易永麗，雷 婭，王 坤，付先蕓，蔡三金

? 藥理與臨床?

大黃-桃仁藥對調(diào)控子宮腺肌病在位內(nèi)膜線粒體穩(wěn)態(tài)的機(jī)制研究

易永麗，雷 婭#，王 坤，付先蕓*，蔡三金*

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥藥理腫瘤科研三級實(shí)驗(yàn)室，湖北 宜昌 443000

探索大黃-桃仁藥對對子宮腺肌病（adenomyosisi，AM）在位內(nèi)膜線粒體穩(wěn)態(tài)的調(diào)控機(jī)制。同種異體垂體移植法構(gòu)建AM小鼠模型，光鏡及透射電鏡（TEM）觀察大黃-桃仁藥對治療前后子宮組織病理及超微結(jié)構(gòu)改變；免疫熒光檢測線粒體自噬通路PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）/帕金森蛋白（Parkinson protein，Parkin）蛋白表達(dá)。培養(yǎng)人永生化子宮內(nèi)膜異位癥在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞hEM15A，觀察大黃-桃仁藥對處理前后細(xì)胞增殖能力、活性氧（reactive oxygen species，ROS）、抗氧化酶系、線粒體膜電位、線粒體自噬小體、線粒體自噬蛋白的變化。病理切片顯示，經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，中、重度的浸潤比例較模型組減少。TEM觀察發(fā)現(xiàn)模型組子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞線粒體腫脹、線粒體脊消失，部分形成線粒體自噬體；經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞線粒體數(shù)量增加，無明顯腫脹、線粒體脊清晰可見。與對照組比較，造模后子宮內(nèi)膜層PINK1、Parkin表達(dá)顯著上調(diào)（＜0.001）；經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，PINK1、Parkin表達(dá)顯著下降（＜0.05、0.001）。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，hEM15A細(xì)胞線粒體膜電位下降，ROS呈較高水平；經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，hEM15A細(xì)胞的增殖及侵襲能力下降（＜0.05、0.001），線粒體膜電位升高，ROS水平下降（＜0.001），抗氧化酶系統(tǒng)Cu-Zn超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、Mn-SOD和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性上調(diào)（＜0.01、0.001），氧化損傷指標(biāo)丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平下調(diào)（＜0.01）。hEM15A細(xì)胞線粒體與溶酶體之間存在較強(qiáng)的共定位關(guān)系，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，線粒體與溶酶體共定位的數(shù)量顯著減少（＜0.05），PINK1、Parkin及其下游視神經(jīng)蛋白（Optineurin，OPTIN）、核點(diǎn)蛋白52（nuclear dot protein 52，NDP52）經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后顯著下調(diào)（＜0.01、0.001）。大黃-桃仁藥對可通過改善線粒體抗氧化酶系、調(diào)控線粒體自噬水平、恢復(fù)線粒體膜電位等多途徑維護(hù)AM在位內(nèi)膜細(xì)胞乏氧線粒體穩(wěn)態(tài)，從而減輕氧化應(yīng)激損傷。

