劉思騏， 羅宇榕， 彭余， 徐英萍， 梁云生

南方醫(yī)科大學(xué)皮膚病醫(yī)院，廣東 廣州 510091

銀屑病(psoriasis)是一種全身炎癥性疾病，主要以皮膚鱗屑性紅斑、斑塊和瘙癢為特征[1]。銀屑病與許多共患病相關(guān)聯(lián)，涉及全身多個(gè)系統(tǒng)[2-3]。銀屑病患者血液中的炎性生物標(biāo)記物升高[4]，同時(shí)成像技術(shù)已記錄到皮膚以外的炎癥部位。白念珠菌是一種具有高度致病性的常見病原菌，在免疫抑制狀態(tài)下存在于皮膚和口腔等屏障部位。與銀屑病相似，白念珠菌感染后的皮膚出現(xiàn)以Th17型免疫反應(yīng)為主的炎癥反應(yīng)[5]，而二者不同之處在于是否出現(xiàn)系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)。

脾臟是神經(jīng)免疫通訊的關(guān)鍵部位[6-7]，作為機(jī)體免疫反應(yīng)的中心，在免疫系統(tǒng)中起著重要作用[8]。脾交感神經(jīng)的神經(jīng)信號(hào)傳遞對(duì)正常的免疫功能至關(guān)重要[9]，并與炎癥發(fā)生的重要步驟有關(guān)，如免疫細(xì)胞的募集和動(dòng)員[10]。臨床研究曾發(fā)現(xiàn)銀屑病兒童的脾臟體積增加，與C57BL/6小鼠在咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣皮損模型時(shí)觀察到的脾臟腫大現(xiàn)象一致[11]。通過影像技術(shù)可檢測到成年銀屑病患者脾臟的高代謝活動(dòng)，提示脾臟炎癥的出現(xiàn)，且后續(xù)研究表明患者的脾臟炎癥與主動(dòng)脈炎癥具有相關(guān)性[12]。本研究提出脾臟交感神經(jīng)信號(hào)參與了銀屑病發(fā)生后的脾臟炎性活動(dòng)，從而導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥的產(chǎn)生，希望探索銀屑病中系統(tǒng)性炎癥發(fā)生發(fā)展的神經(jīng)免疫機(jī)制，為銀屑病全身性炎癥的治療與干預(yù)提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24只SPF級(jí)6～8周齡 C57BL/6J 野生型小鼠購于廣東至遠(yuǎn)生物醫(yī)藥科技有限公司。小鼠的處理和實(shí)驗(yàn)程序操作均符合機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的要求, 本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批 (2021d061)。

1.2 主要材料與試劑

咪喹莫特乳膏購自英國Aldara 公司，Ⅳ型膠原酶(貨號(hào)40510ES60)購自美國Thermo Fisher Scientific公司,紅細(xì)胞裂解液(貨號(hào)555899)、流式抗CD45抗體(貨號(hào)CD45RB BV650 16A, 50 μg) 購自美國BD Pharmingen 公司,Trizol(貨號(hào)15596-026) 購自美國Invitrogen公司,流式抗CD11c抗體(貨號(hào)117328)、抗IA/IE抗體(貨號(hào)107630) 購自美國Biolegend公司,抗Ly6C抗體(貨號(hào)48-5932-82)、抗CD11b抗體(貨號(hào)101205)、抗Ly6G抗體(貨號(hào)127609)購自美國eBioscience公司,RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)RR047A)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒(貨號(hào)RR047A)購自日本 TaKaRa 公司。IL-17A、IL-6、IL-1β引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司。GAPDH、IL-17A、IL-6、IL-1β抗體購自創(chuàng)偉生物(廣州)股份有限公司。

1.3 動(dòng)物模型的建立

將24只SPF級(jí)C57BL/6J小鼠以簡單隨機(jī)抽樣法分為銀屑病樣皮炎模型組(模型組)、白念珠菌感染組、陰性對(duì)照組及銀屑病樣皮炎模型伴溶劑處理組(溶劑模型組)、6-羥基多巴胺(6-OHDA)處理組、溶劑對(duì)照組，每組4只。

