 樣品表征

場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡表征：取一定量干燥的CSMF和PC-CSMF通過(guò)導(dǎo)電膠均勻地分散到樣品臺(tái)上，輕輕吹去多余的浮樣，置于真空鍍膜儀下噴鍍鈀金，制成電鏡觀察樣品，在掃描電鏡下拍攝具有代表性的不同放大倍數(shù)下的淀粉顆粒性形貌，加速電壓為10 kV。

傅里葉變換紅外光譜儀分析：采用KBr壓片法，取1～2 mg樣品與干燥的KBr粉末混合并壓制成薄膜層，然后通過(guò)傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)量。樣本掃描波長(zhǎng)范圍為4 000～400 cm，平均32 次掃描，分辨率為4 cm。

X射線衍射儀分析：使用日本理學(xué)公司MiniFlex600型X射線衍射儀對(duì)樣品進(jìn)行X射線衍射儀分析，Cu（Kα）射線，Ni片濾波，電壓40 kV，電流15 mA，掃描范圍2為4 °～60 °，掃描速率為2 °/min，掃描步長(zhǎng)為0.02 °。

熱重分析儀分析：使用熱分析儀通過(guò)熱重分析研究了粉末樣品的熱穩(wěn)定性，即在氮?dú)鈿夥障拢瑢⒋蠹s10 mg樣品以20 ℃/min的升溫速率從35 ℃加熱到800 ℃。

X射線光電子能譜分析：X射線光電子能譜數(shù)據(jù)是使用工作在6 mA和12 kV的消色差A(yù)l Kα X射線源獲得的。使用平均10 次掃描收集全元素光譜，通過(guò)能量為100 eV，掃描范圍為1 400～0 eV。使用平均5 次掃描收集單元素光譜，通過(guò)能量50 eV，步長(zhǎng)為0.05 eV。

1.3.5 吸附條件對(duì)CSMF吸附劑吸附性能的影響

取0.5 g的CSMF作為吸附劑加入到5 mL一定質(zhì)量濃度PC溶液中，在立式振蕩培養(yǎng)箱以150 r/min進(jìn)行振蕩吸附，吸附完成后離心取上清液，測(cè)定上清液中PC的質(zhì)量濃度，并以負(fù)載量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別改變吸附溶液體系PC的初始質(zhì)量濃度（吸附劑用量0.5 g，吸附溫度27 ℃，吸附時(shí)間5 min）、吸附溫度（吸附劑用量0.5 g，PC初始質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8 mg/mL，吸附時(shí)間5 min），考察各因素對(duì)CSMF吸附性能的影響。

1.3.6 體外模擬緩釋

參考楊慧等體外模擬緩釋實(shí)驗(yàn)方法，取0.1 g的PC-CSMF（載藥量為343.83 mg/g）溶于50 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS）中（含有胰蛋白酶），于轉(zhuǎn)速100 r/min、溫度37 ℃懸浮釋放。并分別在1、2、3、4、6、8、10、12 h和24 h取1 mL的緩釋溶液（同時(shí)補(bǔ)充同溫等量緩釋溶液）。根據(jù)式（2）計(jì)算累計(jì)釋藥百分率（）：

式中：C為第次置換時(shí)釋放液中的PC的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為PC-CSMF的載藥量/（mg/g）；為PC-CSMF的質(zhì)量/g；為置換介質(zhì)的次數(shù)；為釋放介質(zhì)置換體積/mL；為起始釋放液體積/mL。

1.3.7 抗氧化性能分析

參考韋獻(xiàn)雅等的DPPH自由基清除率測(cè)定方法。配制質(zhì)量濃度為50 μg/mL的DPPH溶液，避光貯藏。稱取10 mg的PC-CSMF（載藥量為254.96 mg/g）加入到10 mL的DPPH溶液中，在血液混勻器上避光混合，并分別在10、20、40、60 min和120 min離心取上清液于紫外分光光的度計(jì)波長(zhǎng)515 nm處測(cè)得吸光度。根據(jù)式（3）計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：為未加載藥顆粒DPPH自由基吸光度；為加入載藥顆粒反應(yīng)后DPPH自由基吸光度；為載藥顆粒加無(wú)水乙醇在波長(zhǎng)515 nm處的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次重復(fù)，采用Excel 2010進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用Origin Pro 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)和結(jié)果進(jìn)行擬合分析及作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品表征