大黃-桃仁藥對；子宮腺肌病；在位內(nèi)膜線粒體穩(wěn)態(tài)；線粒體自噬；氧化應(yīng)激

子宮腺肌?。╝denomyosisi，AM）發(fā)病率高[1]，90%的患者伴有痛經(jīng)、月經(jīng)過多、性交困難、不孕等臨床癥狀[2]，對其生活和工作造成極大的困擾[3]。除手術(shù)外，目前臨床采用非甾體抗炎藥和激素控制AM的疼痛癥狀和異常子宮出血[4]。但現(xiàn)有保守治療方法伴隨著排卵抑制、肝腎功能受損、療效差、復(fù)發(fā)率高等問題，嚴(yán)重影響患者身心健康[3]。中醫(yī)藥因具有顯著改善AM臨床癥狀和病理浸潤程度，且不干擾正常內(nèi)分泌的獨(dú)特優(yōu)勢日益引起廣泛的關(guān)注[5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)，AM的發(fā)生是在位內(nèi)膜缺氧損傷的結(jié)果[6]，線粒體是細(xì)胞內(nèi)最高級的反應(yīng)性傳感系統(tǒng)，對缺氧損傷極為敏感。線粒體損傷誘發(fā)的能量代謝異常是內(nèi)膜異位發(fā)生的重要前提和潛在治療靶點(diǎn)[7]。目前研究證實(shí)，化瘀類中藥可以調(diào)控缺氧微環(huán)境下線粒體呼吸鏈酶系及抗氧化酶系，調(diào)控線粒體膜的穩(wěn)定性，從而修復(fù)受損線粒體，抑制細(xì)胞異常增殖能力[8-9]。本研究擬以在位內(nèi)膜線粒體穩(wěn)態(tài)為靶點(diǎn)，探索化瘀核心藥對大黃-桃仁治療AM的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級8周齡雌性ICR小鼠（體質(zhì)量23.1～26.4 g）及10周齡雄性小鼠（體質(zhì)量25.2～29.7 g），購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號SCXK（京）2016-0006。小鼠每籠4只，置于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房屏障環(huán)境飼養(yǎng)，溫度（24±2）℃，相對濕度為40%～70%，12 h燈光照射，12 h黑暗。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)三峽大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20190801）。

1.2 細(xì)胞

人子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞永生化細(xì)胞hEM15A（編號GDC0601）購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心細(xì)胞庫。

1.3 藥品與試劑

PTEN誘導(dǎo)的推定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，PINK1）兔多抗（批號23274-1-AP）、帕金森病蛋白（Parkinson protein，Parkin）兔多抗（批號14060-1-AP）、視神經(jīng)蛋白（optineurin，OPTIN）兔多抗（批號10837-1-AP）、核點(diǎn)蛋白52（nuclear dot protein 52，NDP52）兔多抗（批號12229-1-AP）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多抗（批號AB-P-R001）購自杭州賢至生物有限公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司；CCK8細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒（批號HY-K0301）購自美國MedChemExpress公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號P0010）、線粒體膜電位JC-1檢測試劑盒（批號C2006）、Mito-Tracker Green線粒體綠色熒光探針（批號040721210826）、Lyso-Tracker Red溶酶體紅色熒光探針（批號012621210827）、ROS檢測試劑盒（批號S0033）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測試試劑盒（批號A005）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測試試劑盒（批號A001-2）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測試試劑盒（批號A003-4）均購自南京建成生物工程研究所；大黃免煎劑（批號19004961，酒炙法炮制，1 g免煎劑相當(dāng)于5 g臨床劑量）、桃仁免煎劑（批號19006412，1 g免煎劑相當(dāng)于20 g臨床劑量）由北京康仁堂制藥有限公司提供；丙泊酚乳狀注射液（國藥準(zhǔn)字H19990282，批號21803281）購自西安立邦制藥有限公司；對照品蘆薈大黃素（批號110795-201710，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%）、大黃酸（批號110757-201607，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.3%）、大黃素（批號110756-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.7%）、大黃酚（批號110796-201621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.2%）、大黃素甲醚（批號110758-201621，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%）均購自國家食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院；苦杏仁苷對照品（批號K-001-171216，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%）購自成都瑞芬斯生物技術(shù)有限公司。

1.4 儀器

MCO175型CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）；Multiskan GO型全波長酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；電泳儀、170-8280型ChemiDocMP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；BOM-1000型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；2391Model型透射電子顯微鏡（TEM，美國IITC公司）；LC-2010A型系列液相色譜儀（日本島津公司）。

2 方法

2.1 大黃-桃仁藥對的高效液相色譜分析

2.1.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對照品適量，加甲醇分別配制成含蘆薈大黃素50 μg/mL、大黃酸50 μg/mL、大黃素50 μg/mL、大黃酚50 μg/mL、大黃素甲醚25 μg/mL的溶液，分別精密量取上述對照品溶液各2 mL混勻。