模型組、白念珠菌感染組、陰性對(duì)照組背部脫毛，范圍1.5 cm×2 cm。白念珠菌感染組脫毛區(qū)用220粗砂紙刮10次以去除角質(zhì)層，用無菌PBS洗滌后，將2×108株白色念珠菌加入50 μL無菌PBS中涂抹于皮膚上，作用3 d后取材。模型組、陰性對(duì)照組分別每日外涂5%咪喹莫特乳膏(IMQ)和凡士林62.5 mg，作用5 d后取材。溶劑模型組、6-OHDA處理組、溶劑對(duì)照組小鼠耳部脫毛。6-OHDA處理組于造模前3 d腹腔注射80 mg/kg 6-OHDA溶液(生理鹽水,含0.1%抗壞血酸)1次，溶劑模型組、溶劑對(duì)照組同時(shí)注射80 mg/kg 含0.1%抗壞血酸生理鹽水1次。溶劑模型組、6-OHDA處理組每日外涂5%咪喹莫特乳膏25 mg，溶劑對(duì)照組每日外涂凡士林25 mg，作用5 d后取材。

1.4 HE 染色

用石蠟包埋脫水后皮膚組織，應(yīng)用切片機(jī)將組織切成6～10 μm厚度的組織薄片黏附于載玻片上，脫蠟后進(jìn)行HE染色。使用相差顯微鏡觀察并拍攝。

1.5 q-PCR檢測皮膚和脾臟的炎癥因子IL-17A、IL-6和IL-1β RNA水平檢測

取小鼠皮損組織或脾臟組織,采用有機(jī)溶劑萃取法提取兩種組織的總RNA,使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒和7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng),以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進(jìn)行RT-qPCR檢測,分別對(duì)皮損組織的GAPDH和IL-17A、脾臟組織的IL-6和IL-1β分析。各引物序列如下：GAPDH:5′-GCACCGTCAAGGC-TGAGAAC-3′(上游)，5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′(下游);IL-17A:5′-CTGGAGGATAACACTGTGAGAGT- 3′(上游)，5′-TGCTGAA-TGGCGACGGAGTTC-3′(下游);IL-6:5′-CTCTGCAAGAGACTTCCATCCAGT- 3′(上游)，5′-CATTTCCACGATTTCCCAGAGA-3′(下游);IL-1β：5′-CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA- 3′(上游)，5′-GGGAACTGGGCAGACTCAAA-3′(下游)。采用2-ΔΔCt循環(huán)閾值法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，以 GAPDH為內(nèi)參。

1.6 Western blot檢測皮膚和脾臟的炎癥因子IL-17A、IL-6和IL-1β蛋白水平

取各組小鼠耳部皮膚或脾臟組織，液氮速凍后，立刻加入RIPA裂解液、蛋白酶抑制劑等并研磨組織至粉末狀，研磨過程于冰上進(jìn)行。用超聲細(xì)胞破碎儀對(duì)組織混懸液進(jìn)行細(xì)胞裂解，而后離心并吸出上清蛋白液，使用BCA法測定裂解液總蛋白濃度，每孔上樣30 μg，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入GAPDH、IL-17A、IL-6和IL-1β抗體，置于4 ℃冰箱過夜。次日洗膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育，洗膜，化學(xué)顯影。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 制備脾臟單細(xì)胞

頸椎脫臼處死小鼠后,取小鼠脾臟，剔除附著筋膜及脂肪,剪碎后用1 mg/mL Ⅳ型膠原酶在 37 ℃條件下消化30 min,終止消化后濾網(wǎng)研磨過濾,離心獲得單細(xì)胞懸液。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用Grahpad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。小鼠脾臟體重比、脾臟及皮損的炎癥因子mRNA和蛋白結(jié)果組間比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病樣皮炎模型組及白念珠菌感染組小鼠皮膚發(fā)生皮膚局部17型免疫反應(yīng)

