雷林宸， 譚志琴， 楊春秀， 劉玲燕， 吳鵬

(1.衡陽市婦幼保健院重癥醫(yī)學(xué)科，湖南省衡陽市 421001；2.南部戰(zhàn)區(qū)空軍醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣東省廣州市 510060)

宮頸癌為全世界最常見的女性惡性腫瘤之一，嚴(yán)重危害婦女的身心健康。盡管手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療及靶向治療等已取得進(jìn)步，但是對于復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性宮頸癌的療效欠佳[1]。因此，尋找宮頸癌特異性治療靶點(diǎn)是宮頸癌研究亟待解決的問題，是延長宮頸癌患者生存時間和改善其生活質(zhì)量的關(guān)鍵。

TET蛋白是生物體內(nèi)存在的一種雙加氧酶，也是DNA去甲基化過程中的一種重要酶。TET蛋白家族包括3個成員TET1、TET2和TET3，TET對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控具有激活與抑制雙重功能，TET家族成員發(fā)生的結(jié)構(gòu)異常或基因突變常與人類造血系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生關(guān)系緊密[2]。過表達(dá)TET可促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。但目前TET蛋白在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不明確。microRNA(miRNA)為一類內(nèi)源性的非編碼小分子RNA，其通過與mRNA 3′-UTR區(qū)域的配對，可實(shí)現(xiàn)對基因轉(zhuǎn)錄水平的負(fù)性調(diào)控。miR-26a已被發(fā)現(xiàn)與宮頸癌的進(jìn)展過程密切相關(guān)[4],在胃癌發(fā)生過程中miR-26a能直接靶向調(diào)控TET的表達(dá)[5]。本研究探討TET蛋白家族3個成員TET1、TET2和TET3對宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲的影響，并探究其調(diào)控宮頸癌細(xì)胞增殖與侵襲的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人宮頸癌HeLa細(xì)胞(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院生化細(xì)胞所)，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000、RNA提取試劑TRIzol、細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、細(xì)胞培養(yǎng)胎牛血清以及抗生素、miR-26a模擬物及對照(scramble)引物和其內(nèi)參U6、TET1、TET2、TET3的干擾小RNA(small interfering RNA，siRNA)序列及其對照(control)無關(guān)序列(Invitrogen，美國)，RNA抽提試劑盒(Applied Biosystems，美國)，TaqMan反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qSYBR-Green-containing PCR試劑盒、雙熒光素酶活性檢測試劑盒(Qiagen,美國)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(16×25格)，Transwell小室和基質(zhì)膠(BD，美國)，紫外可見分光光度計(jì)(Thermo，Nanodrop 2000，美國)，奧林巴斯正置顯微鏡OLYMPUS BX51(Olympus公司，UIS2光學(xué)成像系統(tǒng)，日本)。突變型TET1、TET2、TET3的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)的熒光素酶報(bào)告載體(TET1-mut、TET2-mut和TET3-mut)、野生型TET1、TET2、TET3的3′-UTR的熒光素酶報(bào)告載體(TET1-wt、TET2-wt和TET3-wt)由GeneCopoeia公司構(gòu)建。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

人宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS、100 U/mL青霉素、0.1 g/L鏈霉素(雙抗)的DMEM培養(yǎng)基中，細(xì)胞置于37 ℃、含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為si-TET1組、si-TET2組、si-TET3組、si-control組。si-TET1、si-TET2、si-TET3分別轉(zhuǎn)染TET1、TET2、TET3的干擾小RNA序列，si-control組轉(zhuǎn)染其對照無關(guān)序列。si-TET1、si-TET2、si-TET3序列分別為5′-GCACGCATGAATTTGGATA-3′、5′-CTGCTTCTGTTCTCAATAA-3′、5′-CCACCTGCGATTGCGTCGAACAAAT-3′，si-control組序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

采用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa細(xì)胞，并將其吹打成單個細(xì)胞，每個六孔板中鋪2 mL細(xì)胞(共8×103個)置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中。按照Lipofectamin 3000說明書進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染si-control、si-TET1、si-TET2、si-TET3以及scramble、miR-26a，轉(zhuǎn)染8 h后，更換為常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基，48 h后可收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 RNA提取及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

