劉崢，謝云

（天津醫(yī)科大學朱憲彝紀念醫(yī)院老年病科，天津市內(nèi)分泌研究所，國家衛(wèi)生健康委員會激素與發(fā)育重點實驗室，天津市代謝性疾病重點實驗室，天津 300134）

隨著生活水平的提高和壽命的延長，2 型糖尿病（T2DM）和骨質(zhì)疏松癥的患病率都在增加[1]。許多研究表明，糖尿病與各種骨骼疾病有關(guān)，包括骨質(zhì)疏松、骨微結(jié)構(gòu)破壞和骨折率增加等[2-3]。糖尿病性骨質(zhì)疏松發(fā)生的主要原因是營養(yǎng)條件的變化和代謝微環(huán)境改變等[4-5]。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白內(nèi)皮細胞前體來源調(diào)節(jié)因子（BMPER）最初在對果蠅胚胎內(nèi)皮前體差異表達蛋白的篩選中被發(fā)現(xiàn)，不同情況下對骨形態(tài)發(fā)生蛋白的作用具有刺激和拮抗作用[6]。BMPER 基因敲除小鼠的骨骼和軟骨發(fā)育異常[7]。BMPER 基因突變在透明椎體發(fā)育不良和坐骨棘骨發(fā)育不良中也有報道，這兩種疾病均導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良表型[8-9]。這一發(fā)現(xiàn)提示BMPER 可能參與成骨過程。目前關(guān)于BMPER在糖尿病條件下對成骨分化的作用及機制仍不清楚，因此，本研究旨在探究在糖尿病條件下BMPER在成骨分化中的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 小鼠前成骨細胞MC3T3-E1 細胞購自武漢普諾賽生命科技公司；α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素和胰蛋白酶均購自美國Gibco公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（貨號：LK2001）、β-actin 抗體（貨號：KM9001）購自天津三箭生物技術(shù)公司；Active β-Catenin 抗體（貨號:19807）購自美國Cell Signaling Technology 公司；Runx2 抗體（20700-1-AP）、Wnt3a 抗體（貨號：26744-1-AP）、Wnt1 抗體（貨號：27935-1-AP）購自美國Proteintech 公司；BMPER 抗體（ab73900）購于英國Abcam公司；Ⅰ型膠原α1（Col1α1）抗體（BS70155）購自美國Bioworld 公司；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶染色試劑盒（貨號：C3206）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0012S）購自上海碧云天生物技術(shù)公司；β-甘油磷酸酯和抗壞血酸購自美國Sigma 公司。低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司；恒溫金屬浴購自杭州博日科技公司；凝膠成像儀購自上海天能公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國賽默飛公司。

1.2 細胞培養(yǎng)及傳代 MC3T3-E1 細胞在加入10%胎牛血清、1 %青-鏈霉素的α-MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細胞置于37℃，5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3 d更換1 次培養(yǎng)基。待細胞融合至90%左右，用0.25%胰蛋白酶消化細胞并傳代。在成骨分化實驗中，MC3T3-E1 細胞融合至80%時用成骨培養(yǎng)基（α-MEM 培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清，5 mmol/L β -甘油磷酸酯和50 μg/mL 抗壞血酸）處理14 d，每3 d更換1 次培養(yǎng)基。

1.3 堿性磷酸酶（ALP）染色 將MC3T3-E1 細胞在成骨培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d，磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗滌后，用4%多聚甲醛固定20 min，PBS 洗滌3 次，依照說明書使用BCIP/NBT 染色工作液室溫避光染色30 min，去除BCIP/NBT 染色工作液，用蒸餾水洗滌2 次，終止顯色反應(yīng)，觀察并記錄。

1.4 細胞的分組及轉(zhuǎn)染 將MC3T3-E1 細胞均勻接種于6 孔板中，每孔約1×105個細胞。當細胞增殖至70%～80%左右時吸掉舊培養(yǎng)基，用無菌PBS 洗滌2 次后，對細胞進行成骨誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)染。

1.4.1 成骨誘導(dǎo) 采用成骨培養(yǎng)基（OM）培養(yǎng)MC3T3-E1 細胞，誘導(dǎo)成骨分化。在成骨培養(yǎng)基中加入25 mmol/L 葡萄糖（HG）和0.25 mmol/L 棕櫚酸（PA）模擬T2DM 環(huán)境，將MC3T3-E1 細胞分為對照（control）組、成骨誘導(dǎo)（OM）組和成骨誘導(dǎo)+高糖高脂（OM+HG/PA）組。

1.4.2 BMPER 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 BMPER 過表達質(zhì)粒及空載體對照質(zhì)粒均委托美國GeneCopoeia 公司進行構(gòu)建。將空載體對照質(zhì)粒及BMPER 過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MC3T3-E1 細胞中，將MC3T3-E1 細胞分為p-NC 和p-BMPER 組。采用Lipofectamine 3000試劑盒，根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染。