每日觀察各組小鼠皮損變化，白念珠菌感染組小鼠背部皮膚于接種真菌后第1天出現(xiàn)明顯紅斑及表皮增厚，隨真菌定植持續(xù)加重，以接種后第3天最為明顯；而模型組小鼠背部應(yīng)用IMQ后第1天出現(xiàn)皮膚紅斑，以造模5 d后的情況最為嚴(yán)重，皮膚干燥且出現(xiàn)較多鱗屑，皮膚紅腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯(圖1A)。

HE染色結(jié)果顯示:陰性對(duì)照組小鼠皮膚表皮層薄，真皮層細(xì)胞浸潤少; 與陰性對(duì)照組相比，白念珠菌感染組及模型組小鼠表皮增厚明顯、角化不全、基底角化細(xì)胞增殖過度和炎癥細(xì)胞浸潤(圖1B)。

與陰性對(duì)照組相比，模型組及白念珠菌感染組小鼠皮損中IL-17A的mRNA及蛋白表達(dá)量均顯著增高(均P<0.01)，但模型組與白念珠菌感染組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值分別為0.972、0.578，圖1C、1D)。

2.2 銀屑病樣皮炎模型組小鼠脾臟發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)

觀測小鼠脾臟炎癥改變，結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組比較，模型組小鼠脾臟指數(shù)(脾臟重量/小鼠體重×1 000)明顯升高(P<0.01)，而白念珠菌感染組未見改變(P=0.468，圖1E、1F);模型組小鼠脾臟組織中IL-6和IL-1β的mRNA(均P<0.01)及蛋白表達(dá)量(均P<0.01)均明顯上升，而白念珠菌感染組無明顯變化(P值分別為0.237、0.533,圖1G、1H)。

圖1 銀屑病樣模型小鼠與白念珠菌感染小鼠第5天皮損及脾臟炎癥狀態(tài) 1A：各組小鼠皮膚炎癥情況大體表現(xiàn)；1B：各組小鼠皮損組織病理表現(xiàn) (HE,100×)；1C、1D：各組小鼠皮膚組織內(nèi)IL-17A表達(dá)情況；1E、1F：各組小鼠脾臟炎癥情況大體表現(xiàn)；1G、1H：各組小鼠脾臟組織內(nèi)IL-6及IL-1β表達(dá)情況 與對(duì)照組比，***P<0.01, ****P<0.001, ns P>0.05 Control：陰性對(duì)照組；IMQ：銀屑病樣模型組；C Albicans：白念珠菌感染組

2.3 6-OHDA阻斷脾臟交感神經(jīng)可輕度緩解銀屑病樣皮膚炎癥

2.3.1 6-OHDA處理輕度緩解了銀屑病樣皮炎模型小鼠的皮膚腫脹 使用交感神經(jīng)阻斷劑6-OHDA對(duì)小鼠行1次腹腔注射，并在3 d后使用咪喹莫特進(jìn)行連續(xù)5 d的耳部皮膚炎癥誘導(dǎo)(圖2A)。使用游標(biāo)卡尺測量小鼠每日耳朵厚度并記錄，第5天對(duì)比溶劑模型組小鼠，可見6-OHDA處理組的小鼠耳部皮膚腫脹程度減輕(P=0.008)，但行HE染色未見明顯差異(圖2B～2D)。

2.3.2 6-OHDA處理降低了銀屑病樣皮炎模型小鼠皮膚組織內(nèi)的IL-6蛋白含量 提取小鼠耳部皮膚組織的RNA及蛋白進(jìn)行檢測，q-PCR結(jié)果未見溶劑模型組和6-OHDA處理組小鼠皮膚組織內(nèi)IL-17A(P=0.297)及IL-6(P=0.600)的mRNA表達(dá)量有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；Western blot檢測組織中蛋白水平，可見相較于溶劑模型組小鼠，6-OHDA處理組小鼠皮膚組織內(nèi)IL-6的蛋白含量略有降低(P=0.010，圖2E、2F)。

