李媛媛，陳曉風(fēng)，楊小明，李奉楠

（1.鎮(zhèn)江市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心，江蘇鎮(zhèn)江 212004；2.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

銀杏（Ginkgo bilobaL.）為我國珍貴樹種，其葉、果具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。以銀杏葉提取物為原料生產(chǎn)的藥品或保健食品是目前世界上十大最暢銷植物類產(chǎn)品之一[1]。銀杏果實(shí)俗稱白果，新鮮白果常直接烹飪?yōu)椴穗?，大部分白果干燥后被加工成白果粉添加到糕點(diǎn)、飲料中[2]。銀杏的葉和果中除了含有黃酮和內(nèi)酯等活性成分外，還含有一類具有毒副作用的烷基酚酸類化合物——銀杏酸，在銀杏葉提取物生產(chǎn)和白果加工過程中被要求除去[2-4]。

銀杏酸（Ginkgolic acids）屬漆酚類物質(zhì)，為6-烷基或烯基水楊酸衍生物的同系混合物，由銀杏酸C13:0、C15:0、C15:1、C17:1、C17:2 五個(gè)同系物組成，其中以銀杏酸C15:1 含量最高[3]，銀杏酸C15:1（白果新酸）也是中國藥典銀杏酸同系物檢測中的定位對照品[5]。由于具有致敏毒性[4,6]，2020 年國家藥典規(guī)定銀杏酸在銀杏葉提取物中的含量不得超過5 ppm[5]。為此，各種方法被用于控制、降低銀杏制品中銀杏酸的含量，如水楊酸脫羧酶降解，可使銀杏酸降解率達(dá)到40%左右[7]；采用乳酸菌發(fā)酵白果汁，可減少其中70%的銀杏酸[8]；高溫?zé)岢炊虝r(shí)間就可明顯降低白果中銀杏酸含量[9]；水蒸氣和微波加熱可以減少白果中54.5%和27%的銀杏酸[10]。其中加熱法可以保持白果或銀杏葉的原始形態(tài)而應(yīng)用更為廣泛。研究銀杏酸的熱穩(wěn)定性和熱分解過程對白果和銀杏葉熱處理過程控制銀杏酸有重要的指導(dǎo)意義。本項(xiàng)目組前期研究了銀杏酸在水中的溶解性[11]及銀杏酸的光熱穩(wěn)定性[12]，發(fā)現(xiàn)銀杏酸固體在70 ℃加熱30 d，其在310 nm 處的吸收有較明顯降低，在250 ℃加熱30 min，可使銀杏酸脫羧生成銀杏酚[13]。但70 ℃條件下銀杏酸的降解產(chǎn)物是否為銀杏酚并沒有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，且有關(guān)銀杏酸單體的熱分解動力學(xué)國內(nèi)外尚未見報(bào)道。

熱重分析（TG）是在程序控溫條件下測量物質(zhì)質(zhì)量變化與溫度關(guān)系的一類方法，能夠快速準(zhǔn)確測定固體化合物的熔融、晶型轉(zhuǎn)變、分解等變化。本文擬采用高效液相色譜-電噴霧電離-質(zhì)譜（LC-ESI-MS）分析銀杏酸70 ℃加熱30 d 的降解產(chǎn)物，并在分離得到銀杏酸C15:1 單體基礎(chǔ)上，采用非等溫TG 法，研究其熱分解動力學(xué)，為銀杏制品熱加工過程中降低銀杏酸含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