1.4.3 siRNA 轉(zhuǎn)染 應(yīng)用非特異性siRNA 及合成的靶向沉默BMPER 小干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染MC3T3-E1 細胞，將細胞分為si-NC 組及si-BMPER組。以riboFECTTM 作為轉(zhuǎn)染試劑，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明進行siRNA 轉(zhuǎn)染。

1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測各組蛋白表達水平 收集MC3T3-E1 細胞，用預(yù)冷的PBS 沖洗3 次，加入RIPA裂解液對各組細胞充分裂解，提取總蛋白，冰上孵育30 min，期間每10 min 混勻1 次。4℃，12 000 r/min，離心15 min，并通過BCA 蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。蛋白經(jīng)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離后，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，在室溫下用5%脫脂牛奶封閉1 h。一抗β-actin（1:10 000）、active β-catenin（1:5 000）、Runx2（1:1 000）、Wnt3a（1:1 000）、Wnt1（1:1 000）、BMPER（1:1 000）、Col1α1（1:1 000）4℃孵育12～16 h。TBST 洗滌3 次，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌3 遍后使用ECL 試劑盒進行化學發(fā)光顯影，使用蛋白凝膠成像儀拍照。應(yīng)用Image J 軟件進行分析。以β-actin 為內(nèi)參，目的條帶灰度值與β-actin 灰度值之比表示蛋白表達水平。

1.6 統(tǒng)計學處理 利用GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析，正態(tài)分布的計量資料采用±s 表示結(jié)果。兩組獨立樣本比較采用t 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖高脂環(huán)境抑制MC3T3-E1 細胞成骨分化 成骨誘導(dǎo)14 d 后，OM 組Runx2 蛋白水平較對照（control）組顯著升高（t=11.628，P＜0.05，圖1A），而HG/PA 處理后顯著降低（t=7.572，P＜0.05，圖1A）。此外，OM 組Col1α1 蛋白水平較對照組顯著升高（t=12.202，P＜0.05，圖1B）。與OM 組相比，HG/PA處理后Col1α1 蛋白水平顯著降低（t=8.568，P＜0.05，圖1B）。與OM 組相比，OM+HG/PA 組ALP 染色減輕（圖1C）。

圖1 高糖高脂環(huán)境抑制MC3T3-E1 細胞成骨分化Fig1 HG/PA inhibited the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

2.2 BMPER 在高糖高脂環(huán)境中表達降低 成骨培養(yǎng)基誘導(dǎo)MC3T3-E1 細胞成骨分化6 d 后，OM 組BMPER 蛋白表達水平與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）。OM 成骨分化14 d 后，與對照組相比，OM 組BMPER 蛋白表達水平顯著升高（t=8.535，P＜0.05），見圖2A。與OM 組相比，OM +HG/PA 組BMPER 蛋白表達水平顯著降低（t=10.742，P＜0.05），見圖2B。

圖2 BMPER 在高糖高脂環(huán)境中表達降低Fig 2 The expression of BMPER decreased in HG/PA conditions

2.3 BMPER 過表達促進成骨分化 Western 印跡顯示p-BMPER 組BMPER 蛋白水平較p-NC 組明顯升高（t=7.181，P＜0.05），見圖3A。在高糖高脂環(huán)境中，成骨分化后，與p-NC 組相比，p-BMPER 組Runx2和Col1α1 表達水平升高（t=9.816、8.331，P＜0.05，圖3B）。與p-NC 組相比，p-BMPER 組堿性磷酸酶（ALP）染色加深（圖3C）。

圖3 BMPER 過表達促進成骨分化Fig 3 Osteogenic differentiation facilitated by the overexpression of BMPER

2.4 BMPER 過表達上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路 Western 印跡結(jié)果顯示，BMPER 在MC3T3-E1細胞中過表達（t=13.023，P＜0.05），見圖4A。與p-NC組相比，p-BMPER 組MC3T3-E1 細胞中Wnt1、Wnt3a、activeβ-catenin 顯著上調(diào)（t=8.413、14.343、9.156，均P＜0.05），見圖4B。

圖4 BMPER 過表達上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路Fig 4 Wnt/β-catenin signaling pathway promoted by the overexpression of BMPER

2.5 BMPER 下調(diào)抑制Wnt/β-catenin 信號通路 Western 印跡結(jié)果顯示，與si-NC 組相比，si-BMPER 組MC3T3-E1 細胞中BMPER 顯著下調(diào)（t=6.911，P＜0.05），見圖5A。與si-NC 組相比，si-BMPER 組MC3T3-E1 細胞中Wnt1、Wnt3a、active β-catenin 的表達水平顯著降低（t=10.807、8.678、10.167，均P＜0.05），見圖5B。

圖5 下調(diào)BMPER 抑制Wnt/β-catenin 信號通路Fig 5 Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by the downregulation of BMPER