圖2 6-OHDA部分緩解咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎 2A：6-OHDA處理銀屑病樣小鼠流程示意圖；2B：各組小鼠皮膚炎癥情況大體表現(xiàn)；2C：各組小鼠皮損組織病理表現(xiàn)；2D：各組小鼠耳部皮膚厚度；2E、2F：各組小鼠皮膚組織內(nèi)IL-6及IL-17A表達(dá)情況 與溶劑對(duì)照組比較，**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, ns P>0.05 Vehicle control：溶劑對(duì)照組；VC-IMQ：溶劑模型組；6-OHDA-IMQ：6-OHDA處理組

2.4 6-OHDA阻斷脾臟交感神經(jīng)顯著緩解銀屑病樣小鼠模型的系統(tǒng)性炎癥

相較于溶劑模型組，6-OHDA處理組小鼠的脾臟腫脹程度明顯減輕，其脾臟指數(shù)也顯著降低(P<0.01，圖3A、3B)。同時(shí)，6-OHDA處理組小鼠脾臟的炎癥細(xì)胞浸潤比例也發(fā)生了明顯改變。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與溶劑對(duì)照組小鼠相比，溶劑模型組小鼠的脾臟中，中性粒細(xì)胞(CD11bhighLy6Cint，P=0.001)、單核來源的巨噬細(xì)胞(CD11bhighF4/80int，P=0.005)和組織定居巨噬細(xì)胞(CD11b+F4/80+，P=0.013)水平升高，而6-OHDA的處理挽救了咪喹莫特導(dǎo)致的中性粒細(xì)胞(P=0.003)和單核來源巨噬細(xì)胞(P=0.049)的浸潤，同時(shí)組織定居的巨噬細(xì)胞也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3C、3D)。q-PCR及Western blot檢測脾臟內(nèi)炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示6-OHDA處理降低了銀屑病樣皮炎小鼠脾臟的IL-6和IL-1β的mRNA(P值分別為0.007、0.039)和蛋白(均P<0.01)表達(dá)(圖3E、3F)。提示6-OHDA起到挽救銀屑病樣皮炎小鼠系統(tǒng)性炎癥的作用，交感神經(jīng)在銀屑病系統(tǒng)性炎癥的調(diào)控中扮演重要角色。

圖3 6-OHDA減輕銀屑病樣皮炎小鼠系統(tǒng)性炎癥 3A、3B：各組小鼠脾臟炎癥情況大體表現(xiàn)；3C、3D：各組小鼠脾臟炎癥細(xì)胞類型及占比；3E、3F：各組小鼠脾臟組織內(nèi)IL-1β及IL-6表達(dá)情況 與模型對(duì)照組相比，*P<0.05, **P<0.01,***P<0.001, ****P<0.0001, ns P>0.05.

3 討論

銀屑病是一種系統(tǒng)性免疫性疾病，在各種因素的共同作用下，免疫系統(tǒng)激活引起皮膚局部炎癥細(xì)胞浸潤，角質(zhì)形成細(xì)胞異常增殖分化[13]。以往大部分研究都集中在炎性皮膚疾病的免疫基礎(chǔ)上，較少探究神經(jīng)系統(tǒng)在銀屑病的疾病過程中的作用。近年來，人們發(fā)現(xiàn)精神壓力是銀屑病發(fā)病的因素之一，心理應(yīng)激可能引發(fā)或加劇免疫介導(dǎo)的皮膚病[14-15]。消極情緒如焦慮、抑郁等既導(dǎo)致銀屑病的發(fā)病[16]，也會(huì)因?yàn)樨?fù)面情緒的持續(xù)使臨床癥狀加重; 這些負(fù)面情緒伴隨神經(jīng)激活，調(diào)控免疫細(xì)胞過度活化產(chǎn)生細(xì)胞因子，加重皮損的炎癥反應(yīng)，使疾病遷延不愈甚至惡化。有報(bào)道1例長期偏癱的 59 歲女性出現(xiàn)非偏癱側(cè)的單側(cè)銀屑病關(guān)節(jié)炎和單側(cè)銀屑病，提示神經(jīng)系統(tǒng)參與銀屑病及其共病的發(fā)生發(fā)展[17]。 Hjuler等[12]則發(fā)現(xiàn)成年銀屑病患者脾臟炎性活動(dòng)與銀屑病共病主動(dòng)脈炎癥具有相關(guān)性，提示脾免疫功能在銀屑病局部免疫反應(yīng)和系統(tǒng)免疫反應(yīng)之間起著重要作用。