銀杏酸同系混合物（簡稱銀杏酸） 從銀杏外種皮中分離得到，由銀杏酸C13:0（20.7%）、C15:0（3.3%）、C15:1（51.6%）、C17:1（21.1%）和C17:2（3.3%）組成，高效液相色譜（HPLC）純度98%，由本實(shí)驗(yàn)室自制，制備方法見參考文獻(xiàn)[13-14]，于4 ℃保存；甲醇（色譜級） Tedia 公司；娃哈哈純凈水 娃哈哈集團(tuán)有限公司；其它試劑皆為分析純 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Surveyor LCQ 液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用儀配備電噴霧離子源（ESI）、Thermo-Nicolet iS50 傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo 公司；HPLC 儀配有WK500 LC-500P 高壓泵、SPD-500 紫外檢測器、Welch Ultimate AQ-C18（21.2×250 mm，10 μm）制備柱、N2000 色譜工作站 杭州旭昱科技有限公司；Agilgent 1260 高效液相色譜儀 包括G1312C四元泵、G1322 脫氣、G1314B VWD、TC-C18column（150 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱 美國Agilent 公司；Shimp–pack VP-ODS（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱、UV-2450 紫外可見分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司；Netzsch STA449C 綜合熱分析儀 德國NETZSCH 公司；PH-050A 電動恒溫干燥箱 上海實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 銀杏酸的熱穩(wěn)定性分析 熱穩(wěn)定性參見文獻(xiàn)[13]，稱取銀杏酸50 mg 于小燒杯中封口膜封口后，于70 ℃烘箱中恒溫30 d 取出，LC-ESI-MS 分析。色譜條件：柱溫35 ℃，流動相為甲醇:1%乙酸（90:10，v/v），流量1.0 mL·min-1，二極管整列檢測器檢測波長為275 和310 nm。質(zhì)譜條件：電噴霧電離化（ESI）負(fù)離子模式，噴霧壓力1.4 MPa，鞘氣（N2）流量35 arb，輔助氣體流量5 arb，質(zhì)量掃描范圍50～1000 m/z。

1.2.2 銀杏酸C15:1 的制備及表征

1.2.2.1 銀杏酸C15:1 的制備 銀杏酸以四氫呋喃:甲醇（1:1，v/v）溶解，配成200 mg/mL 甲醇溶液，制備條件：柱溫40 ℃，流動相為甲醇-1%HAc 溶液（86:14，v/v），流速24 mL·min-1，紫外檢測波長300 nm，進(jìn)樣1 mL，分段收集第二個(gè)峰，分析HPLC 檢測峰純度（分析條件：柱溫40 ℃，流動相為甲醇-3%乙酸溶液（92:8，v/v），檢測波長310 nm；流速1 mL·min-1），合并單一組分餾分，濃縮至干后得銀杏酸C15:1。

1.2.2.2 紫外光譜及紅外光譜 銀杏酸C15:1 用甲醇溶解，紫外掃描范圍190～400 nm，測其紫外光譜。銀杏酸C15:1 以二氯甲烷為溶劑溶解，用毛細(xì)管滴加兩滴在壓好的KBr 壓片上面，待完全干燥后在400～4000 nm 范圍內(nèi)測其紅外光譜。

1.2.3 銀杏酸C15:1 熱重和差熱分析 稱取銀杏酸C5:1 5 mg 置于氧化鋁坩堝，在靜態(tài)空氣氣氛中，分別采用5.0、10.0、15.0 和20.0 ℃·min-1程序升溫速率（β）升溫，溫度范圍：室溫～600 ℃，α-Al2O3為參比，分別記錄熱重和差示掃描量熱曲線。

1.2.4 銀杏酸C15:1 脫羧的動力學(xué)分析條件 本研究采用Ozawa-Flynn-Wall（OFW）[15-18]、Friedman[17,19]和?atava-?esták[15,20]、Coats-Redfern 法[21-22]來分析銀杏酸C5:1 的第一步熱分解動力學(xué)。

OFW 法為積分法的一種，適用于升溫時(shí)試樣有質(zhì)量損失而有小分子釋放過程的數(shù)學(xué)處理，通常根據(jù)一組隨升溫速率提高而向高溫推移的熱重曲線計(jì)算，若反應(yīng)機(jī)制不變，將得到一組平行線[23]；Friedman 法為微分法的一種[17,19,23]，分別用于銀杏酸C15:1 過程表觀活化能的計(jì)算。

Ozawa-Flynn-Wall 公式[15-18]：

式中：α為失重率，%；β為升溫速率，K·min-1；T 為絕對溫度，K；A 為指前因子，min-1；E 為活化能，kJ·mol-1；R 摩爾氣體常數(shù)，8.314 J·K-1·mol-1；G（α）為積分反應(yīng)機(jī)理函數(shù)。對于G（α）來說，若α為定值，則G（α）也是固定的，因此lgβ與1/T 呈線性關(guān)系。以lgβ對1/T 作圖，由直線的斜率即可求出活化能E。

Friedman 法公式[17,19]：

式中：f（α）為微分反應(yīng)機(jī)理函數(shù)。以ln[（dα/dT）β]對1/T 作圖，即可得到一條直線，活化能E 可以通過直線的斜率求出。

因?atava-?esták 方程適合研究固相非定溫?zé)岱纸鈩恿W(xué)[22]，故采用?atava-?esták 方程和Coats-Redfern方程進(jìn)行銀杏酸C15:1 熱分解反應(yīng)動力學(xué)模型的推斷。