3 討論

本研究探討了BMPER 在MC3T3-E1 細胞成骨分化中的作用。結(jié)果顯示，與未成骨誘導(dǎo)組相比，OM-MC3T3-E1 組細胞中BMPER 表達增加。BMPER 在高糖高脂環(huán)境中表達降低。在高糖高脂環(huán)境中過表達BMPER 可促進成骨分化及上調(diào)Wnt/βcatenin 信號通路，下調(diào)BMPER 抑制Wnt/β-catenin信號通路。這些數(shù)據(jù)表明，BMPER 在高糖高脂環(huán)境中MC3T3-E1 細胞成骨分化中具有促進作用。

骨質(zhì)疏松癥是一種常見的全身性骨骼疾病，會導(dǎo)致骨骼脆弱并增加骨折風險[10]。T2DM 是一種慢性代謝性疾病，以糖代謝受損和胰島素抵抗導(dǎo)致血糖水平升高為特征，隨著時間的推移轉(zhuǎn)化為胰島素缺乏[11]。T2DM 與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)[12]。研究表明，糖尿病誘發(fā)的骨質(zhì)疏松癥是由慢性高血糖、晚期糖基化終末產(chǎn)物和氧化應(yīng)激引起的[13-14]。在體外，高糖通過抑制成骨細胞增殖和分化顯著抑制骨形成[15]。Runx2 和Col1α1 是參與調(diào)控成骨細胞分化的關(guān)鍵因子。在本實驗中，與對照組相比，高糖高脂刺激下的MC3T3-E1 細胞成骨生物標志物Runx2 和Col1α1 的表達降低。此外，有研究發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)成骨細胞凋亡并抑制前成骨細胞的成骨分化[16]。

與健康個體相比，自發(fā)發(fā)展為高胰島素血癥和胰島素抵抗的小鼠的BMPER 血清水平較低，代謝綜合征（MS）患者的BMPER 血漿水平降低了約50%[17]，提示BMPER 參與了調(diào)控T2DM 發(fā)生的關(guān)鍵分子機制。促進骨形成是治療骨折、骨折延遲愈合和其他相關(guān)疾病的關(guān)鍵[18]。研究發(fā)現(xiàn)，BMPER 在成骨分化過程中發(fā)揮積極作用[19]。BMPER 通過上調(diào)成骨細胞標志物如ALP 和Runx2 促進人冠狀動脈平滑肌細胞的成骨分化[20]。本實驗發(fā)現(xiàn)成骨分化后BMPER 表達增加，而高糖高脂環(huán)境中的MC3T3-E1 細胞BMPER 表達減少。在高糖高脂環(huán)境中BMPER 過表達促進MC3T3-E1 細胞成骨生物標志物Runx2 和Col1α1 的表達，表明BMPER 在T2DM 患者骨質(zhì)疏松發(fā)展中具有重要作用。

Wnt/β-catenin 信號通路是維持骨穩(wěn)態(tài)的重要通路。該信號通路的激活促進骨形成，而該通路的失活導(dǎo)致骨質(zhì)減少[21-22]。成骨過程中經(jīng)典Wnt 信號通路的激活和失活異常分別導(dǎo)致硬化癥和骨質(zhì)疏松癥[23]?；罨摩?Catenin 與細胞核內(nèi)TCF/LEF-1或其他轉(zhuǎn)錄輔激活因子相互作用，誘導(dǎo)成骨相關(guān)蛋白的表達，調(diào)控成骨[24-25]。Wnt3a 可與低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6（LRP5/6）協(xié)同受體結(jié)合，通過誘導(dǎo)GSK-3β 磷酸化，穩(wěn)定細胞質(zhì)β-catenin。β-catenin在細胞質(zhì)中積累，并轉(zhuǎn)運到細胞核中對靶基因進行調(diào)控[25]。在筆者的研究中，BMPER 過表達上調(diào)Runx2和Col1α1，證明BMPER 過表達促進成骨分化。此外，BMPER 過表達上調(diào)Wnt/β-catenin 信號通路，而BMPER 下調(diào)抑制Wnt/β-catenin 信號通路。這些數(shù)據(jù)表明，BMPER 通過Wnt/β-catenin 信號通路促進MC3T3-E1 細胞成骨分化。

本研究的所有數(shù)據(jù)均來自于使用MC3T3-E1細胞株建立的T2DM 模型，因此還需要使用其他成骨細胞株進行進一步驗證。此外，目前的研究還沒有從T2DM 動物模型或T2DM 患者中獲得對應(yīng)結(jié)果，這些數(shù)據(jù)還需要進一步收集，以證實體外結(jié)果。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)BMPER 在成骨分化后表達增加，而在高糖高脂環(huán)境中的MC3T3-E1 細胞中表達減少。BMPER 通過Wnt/β-catenin 信號通路減輕高糖高脂對MC3T3-E1 細胞成骨分化的抑制。本研究揭示了BMPER 在MC3T3-E1 細胞成骨分化中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。BMPER 可能成為T2DM 患者骨代謝疾病臨床治療的潛在靶點。