精密稱取苦杏仁苷對照品適量，加甲醇配制成含苦杏仁苷0.1 mg/mL的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 溶液制備方法及色譜條件按照國家藥品監(jiān)督管理局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)（酒大黃配方顆粒，YBZ-PFKL-2021075；桃仁配方顆粒，YBZ-PFKL-2021120）進(jìn)行。

（1）大黃免煎劑溶液的制備：精密稱取大黃免煎劑0.156 1 g，加入70%甲醇25 mL，加熱回流1 h。取濾液5 mL，揮去溶劑，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲處理2 min，再加三氯甲烷10 mL，加熱回流1 h后，分液漏斗分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷提取3次，每次量取10 mL，合并三氯甲烷液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙猓蛹状贾?0 mL，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。

（2）桃仁免煎劑溶液的制備：精密稱取桃仁免煎劑0.101 4 g，加入70%甲醇50 mL，超聲30 min后，搖勻，濾過，取續(xù)濾液5 mL，置量瓶中，加50%甲醇至10 mL，搖勻，即得。

2.1.3 色譜條件

（1）大黃免煎劑及混合對照品溶液的色譜條件：Dikma C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（85∶15）；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為254 nm。

（2）桃仁免煎劑及苦杏仁苷對照品溶液的色譜條件：依利特C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-水（1∶4）；進(jìn)樣量為10 μL；檢測波長為210 nm。

2.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物模型的建立 采用同種異體垂體移植法建立AM小鼠模型[10]。ICR雌性小鼠ip丙泊酚乳狀注射液麻醉（0.1 mg/g）。局部消毒后下腹正中縱切口2 cm，分離右側(cè)子宮。取ICR雄性小鼠，斷頸處死，取垂體，與少量生理鹽水混勻，形成垂體生理鹽水懸濁液。取50 mL套管穿刺針，吸入垂體生理鹽水懸濁液，穿刺并推入宮腔，滴入慶大霉素溶液0.25 mL（1000 U/g），常規(guī)縫合。術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 雌性ICR小鼠隨機(jī)抽取6只為對照組，其余25只手術(shù)造模。術(shù)后手術(shù)組隨機(jī)抽取11只為模型組，另14只為大黃-桃仁藥對（4.25 g/kg）組。大黃-桃仁藥對組小鼠按1∶1（臨床等效劑量）比例ig大黃和桃仁免煎劑。模型組及對照組ig等體積生理鹽水，1次/d，連續(xù)8周，后引頸處死，剖腹取出右側(cè)子宮組織。

2.2.3 蘇木素-伊紅（HE）染色 各組子宮用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋。65 ℃干燥30 min后，將組織切成5 μm連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色，于顯微鏡下觀察病理浸潤程度。

2.2.4 TEM觀察子宮內(nèi)膜-肌層交界（endometrial myometrial interface，EMI）處子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞的線粒體自噬情況 取1 mm3離體組織或單層培養(yǎng)細(xì)胞以戊二醛及鋨酸雙固定，丙酮梯度脫水，環(huán)氧丙烷浸透，包埋劑包埋、聚合；超薄切片機(jī)切片，甲苯胺藍(lán)定位；醋酸鈾及檸檬酸鉛依次染色。觀察EMI處線粒體、溶酶體超微結(jié)構(gòu)變化，觀察自噬小體數(shù)量。

2.2.5 PINK1和Parkin免疫熒光染色 子宮切片脫蠟漂洗，依次加入山羊血清、PINK1抗體、Parkin抗體及二抗，分別用PBS溶液漂洗3次，每次5 min。切片上加入DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS孵育3次，每次5 min。最后加入抗熒光淬滅劑，對切片進(jìn)行密封。觀察染色結(jié)果。

2.3 體外實(shí)驗(yàn)

2.3.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) hEM15A細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM/F-12培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 收集處于對數(shù)生長期的hEM15A細(xì)胞，以3×104/mL接種于96孔板中，每孔l00 μL，培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將大黃-桃仁藥對免煎顆粒粉碎，稱取適量，溶解于0.9%生理鹽水中，在磁力加熱攪拌器上60 ℃加熱并攪拌1 h，配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的藥液，經(jīng)0.22 μm的針式過濾器濾過，最后用無血清培養(yǎng)基分別將濾液配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、3、5、10、20 mg/mL的溶液，加入藥物處理48 h，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基。加入10 μL CCK-8溶液，并繼續(xù)培養(yǎng)3 h。采用酶標(biāo)儀測定450 nm處的吸光度（）值。