?atava- ?esták 方程的表達(dá)式為[15,20]：

式中：因?yàn)棣率枪潭ǖ?，lg（AE/Rβ）即是一個(gè)常數(shù)，以lgG（α ）對1/T 作圖，通過曲線的斜率和截距即可求得Es和A。

Coats-Redfern 方程的表達(dá)式為[21-22]：

式中：ln（AR/βE）即是一個(gè)常數(shù)，以ln[G（α）/T2]對1/T 作圖，通過曲線的斜率和截距即可求得E 和A。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏酸的熱穩(wěn)定性

將銀杏酸70 ℃加熱30 d 后的LC-ESI-MS 分析結(jié)果見圖1。圖1A～圖1B 最上一張圖為總離子流圖（TIC），其余皆為選擇離子流圖。由銀杏酸結(jié)構(gòu)式[3]，其五個(gè)同系物分子量M 分別為C13:0（320）、C15:1（346）、C17:2（372）、C15:0（348）和C17:1（374）；而銀杏酚分子量比銀杏酸少44。為了證實(shí)銀杏酸在70 ℃加熱后發(fā)生了脫羧反應(yīng)，采用系統(tǒng)提供的選擇離子檢測功能，分別選擇銀杏酸各單體分子離子峰[M-H]-的質(zhì)荷比（m/z）及[M-44-H]-的m/z 查找，銀杏酸的五個(gè)同系物及其脫羧產(chǎn)物的分子離子峰均找到，見圖1 上所標(biāo)注。推測銀杏酸在70 ℃加熱30 d 后310 nm 處紫外吸收降低是部分銀杏酸受熱脫羧生成銀杏酚所致[13]。為深入研究銀杏酸熱分解過程，分離出銀杏酸含量最高的C15:1 單體進(jìn)行熱重分析。

圖1 銀杏酸70 ℃加熱30 d 的總離子流色譜圖（TIC）和選擇離子流圖Fig.1 Chromatograms of total ion current and selected ion current of ginkgolic acids sample after heated 70 ℃ for 30 d

2.2 銀杏酸C15:1 的制備

銀杏酸的HPLC 制備譜圖見圖2，銀杏酸分析常在λ=310 nm 下進(jìn)行，考慮到制備色譜上樣量大，為兼顧上樣量和靈敏度，制備色譜波長選擇300 nm，流速24 mL·min-1時(shí)各組分分離效果較好，所有組分在100 min 內(nèi)全部出完。圖2 中第二個(gè)峰為銀杏酸C15:1，分段收集第二個(gè)峰餾分，HPLC 分析色譜檢測峰的單一性，合并單一銀杏酸C15:1 餾分，制備過程重復(fù)兩次，得到銀杏酸C15:1，為淺黃色固體，其HPLC 分析譜圖見圖3，HPLC 純度＞98%。

圖2 銀杏酸的制備色譜圖Fig.2 Preparative chromatogram of ginkgolic acids

圖3 銀杏酸C15:1 的分析譜圖Fig.3 Analysis chromatogram of ginkgolic acid C15:1

對所得銀杏酸C15:1 單體進(jìn)行紫外和紅外掃描，分別得到其紫外和紅外吸收光譜（圖4）。

圖4A 顯示出銀杏酸典型的紫外吸收光譜，在310 nm 處有最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13,24]。圖4B的紅外光譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24-25]一致，銀杏酸C15:1的酚羥基νO-H=3010、1305、710 cm-1分別為C-O 鍵（苯環(huán)上的C 與酚羥基上的O）的νC-O伸縮振動和δO-H面外彎曲振動。銀杏酸C15:1 中羧基的O-H 面內(nèi)彎曲振動δO-H和面外彎曲振動δO-H和νC=O分別出現(xiàn)在1211、900 和1647 cm-1[24]，而3005、1634、831 cm-1分別為雙鍵的ν=C-H、νC=C和δ=C-H，顯示雙鍵存在[22]。證實(shí)分離到的為銀杏酸C15:1 單體。

圖4 銀杏酸C15:1 的紫外光譜（A）和紅外光譜（B）Fig.4 UV spectrum (A) and FT-IR spectrum (B) of ginkgolic acid C15:1