2.1.1 掃描電鏡分析

由圖1a可知，經(jīng)過(guò)離子交聯(lián)法制得CSMF形貌為三維的微花結(jié)構(gòu)，花狀微粒直徑為1～1.5 μm，由厚度約為30 nm的片狀花瓣組成的。微粒表面的片層結(jié)構(gòu)極大增加了微粒的比表面積，比表面積測(cè)試結(jié)果為48.9 m/g，極大提高了微粒的吸附性能，且層與層之間有一定的間隙，使更多的結(jié)合位點(diǎn)裸露出來(lái)，進(jìn)而使吸附質(zhì)更加容易結(jié)合在微粒表面，提高了微粒的吸附量。由圖1b可知，CSMF經(jīng)過(guò)吸附負(fù)載PC后，其大致形貌基本不變，但是負(fù)載后CSMF的粒徑比負(fù)載前的略微增大，其原因可能為CSMF在水中吸附親水性物質(zhì)PC時(shí)，導(dǎo)致更多水分子進(jìn)入CSMF中，進(jìn)而使其產(chǎn)生溶脹，造成其粒徑增大。其次，吸附PC后的CSMF形貌由之前的扁平狀變?yōu)闄E圓形或球形，且層與層之間的間距變小，這是PC被吸附CSMF瓣層之間所導(dǎo)致的結(jié)果。

圖1 CSMF（a）和PC-CSMF（b）電鏡圖Fig.1 SEM images of CSMF (a) and PC-CSMF (b)

2.1.2 傅里葉變換紅外光譜分析

為驗(yàn)證PC是否被負(fù)載成功，對(duì)CSMF、PC和PCCSMF進(jìn)行傅里葉變換紅外光譜表征，結(jié)果如圖2所示：CSMF在1 639、1 541 cm和1 382 cm有明顯的吸收峰，分別歸因于為酰胺I的伸縮振動(dòng)（C＝O），酰胺II的彎曲振動(dòng)（NüH）和酰胺Ⅲ的伸縮振動(dòng)（CüN），1 077 cm和893 cm處的吸收峰歸因于CüOüC的伸縮振動(dòng)峰和-1,4-糖苷鍵（OüCüO）的振動(dòng)峰。PC在1 612、1 522 cm和1 444 cm處有明顯吸收峰，這些都?xì)w因于芳香環(huán)的振動(dòng)峰，表示有苯環(huán)結(jié)構(gòu)。在CSMF對(duì)PC進(jìn)行吸附后，PC-CSMF在1 620、1 526 cm和1 393 cm處還存在酰胺的振動(dòng)峰，而1 448 cm處的峰是苯環(huán)振動(dòng)峰，表明PC成功被負(fù)載到CSMF上。

圖2 CSMF、PC和PC-CSMF傅里葉變換紅外光譜Fig.2 FTIR spectra of CSMF, PC and PC-CSMF

由圖2可知，吸附后多一個(gè)1 448 cm峰，其為苯環(huán)振動(dòng)峰，表示PC被成功負(fù)載。而吸附后酰胺峰的強(qiáng)度和位置都發(fā)生了改變，其原因可能為PC的芳香環(huán)振動(dòng)峰和酰胺的振動(dòng)峰相互協(xié)同作用下導(dǎo)致其強(qiáng)度和位置發(fā)生了改變。進(jìn)而推測(cè)PC的負(fù)載并不會(huì)改變CSMF的結(jié)構(gòu)，可以認(rèn)為CSMF對(duì)PC的吸附為物理吸附。