2.3.3 線粒體膜電位檢測 用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集細(xì)胞，1200 r/min離心5 min，棄上清，重懸于0.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中；加入0.5 mL JC-1染色工作液，混勻，37 ℃孵育20 min；4 ℃、1200 r/min離心3 min，棄上清，洗滌2次；加入1 mL JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，4 ℃、1200 r/min離心3 min，棄上清；再加入1 mL JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，4 ℃、1200 r/min離心3 min，棄上清；以500 μL JC-1染色緩沖液重懸后，采用流式細(xì)胞儀檢測。

2.3.4 活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測 用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞，終止消化后收集，1200 r/min離心5 min，棄上清，以PBS溶液重懸；用PBS溶液將細(xì)胞潤洗2次，1200 r/min離心5 min；棄去PBS溶液，加入1 mL稀釋的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min，每3分鐘混勻1次；用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3次，采用流式細(xì)胞儀檢測。

2.3.5 抗氧化酶系及氧化損傷檢測 按GSH-Px及SOD試劑盒說明書加入樣本和試劑，渦旋混勻，37 ℃孵育40 min，加入特定的顯色劑顯色，室溫靜置10 min，用1 cm光徑石英皿，采用分光光度計(jì)測定412 nm處的值，計(jì)算GSH-Px活性；測定550 nm處的值，計(jì)算Mn+SOD及Cu-Zn SOD活性。

按MDA試劑盒說明書加入樣本和試劑，渦旋混勻，95 ℃水浴40 min，冷卻，離心，測定532 nm處的值，計(jì)算MDA含量。

2.3.6 免疫熒光標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的線粒體自噬 分別配制線粒體特異性熒光探針Mito-Tracker Green及溶酶體特異性熒光探針Lyso-Tracker Red工作液，37 ℃孵育后，與細(xì)胞共同孵育40 min。吸出染色工作液，在細(xì)胞培養(yǎng)皿中更換培養(yǎng)基，于激光共聚焦顯微鏡下觀察。其中綠色的熒光點(diǎn)為線粒體，紅色熒光點(diǎn)為溶酶體，溶酶體和線粒體的共定位細(xì)胞中形成黃色熒光即線粒體自噬陽性點(diǎn)。

2.3.7 Western blotting檢測自噬蛋白表達(dá) 加入裂解液提取各組細(xì)胞蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉，漂洗后分別加入NDP52、OPTIN、PINK1、Parkin和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗（1∶10 000），室溫孵育2 h，漂洗后加入化學(xué)發(fā)光劑，采用Image J軟件測定條帶灰度值。

2.3.8 Transwell實(shí)驗(yàn) 胰酶消化后離心細(xì)胞，加入培養(yǎng)液重懸細(xì)胞；在24孔板中加入800 μL預(yù)冷的10%胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)基，并放入Transwell小室，在Transwell小室上室加入100 μL用無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel（1 mg/mL），37 ℃孵育4～5 h使其成膠狀，待Matrigel干成膠狀后在Transwell上室分別接入200 μL各組細(xì)胞懸液，培養(yǎng)48 h；用鑷子取出小室，小室倒扣，棄去小室中培養(yǎng)基，加入1 mL甲醇固定10 min，蘇木素染色15 min，棉簽擦拭，清除小室內(nèi)殘留的細(xì)胞；沿小室邊緣將膜切下，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察并拍照。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，定量指標(biāo)用單因素方差分析，組間比較用LSD、SNK分析和Tamhane’s2檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 大黃-桃仁藥對的HPLC分析

如圖1所示，大黃免煎劑的指紋圖譜在254 nm處檢測出蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚，桃仁免煎劑的指紋圖譜在210 nm處檢測出苦杏仁苷。