2.3 銀杏酸C15:1 的熱重分析

銀杏酸C15:1 在不同升溫速率下所得的熱重（TG）曲線見圖5。由圖5可知，隨著升溫速率的增加，TG 曲線逐漸向高溫方向移動，即熱分解階段的溫度范圍發(fā)生了微小的變化，但是升溫速率的大小對樣品的失重率基本沒有影響。這是由于快速升溫導(dǎo)致了熱滯后現(xiàn)象，升溫速率越快，試樣的起始分解溫度和終止分解溫度也會隨升溫速率的增大而提高，從而使反應(yīng)曲線向高溫方向移動[23]。

圖5 銀杏酸C15:1 在不同升溫速率下的TG 曲線圖Fig.5 TG curves of ginkgolic acid C15:1 at different heating rate β

2.4 銀杏酸C15:1 的熱分解過程

圖6為升溫速率為10 ℃/min 時(shí)銀杏酸C15:1的熱重-差示掃描量熱-微商熱重（TG-DSC-DTG）曲線。由圖6 可見，DSC 曲線的第一個(gè)吸熱峰峰值為45.9 ℃，TG 無相應(yīng)失重，為銀杏酸C15:1 固體熔融峰，與銀杏酸C15:1 的熔點(diǎn)40～41 ℃接近[11]。銀杏酸C15:1 的TG 曲線存在三個(gè)顯著的失重臺階，第一步失重的起始溫度為86.5 ℃，這一階段的銀杏酸單體脫去了一個(gè)羧基分解成銀杏酚C15:1，失重率為14.37%（理論值為13.0%），DSC 曲線顯示一小吸熱峰，DTG 曲線上顯示最大失重速率，峰值243.0 ℃。銀杏酸熱穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)的LC-ESI-MS 分析顯示，銀杏酸70 ℃加熱30 d 可使銀杏酸脫羧轉(zhuǎn)化為銀杏酚，使其在310 nm 的紫外吸收略有減少[13]。受快速升溫?zé)釡笮?yīng)影響，圖6 中的銀杏酸C15:1 固體的熔融溫度和脫羧起始溫度都較其熔點(diǎn)和熱穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的分解溫度為高。王世霞等[26]研究苯甲酸脫羧反應(yīng)時(shí)同樣發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象，雖然苯甲酸脫羧反應(yīng)在170 ℃才能完成，但當(dāng)升溫到100 ℃時(shí)，其羧基拉曼譜峰已發(fā)生變化，顯示此時(shí)已經(jīng)發(fā)生脫羧反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)銀杏酸的脫羧反應(yīng)在其熱重分析記錄的失重起始溫度前已經(jīng)發(fā)生，因?yàn)榉磻?yīng)速率很小，容易被忽略。第二步失重的對應(yīng)著第三個(gè)明顯的吸熱峰，吸熱峰的峰值為273.0 ℃，這一階段銀杏酸C15:1 完成脫羧反應(yīng)，生成的銀杏酚C15:1 有可能烷基側(cè)鏈斷裂，形成部分聚合體，DTG 曲線呈現(xiàn)一小的臺階。溫度繼續(xù)升高發(fā)生第三步明顯失重，DTG 曲線在430～500 ℃之間呈現(xiàn)明顯的失重速率變化，DSC 曲線顯示一寬大的放熱峰，為完全氧化反應(yīng)。

圖6 銀杏酸C15:1 的TG-DSC-DTG（β=10 ℃·min-1）圖Fig.6 TG-DSC-DTG (β=10 ℃·min-1) curves of ginkgolic acid C15:1

銀杏酸的脫羧產(chǎn)物銀杏酚亦為銀杏中的活性成分，具有抗腫瘤活性[3]。Lepoittevn 等[6]采用豚鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)銀杏中的銀杏酸為強(qiáng)致敏源，而銀杏酚不引起過敏反應(yīng)。因此，在制備過程中通過第一步熱分解將銀杏酸轉(zhuǎn)化為銀杏酚，即可實(shí)現(xiàn)銀杏制品中銀杏酸毒性的脫除。由此，本文著重討論銀杏酸C15:1 的第一級熱分解反應(yīng)過程。