2.1.3 X射線衍射分析

由圖3可知，CSMF在11.9 °和18.6 °附近有明顯的衍射峰，其原因?yàn)镃S和TPP之間發(fā)生了電荷作用，證明CSMF的生成，這些結(jié)晶峰體現(xiàn)了CSMF的多結(jié)晶結(jié)構(gòu)，也可以稱之為“肌鍵”水合多晶體，其形成的原因?yàn)镃SMF強(qiáng)分子間氫鍵導(dǎo)致其CS鏈緊密排列所致；由圖3可知，兩者沒(méi)有顯著差異，PC-CSMF衍射峰的位置也都在11.9 °和18.6 °附近，推測(cè)出現(xiàn)這種現(xiàn)象原因是PC均勻分布在CSMF層與層之間，未和CSMF形成化學(xué)鍵，通過(guò)分子之間作用力附著在CSMF表面，從而不會(huì)影響CSMF分子中糖鏈的排列，進(jìn)而不會(huì)對(duì)的結(jié)果產(chǎn)生影響。

圖3 CSMF和PC-CSMF X射線衍射分析Fig.3 XRD patterns of CSMF and PC-CSMF

2.1.4 熱重分析

由圖4a、b可知，CSMF有2 個(gè)質(zhì)量損失階段，第1階段為溫度低于155 ℃時(shí)，此階段質(zhì)量損失約12%，其原因是CSMF表面的自由水和結(jié)合水的溢出，這一階段的最大失重速率在97 ℃附近；第2階段發(fā)生在175～320 ℃，此階段質(zhì)量損失約30%，其原因?yàn)镃S糖苷鍵的斷裂。對(duì)比分析圖4c、d，PC-CSMF的質(zhì)量損失也分為2 個(gè)階段，第1階段也發(fā)生在溫度低于158 ℃時(shí)，此階段質(zhì)量損失大約10%，最大質(zhì)量損失速率在99 ℃附近，第2階段發(fā)生在175～350 ℃，此階段質(zhì)量損失約27%，最大質(zhì)量損失速率在251 ℃附近，這2 階段的質(zhì)量損失原因和CSMF相同，造成其最大質(zhì)量損失速率有細(xì)微差別的原因可能為CSMF在吸附PC的時(shí)候，兩者發(fā)生了分子間作用力，所以導(dǎo)致PCCSMF的最大質(zhì)量損失速率的溫度略大于CSMF。

圖4 熱重分析圖Fig.4 TG curves of CSMF and PC-CSMF

2.1.5 X射線光電子能譜分析

為考察CSMF對(duì)PC的吸附是否有為物理吸附，以及吸附前后的C、N和O元素的分布情況，對(duì)CSMF和PC-CSMF進(jìn)行X射線光電子光譜分析，其結(jié)果如圖5所示。對(duì)比圖5a、e可知，吸附后的CSMF表面C原子含量從吸附前的53.2%提升到了67.66%；而N原子和O原子含量分別從吸附前的6.46%和40.34%下降到了2.52%和29.32%，并且PC-CSMF表面碳氧比例為67.6∶29.8，較CSMF的表面碳氧比例53.2∶40.3有所提高。這是因?yàn)镻C含有大量的C原子和O原子，其C∶O＝30∶13，當(dāng)PC被負(fù)載到CSMF上時(shí)，會(huì)大量提升CSMF表面的C原子含量，從而使N原子和O原子含量有所降低。對(duì)比圖5b、f，吸附前CSMF的C1s光譜在結(jié)合能為284.88、286.54、287.97 eV和288.41 eV處分為4 個(gè)峰，每個(gè)峰分別歸因于CüC/CüH、CüOH、OüCüO和O＝CüO鍵；吸附后C1s光譜在結(jié)合能為284.81、286.52 eV和288.49 eV處分為3 個(gè)峰，每個(gè)峰分別歸因于CüC/CüH、CüOH和O＝CüO鍵，對(duì)比發(fā)現(xiàn)吸附后的OüCüO鍵信號(hào)消失，而在傅里葉紅外光譜中卻有糖苷鍵（OüCüO）的峰，其原因可能為被吸附后的CüOH鍵信號(hào)所屏蔽，而吸附前后的O＝CüO鍵可能是因?yàn)樵谥苽銫SMF是CS與HAc發(fā)生反應(yīng)導(dǎo)致的。由圖5c、g可知，吸附前CSMF的N1s光譜在398.43 eV處為CüN鍵峰，在400.47 eV處為CüN鍵峰，吸附后PC-CSMF的N1s光譜在398.37 eV處為CüN鍵峰，在400.40 eV處為CüN鍵峰；由圖5d、h可知，吸附前CSMF的O1s光譜在531.86 eV處為OüH鍵峰，在533.56 eV處為O＝CüO鍵峰，吸附后PC-CSMF的O1s光譜在532.17 eV處為OüH鍵峰，在533.48 eV處為O＝CüO鍵的峰。