3.2 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.1 HE染色觀察浸潤程度 HE染色（圖2）觀察表明，造模后子宮內(nèi)膜間質(zhì)及腺體向肌層浸潤，成功形成AM模型，其成模率可達(dá)90%。經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，中、重度（2、3級）的浸潤比例較模型組減少。

3.2.2 TEM觀察大黃-桃仁藥對治療前后內(nèi)膜細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞的線粒體超微結(jié)構(gòu)變化 如圖3所示，對照組EMI處子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞中線粒體量豐富，大小形態(tài)正常，線粒體脊清晰可見；模型組EMI處子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞線粒體腫脹、線粒體脊消失，部分形成線粒體自噬體；經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞線粒體數(shù)量增加，無明顯腫脹、線粒體脊清晰可見。

3.2.3 免疫熒光染色觀察大黃-桃仁藥對治療前后不同部位（上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞）線粒體自噬通路PINK1、Parkin蛋白表達(dá)的變化 如圖4所示，PINK1、Parkin蛋白在各組大鼠子宮內(nèi)膜肌層交界處的在位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中均有表達(dá)。與對照組比較，造模后子宮內(nèi)膜層PINK1有上調(diào)趨勢，經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，PINK1表達(dá)顯著下降（＜0.001）；Parkin表達(dá)在模型組顯著上調(diào)（＜0.001），經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，其表達(dá)顯著下降（＜0.05）。

1-蘆薈大黃素 2-大黃酸 3-大黃素 4-大黃酚 5-大黃素甲醚 6-苦杏仁苷

A、B-正常子宮橫切面 箭頭指示造模后子宮內(nèi)膜腺體及間質(zhì)逐漸浸潤入內(nèi)肌層（C、D，1級）、外肌層（E、F，2級）、漿膜下（G、H，腺肌瘤，3級），形成異位灶

黑色箭頭標(biāo)示線粒體，藍(lán)色箭頭標(biāo)示溶酶體；黃色箭頭標(biāo)示線粒體自噬體

M為子宮平滑肌層，E為子宮內(nèi)膜層，箭頭為EMI處內(nèi)膜腺體 與對照組比較：###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 ***P＜0.001

3.3 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.3.1 hEM15A細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 如圖5所示，鏡下可見大量子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，呈梭形。對其進(jìn)行免疫熒光染色，波形蛋白染色陽性（紅色），角蛋白染色陰性（綠色），細(xì)胞純化率達(dá)90%以上。

3.3.2 CCK-8實(shí)驗(yàn) 如圖6所示，hEM15A細(xì)胞增殖能力在大黃-桃仁藥對處理48 h后顯著下降，并呈劑量相關(guān)性。根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇1 mg/mL大黃-桃仁藥對給藥48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖5 hEM15A細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

圖6 大黃-桃仁藥對對hEM15A細(xì)胞增殖的影響

3.3.3 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測大黃-桃仁藥對處理前后hEM15A細(xì)胞的侵襲能力 如圖7所示，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，細(xì)胞的侵襲能力顯著下降（＜0.05）。

3.3.4 線粒體膜電位、ROS及抗氧化酶系的變化 如圖8-A所示，hEM15A細(xì)胞有部分呈現(xiàn)JC-1單體形式，表示線粒體膜電位下降；經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，膜電位升高。如圖8-B所示，hEM15A細(xì)胞ROS呈較高水平，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后ROS水平顯著下降（＜0.001）。如圖8-C所示，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，hEM15A細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)（Cu- Zn SOD、Mn SOD、GSH-Px）活性上調(diào)（＜0.01、0.001），氧化損傷指標(biāo)MDA水平下調(diào)（＜0.01）。

與對照組比較：*P＜0.05

3.3.5 免疫熒光雙染觀察大黃-桃仁藥對處理前后hEM15A細(xì)胞線粒體自噬水平變化 如圖9-A、B所示，hEM15A細(xì)胞線粒體與溶酶體之間存在較強(qiáng)的共定位關(guān)系，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后，線粒體與溶酶體共定位的數(shù)量顯著減少（＜0.05）。Western blotting觀察大黃-桃仁藥對處理前后hEM15A細(xì)胞PINK1/Parkin通路及下游蛋白表達(dá)變化（圖9-C），結(jié)果顯示，經(jīng)大黃-桃仁藥對處理后PINK1、Parkin及其下游蛋白OPTIN、NDP52顯著下調(diào)（＜0.01、0.001）。