2.5 銀杏酸C15:1 熱分級機(jī)理分析

2.5.1 銀杏酸C15:1 第一級熱分解活化能E 求取依據(jù)OFW 法，在不同的轉(zhuǎn)化率α下以lnβ對1/T作圖，再用最小二乘法對曲線進(jìn)行線性擬合[27-28]，活化能E 即可通過曲線的斜率求得見圖7，計(jì)算結(jié)果列于表1 中。通過OFW 法計(jì)算出的銀杏酸C15:1 熱降解第一階段的平均活化能E 為67.50 kJ·mol-1。

表1 OFW 法和Friedman 法計(jì)算銀杏酸C15:1 熱降解過程的活化能Table 1 Activation energies of degradation process of ginkgolic acid C15:1 with OFW and Friedman methods

圖7 銀杏酸C15:1 的lnβ 比1/T 的曲線圖Fig.7 Curves of lnβ vs 1/T of ginkgolic acid C15:1

對于活化能的計(jì)算，除了利用OFW 法計(jì)算之外，還可通過Friedman 法推算，以ln[（dα/dT）β]對1/T 作圖，活化能E 即可通過曲線的斜率求得。Friedman 法計(jì)算的銀杏酸C15:1 熱降解第一階段的活化能曲線圖以及結(jié)果見圖8 和表1。由表1可知，通過Friedman 法計(jì)算出的銀杏酸C15:1 熱降解第一階段的平均活化能為67.38 kJ·mol-1，與OFW 的計(jì)算結(jié)果相近。從而得出銀杏酸C15:1 分解為銀杏酚C15:1 分解反應(yīng)的平均活化能

圖8 銀杏酸C15:1 ln[（dα/dT）β]比1/T 的曲線圖Fig.8 Curves of ln[（dα/dT）β] vs 1/T of ginkgolic acid C15:1

2.5.2 銀杏酸C15:1 熱分解最可機(jī)理函數(shù)的推斷將文獻(xiàn)[22]中常見的十幾種機(jī)理模型函數(shù)分別帶入?atava-?esták 方程和Coats-Redfern 方程中[29-30]，求出不同機(jī)理函數(shù)所對應(yīng)的動力學(xué)參數(shù)，僅以升溫速率為10 ℃/min 為例，計(jì)算結(jié)果列于表2 中。將這些模型函數(shù)計(jì)算出的Es值與OFW 法和Friedman 法計(jì)算出的活化能的平均值相比較，找出滿足的Es且相關(guān)系數(shù)大于0.99 的機(jī)理函數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)機(jī)理函數(shù)為G（α）=[-ln（1-α）]1/2時(shí)符合要求，?atava-?esták 法計(jì)算出的Es=72.56 kJ·mol-1，lgA=7.74 s-1，而Coats-Redfern法計(jì)算出的Es=68.50 kJ mol-1，lgA=7.06 s-1，其結(jié)果與OFW 法，F(xiàn)riedman 法的E 值較接近，相關(guān)系數(shù)數(shù)值較大。因此可以判斷，銀杏酸C15:1 熱分解第一階段最可能機(jī)理函數(shù)，即Avrami-Erofeev 方程，其非等溫?zé)峤到鈾C(jī)理為隨機(jī)成核和隨后生長，反應(yīng)級數(shù)n=1/2，其積分形式為G（α）=[-ln（1-α）]1/2，微分形式為f（α）=2（1-α）[-ln（1-α）]1/2。

表2 銀杏酸C15:1 熱降解過程的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters of the thermal degradation of ginkgolic acid C15:1

3 結(jié)論

根據(jù)熱分析，銀杏酸C15:1 在空氣中的熱分解為銀杏酸脫羧轉(zhuǎn)化為銀杏酚主分解階段和側(cè)鏈不飽和銀杏酚縮合，及銀杏酸的完全氧化三個(gè)階段，其中第一步熱分解使銀杏酸脫羧形成銀杏酚，消除了銀杏酸的毒性。分別用Ozawa-Flynn-Wall 法和Friedman法計(jì)算出銀杏酸C15:1 熱分解第一階段的活化能分別為67.4981、67.3762 kJ·mol-1。另外，根據(jù)?atava-?esták 方 程 和Coats-Redfern 方 程 推 斷 出 銀 杏 酸C15:1 熱降解反應(yīng)的動力學(xué)模型函數(shù)系A(chǔ)vrami-Erofeev 方程，其積分形式為G（α）=[-ln（1-α）]1/2，微分形式為f（α）=2（1-α）[-ln（1-α）]1/2，降解機(jī)理為隨機(jī)成核和隨后生長，反應(yīng)級數(shù)n=1/2。