IMQ誘導(dǎo)的小鼠模型是最廣泛認(rèn)可的銀屑病樣動(dòng)物模型，除了主要的皮膚改變，也可部分模擬銀屑病的系統(tǒng)性炎癥狀態(tài)[11,18]。本研究對(duì)比咪喹莫特誘導(dǎo)的小鼠模型和白念珠菌感染的小鼠模型發(fā)現(xiàn)，兩種疾病模型的病理機(jī)制雖然都以皮膚局部Th17型免疫反應(yīng)為主，但脾臟炎癥狀態(tài)的差距反映出二者在系統(tǒng)性炎癥方面的不同。咪喹莫特誘導(dǎo)的銀屑病樣皮炎模型可見脾臟明顯腫脹，脾臟中炎癥因子IL-6和IL-1β的升高也從分子機(jī)制驗(yàn)證了其系統(tǒng)炎癥的產(chǎn)生。一些研究表明，銀屑病中可見交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活和異常[19-20]，而脾交感神經(jīng)對(duì)脾臟免疫功能的影響也被多方面探究[21-22]。有研究表明，焦慮、抑郁等神經(jīng)病癥早于銀屑病皮損的發(fā)生，與銀屑病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，而焦慮、抑郁等神經(jīng)病癥往往與交感神經(jīng)興奮相關(guān)，因此我們考慮交感神經(jīng)有可能參與了銀屑病病理過程的調(diào)控，可能參與導(dǎo)致銀屑病樣小鼠模型發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)，并對(duì)銀屑病樣皮炎的發(fā)展起調(diào)控作用。使用選擇性的兒茶酚胺能神經(jīng)毒劑6-OHDA阻斷腹腔交感神經(jīng)后[23-24]，銀屑病樣皮炎小鼠耳朵腫脹程度輕度緩解，皮損內(nèi)IL-6蛋白含量降低，而IL-6 mRNA表達(dá)未見差異，考慮6-OHDA通過減輕系統(tǒng)性炎癥從而減少循環(huán)內(nèi)IL-6的蛋白水平而非皮損局部產(chǎn)生的IL-6水平。腹腔交感神經(jīng)阻斷后，銀屑病樣皮炎小鼠的脾臟腫脹得到極大緩解，脾臟中免疫細(xì)胞中性粒細(xì)胞、單核來源巨噬細(xì)胞的比例有所下降，炎癥因子IL-6、IL-1β表達(dá)也明顯下調(diào)。局部炎癥和免疫功能障礙會(huì)促進(jìn)靶向末端器官的組織損傷，而全身性炎癥則會(huì)通過影響多個(gè)器官系統(tǒng)增加發(fā)病率和死亡率[25]，所以銀屑病中系統(tǒng)性炎癥的發(fā)生發(fā)展不容忽視。

綜上所述，腹腔交感神經(jīng)可能通過調(diào)節(jié)脾臟免疫功能參與咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型產(chǎn)生系統(tǒng)性炎癥。交感神經(jīng)對(duì)脾臟免疫功能的調(diào)節(jié)，將有助于解釋銀屑病發(fā)病過程中系統(tǒng)性炎癥發(fā)生的機(jī)制，為進(jìn)一步闡明交感神經(jīng)系統(tǒng)在銀屑病中的調(diào)控作用提供新的理論依據(jù)，提示神經(jīng)系統(tǒng)將有望成為銀屑病治療的新靶點(diǎn)。