A-JC-1熒光染色 B-hEM15A細(xì)胞ROS水平 C-抗氧化酶系統(tǒng)Cu-Zn SOD、Mn SOD、GSH-Px活性及氧化損傷指標(biāo)MDA水平 與對照組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

A-免疫熒光雙染觀察大黃-桃仁藥對處理前后hEM15A細(xì)胞線粒體自噬水平（紅色熒光標(biāo)記線粒體，綠色熒光標(biāo)記溶酶體，兩者共定位黃色熒光為線粒體自噬） B-線粒體-溶酶體共定位散點(diǎn)圖 C-線粒體自噬通路相關(guān)蛋白表達(dá) 與對照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

4 討論

AM臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的痛經(jīng)，屬于中醫(yī)學(xué)中“癥瘕”的范疇。中醫(yī)理論認(rèn)為，情志內(nèi)傷、外邪入侵、體質(zhì)因素或手術(shù)損傷導(dǎo)致氣血失和、沖任損傷，瘀血惡血壅于肌肉，內(nèi)結(jié)成塊而致癥。因此，“瘀血致癥”是AM的核心病機(jī)環(huán)節(jié)，活血化瘀為其基本治療大法[11]?；鲱愃幬镌贏M治療中獲得高頻次選用[12]。大黃-桃仁藥對來源于中醫(yī)經(jīng)典活血化瘀方，桃核承氣湯、下瘀血湯、大黃?蟲丸、抵擋丸（湯）、鱉甲煎丸、大黃牡丹湯均含有該藥對。其中，大黃下瘀血、破癥瘕積聚、推陳出新，桃仁活血化瘀、潤腸通便，兩者同用，剛?cè)嵯酀?jì)、攻逐瘀血、直下胞宮[13]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)大黃-桃仁藥對治療的AM小鼠病理浸潤程度減輕，中、重度浸潤的比例下降。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大黃-桃仁藥對可顯著抑制hEM15A細(xì)胞增殖，并呈劑量相關(guān)性。

有研究者指出，在位內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)變化可能對子宮內(nèi)膜細(xì)胞特性起決定作用[14]，其中，在位內(nèi)膜乏氧線粒體損傷導(dǎo)致能量代謝異常是內(nèi)膜異位發(fā)生的重要前提和潛在治療靶點(diǎn)[7]。線粒體能量代謝異常，呼吸鏈在傳遞電子過程中發(fā)生電子丟失，可產(chǎn)生ROS。生理情況下產(chǎn)生的少量ROS，可由抗氧化酶系清除。當(dāng)缺氧等特殊病理狀態(tài)下時(shí)，線粒體抗氧化酶系（如Mn SOD、GSH）的防御功能減弱，ROS可持續(xù)累積，造成線粒體DNA、蛋白質(zhì)和膜脂質(zhì)的氧化損傷，跨膜電位下降，并可進(jìn)一步導(dǎo)致線粒體受損、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）合成障礙，進(jìn)而形成惡性循環(huán)，形成持續(xù)的氧化應(yīng)激狀態(tài)。研究表明，ROS可根據(jù)濃度對細(xì)胞增殖產(chǎn)生相反的影響[15]，高濃度的ROS可直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的死亡，但在慢性缺氧狀態(tài)下，低于腫瘤細(xì)胞死亡閾值的亞臨床劑量的ROS的累積[16]，可通過激活核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等多種信號通路，增強(qiáng)胰腺癌[17]、乳腺癌[18]、淋巴瘤[19]、涎腺腺樣囊性癌[20]等多種腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。AM是一類有腫瘤樣惡性增殖能力的疾病，有研究顯示氧化應(yīng)激與內(nèi)膜異位的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，ROS的特異性產(chǎn)物可作為患者預(yù)后評估的指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，AM在位子宮內(nèi)膜線粒體腫脹、脊消失，伴隨線粒體膜電位下降及ROS的異常累積。