圖5 CSMF和PC-CSMF的X射線光電子能譜光譜對(duì)比Fig.5 Comparison of XPS spectra of CSMF and PC-CSMF

通過(guò)上述對(duì)比可知，吸附前后只改變了CSMF的表面元素分布和各種化學(xué)鍵的強(qiáng)度及結(jié)合能，并沒(méi)有新化學(xué)鍵的生成。因此可推測(cè)為CSMF是通過(guò)分子間作用力對(duì)PC進(jìn)行吸附，即CSMF對(duì)PC的吸附過(guò)程為物理吸附。

2.2 吸附條件對(duì)CSMF吸附劑吸附性能的影響

由表1可知，當(dāng)增大PC質(zhì)量濃度，CSMF的載藥量也隨之增大，這是因?yàn)楫?dāng)PC質(zhì)量濃度增大時(shí)，增大了PC與CSMF的有效分子碰撞次數(shù)，且更多PC進(jìn)入CSMF瓣層之間，導(dǎo)致PC和CSMF更容易發(fā)生吸附作用，從而造成CSMF吸附載藥量的增大，其最大負(fù)載量為352.88 mg/g，比Jiang Suwei等的負(fù)載量提高了5 倍，較Ji Ying等的負(fù)載量提高了4 倍，充分顯示了CSMF的優(yōu)良負(fù)載性能。

表1 吸附質(zhì)量濃度對(duì)吸附載藥量的影響Table 1 Effect of different PC concentrations on its loading onto CSMF

由圖6可知，當(dāng)PC質(zhì)量濃度較低時(shí)，隨著溫度的升高，CSMF對(duì)PC的吸附載藥量也隨之增大。其原因?yàn)闇囟鹊纳哂欣诜肿舆\(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致PC與CSMF更容易發(fā)生有效碰撞，從而導(dǎo)致載藥量的增大，而此時(shí)PC質(zhì)量濃度偏小，CSMF不足以達(dá)到吸附飽和，所以升高溫度還是有利于吸附反應(yīng)的進(jìn)行。當(dāng)PC質(zhì)量濃度偏大時(shí)，升高溫度，載藥量也隨之增大，然而溫度過(guò)高，此時(shí)溫度有利于解吸反應(yīng)的進(jìn)行，從而導(dǎo)致了載藥量的降低。由此可知溫度變化對(duì)載藥量的影響程度比較小。

圖6 溫度對(duì)吸附載藥量的影響Fig.6 Effect of different temperatures on PC loading onto CSMF

2.3 體外模擬緩釋

緩釋性能是評(píng)價(jià)載藥顆粒性能指標(biāo)的一個(gè)重要的參數(shù)，其保持藥物原有活性在緩沖體系中緩慢的釋放，從而達(dá)到長(zhǎng)期有效的功效。