每六孔板內(nèi)加100 μL TRIzol裂解液，室溫靜置5 min，加入140 mL氯仿并震蕩20 s后室溫放置8 min，以轉(zhuǎn)速15 000 r/min，4 ℃離心20 min，轉(zhuǎn)移上層液體至另一干凈EP管內(nèi)，按1體積的異丙醇、2體積的TRIzol加入上層液體中，將其混勻后室溫靜置18 min，隨后離心移除上清液體。加入500 μL 75%乙醇沖洗離心管底部的沉淀物，以轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃離心15 min，隨后移除上清液并將底部沉淀物溶于30 μL無酶水。于紫外可見分光光度計(jì)上檢測A260/A280比值，檢測合格后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，提取細(xì)胞中RNA后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并進(jìn)行后續(xù)的操作。miR-26a的引物序列為F:5′-ATGGCTTCAAGTAATCC-AGGA-3′；R:5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′，內(nèi)參U6的引物序列為F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；R：5′-AACGCTTCACGAATTTGC-GT-3′。miRNA的相對表達(dá)量采用公式2-ΔΔCT計(jì)算。

1.5 細(xì)胞增殖曲線檢測細(xì)胞增殖能力

將宮頸癌HeLa細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化后，將細(xì)胞調(diào)至5×103個/mL，隨后將其接種到24孔板中，每孔500 μL，采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板(16×25格)統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)量(每毫升細(xì)胞數(shù)=400×每小格細(xì)胞數(shù)×104×稀釋倍數(shù))，每24 h計(jì)數(shù)一次，連續(xù)4天，繪制細(xì)胞增殖曲線圖。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)

采用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa細(xì)胞，吹打成單個細(xì)胞，以梯度倍數(shù)稀釋，每組設(shè)置3個平行樣。每組細(xì)胞均在六孔板中接種，每孔100個細(xì)胞，輕輕晃動細(xì)胞使其均勻分散。置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。結(jié)晶紫染色，顯微鏡鏡下計(jì)數(shù)克隆形成的具體數(shù)目。

1.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

在Transwell小室內(nèi)鋪加基質(zhì)膠，靜置6 h待其成膜。取上述細(xì)胞稀釋液150 μL接種到小室上腔層，下腔層內(nèi)添加350 μL完全培養(yǎng)基，靜置，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育36 h后結(jié)晶紫染色。將上室中內(nèi)側(cè)細(xì)胞用棉簽除去，PBS緩沖液清洗3次，倒置小室并晾干，于倒置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.8 熒光素酶活性檢測

熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)分為TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt、TET1-mut、TET2-mut、TET3-mut的miR-26a組、scramble組。分別共轉(zhuǎn)染到宮頸癌HeLa細(xì)胞株中，48 h后收集細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書操作，驗(yàn)證TET與miR-26a的結(jié)合關(guān)系。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 敲低TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖能力的影響

細(xì)胞增殖曲線結(jié)果顯示，與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組和si-TET3組的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖能力均顯著降低(P<0.05；圖1)。

圖1 敲低TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖能力的影響a為P<0.05，與si-control組比較。

2.2 敲低TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞克隆形成能力的影響

與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組和si-TET3組細(xì)胞克隆形成數(shù)量均顯著降低(P<0.05；圖2)。即外源性敲低TET的表達(dá)，可顯著降低宮頸癌HeLa細(xì)胞克隆形成能力。

圖2 敲低TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞克隆形成能力的影響A為宮頸癌HeLa細(xì)胞的克隆染色圖片；B為克隆數(shù)量柱狀圖。a為P<0.05，與si-control組比較。

2.3 TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響

與si-control組比較，si-TET1組、si-TET2組、si-TET3組穿過基質(zhì)膠的宮頸癌HeLa細(xì)胞數(shù)量均顯著降低(P<0.05；圖3)。即外源性敲低TET的表達(dá)，可顯著降低宮頸癌HeLa細(xì)胞的侵襲能力。

圖3 敲低TET對宮頸癌HeLa細(xì)胞侵襲能力的影響A為穿過基質(zhì)膠的宮頸癌HeLa細(xì)胞染色圖片(0.5%結(jié)晶紫染色，200×)；B為穿過基質(zhì)膠的宮頸癌HeLa細(xì)胞數(shù)量柱狀圖。a為P<0.05，與si-control組比較。

2.4 miR-26a通過TET抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖與侵襲

TargetScan在線軟件預(yù)測結(jié)果顯示TET1、TET2和TET3均可與miR-26a直接結(jié)合(圖4A)。與共轉(zhuǎn)染TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt的scramble組比較，共轉(zhuǎn)染TET1-wt、TET2-wt、TET3-wt的miR-26a組的細(xì)胞熒光素酶活性均顯著降低(P<0.05，圖4B)。與轉(zhuǎn)染scramble比較，轉(zhuǎn)染miR-26a后，宮頸癌HeLa細(xì)胞中TET1、TET2、TET3 mRNA均顯著降低(圖4C)。