目前研究表明，化瘀類中藥可以調(diào)控缺氧微環(huán)境下線粒體呼吸鏈酶系及抗氧化酶系，調(diào)控線粒體膜的穩(wěn)定性，從而修復(fù)受損線粒體，抑制細(xì)胞異常增殖能力。川芎嗪可以通過保護(hù)線粒體酶和膜電位，減少ROS產(chǎn)生[21]；八珍湯[22]、大黃酚[23]等可通過調(diào)節(jié)線粒體ROS合成酶還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamideadenine dinucleotide phosphate，NADPH）及ROS清除酶SOD、GSH活性，直接清除OH?、O2?；澤蘭[24]、紫草[25]、丹皮酚[26]等能抑制ROS誘導(dǎo)的氧化炎癥級聯(lián)反應(yīng)，防止線粒體的進(jìn)一步損傷。含有大黃-桃仁核心藥對的中醫(yī)經(jīng)典活血化瘀方大黃蟄蟲丸可通過調(diào)節(jié)缺氧應(yīng)激條件下的線粒體能量代謝[9]抑制細(xì)胞異常侵襲能力[8]。本研究結(jié)果得到相似的結(jié)論，證實(shí)化瘀藥對大黃-桃仁能夠有效改善在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞線粒體膜電位，減少ROS產(chǎn)生，調(diào)控抗氧化酶系，減少氧化損傷。

線粒體自噬是調(diào)控受損線粒體質(zhì)量的重要機(jī)制之一，可隔離并清除功能失調(diào)且具有潛在危險(xiǎn)的線粒體，是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵[27]。線粒體自噬需要識別受損的線粒體成分，并將線粒體與溶酶體融合為線粒體吞噬小體[28]。PINK1是線粒體損傷的主要探測器，健康線粒體PINK1蛋白含量極低[29]，去極化的線粒體抑制PINK1的降解途徑，導(dǎo)致PINK1在線粒體外膜的磷酸化激活及蓄積。激活的PINK1介導(dǎo)Parkin從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到損傷的線粒體外膜。Parkin具有泛素-蛋白連接酶活性[30]，介導(dǎo)線粒體外膜蛋白的泛素化。自噬受體蛋白NDP52、OPTIN等可識別泛素化的線粒體，同時(shí)錨定自噬囊泡膜，形成線粒體-自噬溶酶體，最終移除損傷線粒體[31]。目前對線粒體自噬在子宮內(nèi)膜異位癥中的調(diào)控存在爭議。有研究者認(rèn)為，下調(diào)線粒體自噬可顯著降低子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的遷移和存活能力[32]；但另有研究者持相反的看法，認(rèn)為激活線粒體自噬通路有助于病變體積、面積和直徑的減少[33]。本研究對AM小鼠子宮在位內(nèi)膜細(xì)胞的電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，無論間質(zhì)細(xì)胞還是腺上皮細(xì)胞，其線粒體數(shù)量均顯著減少，線粒體發(fā)生了腫脹、線粒體脊消失，病變線粒體周圍溶酶體顯著增多，并可見到線粒體與溶酶體融合的增加。與此同時(shí)，AM模型小鼠PINK1和Parkin蛋白顯著上調(diào)。因此推測在AM中存在線粒體受損、其形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生異常，而伴隨的線粒體自噬的過度激活，可使損傷線粒體被清除而不是被修復(fù)，致線粒體數(shù)量的減少，最終發(fā)生細(xì)胞功能的異常和缺陷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)大黃-桃仁藥對治療后，線粒體與溶酶體融合的線粒體吞噬小體減少，線粒體的數(shù)量增加，形態(tài)趨于正常，線粒體雙層膜結(jié)構(gòu)及線粒體脊清晰可見。在體外研究中，發(fā)現(xiàn)大黃-桃仁藥對可減少線粒體自噬的數(shù)量，并顯著下調(diào)PINK1、Parkin、NDP52、OPTIN蛋白表達(dá)，證實(shí)大黃-桃仁藥對可介導(dǎo)PINK1/Parkin信號通路調(diào)控線粒體自噬水平。