由圖7可知，純PC原藥在釋放過(guò)程中存在突釋情況，在1 h內(nèi)釋放了50%，在4 h就達(dá)到了最大釋放量87.30%。因此純PC原藥不具備緩釋效果。而4 h后由于純PC在pH 7.4條件不穩(wěn)定容易被降解，所以導(dǎo)致其累計(jì)釋放率有所下降；而PC-CSMF就具備了緩釋效果，在6 h達(dá)到50%的釋放量比原藥延長(zhǎng)了5 h左右，此外也提高了PC在PBS中的穩(wěn)定性，24 h后的累計(jì)釋放率為90.61%，比原藥的最大釋放率（87.30%）大，此外PC-CSMF在釋放的過(guò)程中比較穩(wěn)定不存在突釋的情況，因此，更利于人體的吸收。參考陳文彬等的藥物釋放機(jī)理，PC-CSMF在堿性條件下，CS上的—NH易發(fā)生去質(zhì)子化形成—NH，從而導(dǎo)致CS與TPP之間的交聯(lián)作用變?nèi)?，進(jìn)而使負(fù)載在CSMF上的PC源源不斷從載藥顆粒中釋放出來(lái)，從而使溶液中的PC含量增大，但整個(gè)過(guò)程需要一定的時(shí)間，因此使PC-CSMF具有緩釋效果。

圖7 PC累計(jì)釋放率曲線Fig.7 Cumulated release curves of PC-loaded CSMF

2.4 抗氧化性能分析

DPPH的乙醇溶液呈紫色，當(dāng)其遇到供氫體時(shí)，DPPH自由基被還原為DPPH-H，紫色會(huì)褪去，該測(cè)定方法被廣泛用于評(píng)價(jià)各類植物化學(xué)物質(zhì)的自由基清除能力。

由圖8可知，PC-CSMF的自由基清除率比未負(fù)載的PC低，這是因?yàn)镻C-CSMF中的PC從CSMF上釋放需要一定的時(shí)間，這也印證了其有緩釋功能。在20 min后純PC的自由基清除率基本保持不變，因?yàn)镻C是一類與自由基能夠快速發(fā)生反應(yīng)的多酚類自由基消除劑，此時(shí)證明PC和DPPH已發(fā)生了充分的反應(yīng)，導(dǎo)致PC已被完全反應(yīng)完畢，失去了繼續(xù)抗氧化的作用。而PC-CSMF在120 min內(nèi)具有持續(xù)的抗氧化性，且自由基清除率在不斷地上升。因此，PC-CSMF不僅延長(zhǎng)了抗氧化作用的時(shí)間，還保護(hù)了抗氧化劑的活性，從而實(shí)現(xiàn)PC的長(zhǎng)期抗氧化作用。

圖8 PC-CSMF對(duì)DPPH自由基清除率的影響Fig.8 DPPH radical scavenging effect of PC and PC-CSMF

3 結(jié) 論

以CS為原料，通過(guò)離子交聯(lián)法制備CSMF，并以PC為模型藥物對(duì)其進(jìn)行負(fù)載，采用掃描電子顯微鏡、傅里葉變換紅外光譜、X射線衍射儀等對(duì)其進(jìn)行了表征，研究不同吸附條件對(duì)CSMF吸附性能的影響，通過(guò)體外緩釋和清除自由基實(shí)驗(yàn)探究其緩釋作用和抗氧化性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明CSMF為三維的微花結(jié)構(gòu)，比表面積為48.9 m/g；PC-CSMF的傅里葉變換紅外光譜在1 448 cm出現(xiàn)了芳香環(huán)的峰，X射線光電子能譜顯示PC-CSMF表面碳氧比例為67.6∶29.8，較CSMF的表面碳氧比例53.2∶40.3有所提高，兩者協(xié)同證明了PC被成功負(fù)載；X射線衍射儀分析和熱重分析發(fā)現(xiàn)PC-CSMF的結(jié)晶性和熱穩(wěn)定性沒(méi)有顯著改變；在27 ℃和PC質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)CSMF對(duì)PC的最大負(fù)載量為352.88 mg/g，較Jiang Suwei和Ji Ying等的負(fù)載量提高了4～5 倍；最后，體外緩釋和抗氧化性實(shí)驗(yàn)證明了PC-CSMF在不僅具有良好的緩釋作用，還提高了PC在腸道中的生物利用率，為CSMF負(fù)載多酚類藥物提供了依據(jù)。