圖4 TET與miR-26a之間的結(jié)合關(guān)系的證實(shí)A為TargetScan軟件預(yù)測TET1、TET2、TET3 mRNA 3′-UTR區(qū)域可與miR-26a結(jié)合；B為各組熒光素酶活性；C為qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染scramble和miR-26a后，宮頸癌HeLa細(xì)胞中TET1、TET2、TET3 mRNA相對表達(dá)量。a為P<0.05，與scramble組比較。

3 討 論

宮頸癌由感染某些高風(fēng)險、致癌類型的人乳頭瘤病毒引起。宮頸癌篩查和接種HPV疫苗均可降低其死亡率、防止宮頸癌前體病變的發(fā)生，但其低診斷率和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移治療仍是亟待解決的重要問題[6-7]。

TET1、TET2、TET3共同構(gòu)成TET蛋白家族，三者均具備將5mC轉(zhuǎn)化成5hmC的能力[8]。研究表明TET家族成員可同時激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，TET家族成員可通過參與DNA的去甲基化過程而激活對基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，但TET1被認(rèn)為可轉(zhuǎn)錄抑制部分基因，該作用可能與羥化酶活性無關(guān)[9]。同時TET家族成員介導(dǎo)的DNA去甲基化過程也與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究證實(shí)，TET蛋白家族的基因突變或結(jié)構(gòu)異常，常與哺乳動物的造血系統(tǒng)惡性腫瘤密切關(guān)聯(lián)[2]，在急性粒細(xì)胞白血病患者中TET1可與組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶基因融合[10]。但目前TET蛋白在宮頸癌中的作用機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)TET可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]。本研究中通過干擾TET1、TET2、TET3表達(dá)均可顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、克隆形成和侵襲，提示TET可能在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。

miR-26a屬miR-26家族，miR-26a基因存在兩個染色體位點(diǎn)，miR-26a-1位于3號染色體CTDSPL基因內(nèi)含子，miR-26a-2位于12號染色體CTDSP2內(nèi)含子，miR-26a與其宿主基因CTDSPL/2共同轉(zhuǎn)錄，其轉(zhuǎn)錄受共同啟動子序列調(diào)控[11]。研究顯示miR-26a具有顯著的抑瘤功能[12-15]。本課題組前期研究證實(shí)miR-26a可通過靶向MCL1抑制宮頸細(xì)胞增殖與侵襲，誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞凋亡[16]；miR-26a在宮頸癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其下調(diào)與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等顯著相關(guān)；此外，miR-26a可通過靶向MTDH抑制乳腺癌的侵襲與轉(zhuǎn)移[17]。

一個miRNAs可調(diào)控多個靶基因，同一個靶基因也可以受多個miRNAs調(diào)控。mRNA之間可通過miRNAs反應(yīng)元件達(dá)到相互調(diào)控的目的，該調(diào)控機(jī)制即競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)機(jī)制具有相同miRNAs反應(yīng)元件的mRNAs、假基因、lncRNA等轉(zhuǎn)錄物通過競爭性結(jié)合同種miRNAs調(diào)控其表達(dá)水平，從而影響細(xì)胞的功能[18]。Kou等[19]發(fā)現(xiàn)，HMGA2能調(diào)控let-7靶基因TGFBR3的表達(dá)，作為ceRNA促進(jìn)肺癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移。

研究顯示，在胃癌的發(fā)生發(fā)展過程中，miR-26a能直接靶向調(diào)控TET1、TET2、TET3的表達(dá)[5]，因此推測TET可能是作為miR-26a的ceRNA而發(fā)揮促進(jìn)宮頸癌生長與轉(zhuǎn)移作用。本研究中，經(jīng)靶點(diǎn)預(yù)測和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)TET1、TET2、TET3均為miR-26a調(diào)控的靶基因，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中通過熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)證實(shí)miR-26a能與TET1、TET2、TET3 mRNA 3′非編碼區(qū)結(jié)合抑制熒光素酶活性。上述結(jié)果證實(shí)TET1、TET2、TET3均為miR-26a靶基因。因TET蛋白對其下游靶基因具有轉(zhuǎn)錄激活或抑制作用[2]。通過siRNA敲低TET1、TET2、TET3的表達(dá)均可抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、克隆形成及侵襲能力，抑制TET尤其是TET2這種不依賴于編碼蛋白發(fā)揮抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)化的功能，提示TET可能作為ceRNA而發(fā)揮功能。研究顯示，miR-26a調(diào)控的靶基因有MTDH[20]、SMAD1[21]和GSK-3β[22]等，TET1、TET2、TET3很可能作為ceRNA調(diào)控這些基因的表達(dá)，或通過調(diào)控宮頸癌組蛋白甲基化修飾或者通過調(diào)控miR-26a其他靶基因參與不同的信號通路，從而實(shí)現(xiàn)調(diào)控宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。