綜上，化瘀藥對大黃-桃仁可通過改善線粒體抗氧化酶系、調(diào)控線粒體自噬水平、恢復(fù)線粒體膜電位等多途徑減輕AM在位內(nèi)膜細(xì)胞乏氧線粒體損傷，下調(diào)氧化應(yīng)激水平，最終抑制細(xì)胞的異常增殖。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism ofetSemen drug pair on regulating endometrial mitochondrial homeostasis in adenomyosis

YI Yong-li, LEI Ya, WANG Kun, FU Xian-yun, CAI San-jin

Medical college of China Three Gorges University, Third-Grade Pharmacological Laboratory on Chinese Medicine Approved by State Administration of Traditional Chinese Medicine, Yichang 443000, China

To explore the regulation mechanism of Dahuang (et)-Taoren () drug pair (RP) on endometrial mitochondrial homeostasis in adenomyosis (AM).AM mice model was established by allogeneic pituitary transplantation. Histopathological and ultrastructural changes of uterus before and after treatment with RP were observed by light microscope and transmission electron microscope (TEM). Immunofluorescence was used to detect PTEN-induced putative kinase 1 (PINK1)/Parkinson protein (Parkin) expressions. Human immortalized endometriosis eutopic endometrial stromal cells hEM15A were cultured, and the effects of RP on cell proliferation, reactive oxygen species (ROS), antioxidant enzymes, mitochondrial membrane potential, mitophagosomes and mitophagy proteins changes.Pathological sections showed that compared with model group, proportion of moderate and severe infiltration was reduced after treatment with RP. TEM observation showed that mitochondria of endometrial epithelial cells and interstitial cells in model group were swollen, mitochondrial ridges were disappeared and some mitophagosomes were formed; The number of mitochondria in endometrial epithelial cells and interstitial cells were increased after treatment with RP, there was no obvious swelling, and mitochondrial ridges were clearly visible. Compared with control group, PINK1 and Parkin expressions in endometrial layer after modeling were significantly up-regulated (< 0.001); After treatment with RP, PINK1 and Parkin expressions were significantly decreased (< 0.05, 0.001). The results ofexperiments showed that mitochondrial membrane potential of hEM15A cells was decreased, and ROS level was higher; After treatment with RP, proliferation and invasion abilities of hEM15A cells were decreased (< 0.05, 0.001), mitochondrial membrane potential was increased, ROS level was decreased (< 0.001), antioxidant enzyme systems Cu-Zn superoxide dismutase (SOD), Mn-SOD and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities were up-regulated (< 0.01, 0.001), and oxidative damage index malondialdehyde (MDA) level was down-regulated (< 0.01). There was a strong co-localization relationship between mitochondria and lysosomes in hEM15A cells. After treatment with RP, number of mitochondria and lysosomes co-localized was significantly reduced (< 0.05), PINK1, Parkin and their downstream proteins Optineurin (OPTIN), nuclear dot protein 52 (NDP52) were significantly down-regulated after treatment with RP (< 0.01, 0.001).RP can maintain hypoxic mitochondrial homeostasis of AM resident endomembrane cells by improving mitochondrial antioxidant enzymes, regulating level of mitophagy and restoring mitochondrial membrane potential, thereby reducing oxidative stress injury.

et-drug pair; adenomyosis; endometrial mitochondrial homeostasis; mitophagy; oxidative stress

R285.5

A

0253 - 2670(2022)15 - 4709 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.15.014

2022-03-09

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81973897）

易永麗，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚硌芯?。E-mail: 728113811@qq.com

通信作者：付先蕓，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)樽訉m內(nèi)膜異位性疾病及慢性盆腔疼痛。E-mail: dinnar1@163.com

蔡三金，副教授，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥治療婦科疾病。E-mail: 106680558@qq.com

#共同第一作者：雷 婭，碩士研究生，研究方向?yàn)槁耘枨惶弁?。E-mail: 283392724@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]